吳海梅 趙真真 周永 薛楓 辛永寧 宣世英

[摘要] 目的 明確原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）病人咽漱液中EB病毒（EBV）的1/2分型及EBV核抗原1（EBNA1）基因的多態(tài)性分布。方法 采用PCR結(jié)合凝膠電泳鑒定54例PBC病人EBV感染和1/2分型情況。應(yīng)用PCR/測序的方法檢測54例PBC病人咽漱液中EBNA1基因的多態(tài)性。比較PBC病人和健康人群EBV 1/2分型及各基因變異類型的分布，并比較EBV不同亞型病人的臨床特征。結(jié)果 54例PBC病人EBV感染率為100%。PBC病人2型EBV感染率明顯高于健康人群（χ²=5.959，P=0.015，OR=2.782，95%CI=1.208～6.410）。在PBC病人咽漱液標(biāo)本中最多見的EBNA1亞型是P-thr變異型，其在PBC病人中所占的比例高于健康人群，差異具有顯著性（χ²=8.290，P=0.004，OR=3.253，95%CI=1.440～7.347）。EBV-2型PBC病人直接膽紅素異常升高比例顯著高于EBV-1型病人（χ²=9.714，P=0.002）。結(jié)論 2型EBV感染及P-thr變異型攜帶可能與PBC相關(guān)，2型EBV感染與PBC病人的直接膽紅素異常升高有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 皰疹病毒4型，人；肝硬化，膽汁性；抗原，核；多態(tài)性，單核苷酸

[中圖分類號] R575.22;R373.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2023）04-0513-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.109

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230912.0954.001;2023-09-13 17：13：39

VARIANTS OF EPSTEIN-BARR VIRUS IN THROAT WASHING OF PATIENTS WITH PRIMARY BILIARY CIRRHOSIS WU Haimei， ZHAO Zhenzhen， ZHOU Yong， XUE Feng， XIN Yongning， XUAN Shiying （Infection Disease Department of Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Nanjing Medical University， Qingdao 266071， China）＼; [ABSTRACT] Objective To investigate the type 1/2 variants of Epstein-Barr virus （EBV） and the polymorphism of the Epstein-Barr nuclear antigen 1 （EBNA1） gene in throat washing of patients with primary biliary cirrhosis （PBC）. Methods PCR and gel electrophoresis were used to identify EBV infection and the type 1/2 variants of EBV in 54 patients with PBC， and PCR and sequencing were used to detect the polymorphism of the EBNA1 gene in the throat washing samples of 54 PBC patients. The type 1/2 variants of EBV and the distribution of variants were compared between the PBC patients and the healthy population， and clinical features were compared between the patients with different subtypes of EBV. Results The 54 PBC patients had an EBV infection rate of 100%. The PBC patients had a significantly higher infection rate of type 2 EBV than the healthy population （OR=2.782， 95%CI=1.208-6.410， χ²=5.959，P=0.015）. P-thr variant was the most common subtype of EBNA1 in the samples of PBC patients， and the frequency of P-thr in PBC patients was significantly higher than that in the healthy population （OR=3.253， 95%CI=1.440-7.347， χ²=8.290，P=0.004）. Compared with the patients with EBV-1 type， the patients with EBV-2 type had a significantly higher proportion of patients with an abnormal increase in direct bilirubin （DBil） （χ²=9.714，P=0.002）. Conclusion Type 2 EBV infection and P-thr variant might be associated with PBC， and type 2 EBV infection is associated with the abnormal increase in DBil in patients with PBC.

