張颯颯 魯葉慧 熊翌宏 楊珊珊 吳媛 彭旭東

[摘要] 目的 探討阿魏酸（FA）在煙曲霉菌誘導的人角膜上皮細胞中的抗炎作用。方法 采用CCK-8方法檢測不同濃度FA（0、50、100、150、200、250、300 μmol/L）溶液對人角膜上皮細胞（HCEC）活力的影響；采用RT-PCR方法檢測滅活的煙曲霉菌菌絲感染HCEC后，F(xiàn)A對炎癥因子白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）及核因子E2相關因子2（Nrf2）mRNA表達的影響；采用ELISA方法檢測FA對炎癥因子IL-6及單核細胞趨化蛋白（MCP-1）蛋白表達的影響。結(jié)果 300 μmol/L的FA溶液處理組HCEC存活率低于其他各組（F=5.390，P<0.05），250 μmol/L及以下濃度FA溶液處理對HCEC活力無影響（P>0.05）。250 μmol/L FA處理可顯著升高Nrf2 mRNA表達，降低IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達水平，并顯著降低IL-6及MCP-1蛋白表達（F=4.720～990.967，P<0.05）。結(jié)論 FA可能通過上調(diào)Nrf2的表達，抑制煙曲霉菌誘導的HCEC炎癥反應中促炎因子的表達，發(fā)揮抗炎作用。

[關鍵詞] 阿魏酸；煙曲霉菌；人角膜上皮細胞；炎癥

[中圖分類號] R77

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2023）04-0485-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.123

[網(wǎng)絡出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230921.1444.003;2023-09-22 12：27：19

ANTI-INFLAMMATORY EFFECT OF FERULIC ACID IN HUMAN CORNEAL EPITHELIAL CELLS INDUCED BY ASPERGILLUS FUMIGATUS ZHANG Sasa， LU Yehui， XIONG Yihong， YANG Shanshan， WU Yuan， PENG Xudong （Department of Ophthalmology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）＼; [ABSTRACT] Objective Toinvestigatethe anti-inflammatory effect of ferulic acid （FA） in human corneal epithelial cells induced by Aspergillus fumigatus. Methods CCK-8 assay was used to observe the effect of different concentrations of FA solution （0， 50， 100， 150， 200， 250， 300 μmol/L） on the viability of human corneal epithelial cells （HCEC）; RT-PCR was used to measure the effect of FA on the mRNA expression levels of the inflammatory factors interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α（TNF-α）， and nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2） after HCEC were infected with inactivated Aspergillus fumigatushyphae; ELISA was used to observethe effect of FA on the protein expression levels of the inflammatory factors IL-6 and monocyte chemotactic protein-1 （MCP-1）. Results The group of HCEC cells treated by 300 μmol/L FA solution had a significantly lower cell viabilitythan the other groups （F=5.390，P<0.05）， and FA solution with a concentration of 250 μmol/L or less had no effect on the viability of HCEC （P>0.05）. Treatment with 250 μmol/L FA significantly increased the mRNA expression levelof Nrf2 and significantly reduced the mRNA expression levels of IL-1β， IL-6， TNF-α， and the protein expression level of MCP-1 （F=4.720-990.967，P<0.05）. Conclusion FA may exert an anti-inflammatory effect by upregulating the expression of Nrf2 and inhibiting the expression of pro-inflammatory factors in the inflammatory response of HCEC induced by Aspergillus fumigatus.

[KEY WORDS] ferulic acid; Aspergillus fumigatus; human corneal epithelial cells; inflammation

煙曲霉菌是一種常見的真菌性角膜炎的致病真菌^[1]，可黏附于角膜上皮從而免于宿主的免疫清除^[1-2]。真菌感染時，各種免疫細胞在真菌清除方面發(fā)揮重要防御作用^[3-4]；但是其引發(fā)的過度炎癥反應會加重組織損傷^[5-6]。目前臨床除了常用藥物外^[7]，還需要尋找安全高效的抗炎藥物實現(xiàn)抗真菌聯(lián)合免疫治療。阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸， FA）是一種酚類化合物，可溶于二甲基亞砜（DMSO），它具有抗炎^[8-9]、抗氧化^[10]、肝臟保護^[11]等功效。LAMPIASI等^[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A在脂多糖（LPS）刺激的小鼠RAW264.7細胞中發(fā)揮抗炎作用。最近CAO等^[8]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A可降低促炎因子表達，改善肝損傷的預后，在乙醇性肝損傷中起保護作用^[13]。本研究旨在探討FA在煙曲霉菌誘導的炎癥中的抗炎作用，為真菌性角膜炎的治療提供新思路?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人角膜上皮細胞（HCEC）由廈門眼科實驗室饋贈，將其接種到10 cm細胞培養(yǎng)皿中，在含有體積分數(shù)0.10 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37 ℃，含體積分數(shù)0.05 CO₂培養(yǎng)箱）。煙曲霉菌（CPCC 3.0772）購自中國微生物菌種保藏中心（SGMCC）；FA（100 mg，純度98%）由麥克林試劑公司提供，用體積分數(shù)0.001的DMSO溶解后以100 mmol/L