[KEY WORDS] herpesvirus 4， human; liver cirrhosis， biliary; antigens， nuclear; polymorphism， single nucleotide

EB病毒（EBV）是皰疹病毒科嗜淋巴細(xì)胞屬成員，感染了世界上95%以上的人口，且與多種自身免疫性疾病有關(guān)^[1-3]。原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但該病本質(zhì)上是自身免疫性疾病^[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，PBC與EBV感染之間存在關(guān)聯(lián)^[5-7]。EBV相關(guān)疾病的分布具有明顯的地域差異，提示不同地區(qū)的EBV流行株可能有序列及生物學(xué)功能上的差異。EBV最常見的分型方式為基于EBV核抗原（EBNA）2、3A、3B及3C的抗原性及基因序列而區(qū)分的1/2分型。多數(shù)研究認(rèn)為，1/2分型具有地域相關(guān)性，也有研究顯示EBV-2型感染可能與鼻咽癌（NPC）發(fā)生有關(guān)^[8]。而基于EBNA1的基因序列，亦可以將其劃分為5種亞型：P-ala、P-thr、V-val、V-leu和V-pro。該分型方式同樣具有疾病特異性^[9]。本研究首次對PBC病人咽漱液中EBV進(jìn)行1/2分型檢測及EBNA1的多態(tài)性分析，旨在確定EBV的基因亞型與PBC疾病相關(guān)性。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本采集及DNA提取

收集青島市市立醫(yī)院及青島市第六人民醫(yī)院收治的54例PBC病人的咽漱液標(biāo)本，病人籍貫均為山東省并且長期居住在青島市。PBC診斷參照《原發(fā)性膽汁性膽管炎的診斷和治療共識（2021）》的標(biāo)準(zhǔn)^[10]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并自身免疫性肝炎、原發(fā)性硬化性膽管炎、IgG4相關(guān)性肝膽疾病等其他自身免疫性肝病的病人；②合并甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等嗜肝性病毒感染，或人免疫缺陷病毒、巨細(xì)胞病毒等非嗜肝性病毒感染的病人。健康人群咽漱液標(biāo)本均來自在山東省居住的健康成年人群。取30 mL無菌生理鹽水漱口1 min后采樣，標(biāo)本采集后采用江蘇康為世紀(jì)公司的通用式組織DNA抽提試劑盒抽提細(xì)胞DNA。

1.2 EBV 1/2分型檢測

參考SAMPLE等^[11]的報(bào)道設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增EBNA3C序列（表1）。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于含溴化乙錠的20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果。每次PCR反應(yīng)均用無酶雙蒸水作陰性對照。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考ZHAO等^[12]的文獻(xiàn)。

1.3 EBNA1基因序列多態(tài)性檢測

1.3.1 PCR擴(kuò)增 依據(jù)B95-8原型株序列，參考ZHAO等^[12]的報(bào)道設(shè)計(jì)擴(kuò)增EBNA1基因的引物，引物序列及PCR產(chǎn)物長度見表1。采用巢式PCR擴(kuò)增EBNA1 C-末端AA404-641（nt109159-109875）之間的序列，EBNA1-1、EBNA1-2為第1輪擴(kuò)增引物，EBNA1-3、EBNA1-4為第2輪擴(kuò)增引物。取第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL作為第2次PCR的模板，PCR反應(yīng)體系及條件參考相關(guān)文獻(xiàn)^[12]。每次PCR反應(yīng)均設(shè)水對照。取5 μL PCR產(chǎn)物置于15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳。

1.3.2 測序分析 取上述PCR產(chǎn)物25 μL送北京華大基因有限公司進(jìn)行測序，采用Snapgene軟件查看所獲序列峰圖文件，利用DNAStar軟件（Larsergene，version 7.0）進(jìn)行序列剪接和對比分析，并在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中與B95-8原型株（GenBank登錄號V01555）序列進(jìn)行對比分型。采用BHATIA等^[13]和GUTI?RREZ等^[14]的分類方法，以AA487為特征性AA，結(jié)合其他共有突變對序列將EBNA1基因分為P-ala、P-thr、V-val、V-leu和V-pro 5種亞型，將具有相同共有突變的序列歸為1種變異類型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)、精確概率法。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBV感染率與1/2分型

本文54例病人標(biāo)本中均檢出EBV感染，感染率為100%，其中1型EBV感染31例（57.4%），2型EBV感染19例（35.2%），1+2型EBV混合感染4例（7.4%）。圖1為部分標(biāo)本EBNA3C片段PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。健康人群EBV 1/2分型結(jié)果：1型EBV感染45例（45/57，78.9%），2型EBV感染10例（10/57，17.6%），1+2型混合感染2例（2/57，3.5%）^[15]。將1+2型EBV感染病人與2型EBV感染病人合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，PBC病人2型EBV感染率（23/54，42.6%）明顯高于健康人群（12/57，21.1%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ²=5.959，P=0.015，OR=2.782，95%CI=1.208～6.410）。

2.2 EBV 1/2分型與PBC病人臨床特征關(guān)系

EBV-2型病人直接膽紅素（DBil）異常升高比例顯著高于EBV-1型（χ²=9.714，P=0.002）；EBV-1型PBC病人與EBV-2型PBC病人之間性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）以及總膽紅素（TBil）、間接膽紅素（IBil）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）、總膽汁酸（TBA）等肝功能指標(biāo)比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。見表2。

2.3 EBNA1基因序列多態(tài)性

2.3.1 EBNA1 C端序列變異類型 本研究成功擴(kuò)增52例PBC病人的EBNA1片段，共檢出4種變異類型：P-ala、P-thr、V-val和V-leu。有5份PBC病人標(biāo)本在用Snapgene軟件查看峰圖序列時(shí)發(fā)現(xiàn)AA487等共有突變位點(diǎn)出現(xiàn)超過1種亞型的特征性突變，經(jīng)反復(fù)測試最后鑒定為混合感染。其中有2份標(biāo)本為P-thr+V-leu混合感染，1份標(biāo)本為V-val+P-thr混合感染，1份標(biāo)本為V-val+V-leu混合感染，1份標(biāo)本為P-thr+P-ala混合感染。

2.3.2 EBNA1亞型在PBC病人和健康人群中的分布 在PBC病人標(biāo)本中最多見的變異類型為P-thr變異型（27/52，51.9%），其次為V-val變異型（18/52，34.7%）。在健康人群中最多見的變異類型為V-val變異型（34/55，61.8%）^[15]。P-thr攜帶者（31/52，59.6%）在PBC病人中所占比例明顯高于健康人群（18/55，32.7%）（χ²=8.290，P=0.004，OR=3.253，95%CI=1.440～7.347）。見表3。

2.3.3 EBNA1亞型與1/2分型的關(guān)系 EBV-1型病人主要的EBNA1亞型為V-val和P-thr，共占96.2%（26/27），EBV-2型病人主要的EBNA1亞型為P-thr，占64.7%（11/17）。EBV-1型與EBV-2型PBC病人之間EBNA1亞型的分布差異無顯著性（χ²=3.858，P=0.277）。見表4。

2.3.4 EBNA1基因序列多態(tài)性與PBC病人臨床特征關(guān)系 P-thr、V-val 2種EBNA1亞型病人之間性別、年齡、BMI及肝功能指標(biāo)比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。見表5。

3 討論

PBC是一種慢性的自身免疫性疾病，其病因是免疫介導(dǎo)的小膽管進(jìn)行性破壞，其典型特征是血清中存在抗線粒體抗體。PBC病人的肝臟和唾液樣本中均存在EBV-DNA水平升高^[5-6]。MORSHED等^[6]研究結(jié)果顯示，有61%的PBC病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中EBV-DNA水平增加，而在健康對照組中僅有11%。BARZILAI等^[7]研究結(jié)果表明，PBC病人EBV早期抗原IgG滴度升高。以上研究均提示PBC的發(fā)生發(fā)展可能與EBV感染有關(guān)。

本研究共納入54例PBC病人，其EBV感染率為100%。全世界95%以上的健康成人攜帶EBV，最新的研究顯示，美國、巴西、墨西哥成年男性EBV平均感染率為97.3%^[16]。本研究所有PBC病人均感染EBV，這可能與本研究納入人群年齡較大，感染風(fēng)險(xiǎn)隨著年齡增長亦增高有關(guān)。

1型EBV是世界范圍內(nèi)的優(yōu)勢流行株，而2型EBV主要在非洲地區(qū)感染率較高^[17]。本研究PBC病人咽漱液標(biāo)本中2型EBV的檢出率明顯高于健康人群，提示2型EBV感染可能與PBC有關(guān)。在體外1型EBV比2型EBV更加容易轉(zhuǎn)化初始B淋巴細(xì)胞，而2型EBV由于細(xì)胞活化T細(xì)胞核因子（NFAT）c1/c2轉(zhuǎn)錄因子活性的增加以及EBV即刻早期蛋白（BZLF1）啟動(dòng)子Zp-V3的普遍存在導(dǎo)致受感染B細(xì)胞有更高的裂解能力^[18-19]。有人推測2型EBV可能在免疫系統(tǒng)紊亂病人中更常見^[17]。這提示EBV-2型與免疫功能有關(guān)，也部分解釋了PBC病人中EBV-2型感染比例更高的原因。

V-val型是北方地區(qū)最多見的EBNA1變異類型。而本研究PBC病人中所占比例最高的則是P-thr型，且PBC病人P-thr型所占比例顯著高于健康人群。有研究結(jié)果表明，V-val變異型EBNA1比B95-8原始株有更高的轉(zhuǎn)錄活性以及維持宿主細(xì)胞存活的能力，且來自不同地域的EBV相關(guān)胃癌（EBVaGC，日本和美國）及NPC（中國北方）的結(jié)果均顯示V-val為EBNA1主要亞型^[9]。提示PBC病人的P-thr分型比例增高具有疾病特異性，P-thr亞型可能與PBC具有相關(guān)性。EBV表位的分子擬態(tài)導(dǎo)致對自身抗原的耐受性喪失以及表位傳播可能是EBV導(dǎo)致自身免疫疾病發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制之一^[20]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，用EBNA1 DNA免疫不僅可以產(chǎn)生抗EBNA1抗體，還可以產(chǎn)生自身抗體并導(dǎo)致狼瘡樣自身免疫性疾病^[21]。EBNA1蛋白功能區(qū)域如DNA結(jié)合-二聚化部位（AA452-607）、轉(zhuǎn)錄激活部位（AA325-376、AA65-89）、USP7結(jié)合部位（AA442-459）等均位于C-末端^[22]，因此EBNA1 C端的突變可能對其功能產(chǎn)生影響。例如有研究發(fā)現(xiàn)，EBNA1 DNA結(jié)合域的氨基酸改變導(dǎo)致NPC細(xì)胞中DNA的復(fù)制能力受損，EBNA1的AA325-376缺失可以影響其轉(zhuǎn)錄激活的功能^[23]。故推測EBNA1序列多態(tài)性可能通過改變病毒DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等功能參與疾病發(fā)生發(fā)展^[24]。EBNA1在誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)等方面具有重要作用，而P-thr亞型中大多數(shù)突變位點(diǎn)位于功能區(qū)域，今后需對該亞型繼續(xù)深入研究，進(jìn)一步闡明其在PBC發(fā)生發(fā)展過程中的作用與機(jī)制。

EBV-2型PBC病人DBil異常升高比例顯著高于EBV-1型病人，而EBV-1型與EBV-2型PBC病人之間性別、年齡、BMI和除外DBil的肝功能指標(biāo)差異均無顯著性。機(jī)體膽紅素濃度升高可以抑制細(xì)胞核因子κB（NF-κB）信號通路激活，從而誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)和加重炎癥反應(yīng)，并可以引起脂質(zhì)過氧化損傷^[25]。DBil為PBC病人臨床治療中常用的反映肝功能的指標(biāo)，其異常升高與病人臨床癥狀及預(yù)后有關(guān)^[10，26]。因此我們認(rèn)為，EBV-2型感染與PBC病人的肝損傷有關(guān)，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上，2型EBV感染及P-thr變異型攜帶可能與PBC相關(guān)，2型EBV感染與PBC病人的DBil異常升高有關(guān)。由于PBC患病率較低，標(biāo)本較難收集，盡管滿足統(tǒng)計(jì)需求，但本研究納入樣本例數(shù)仍較少，后續(xù)尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 馬偉平）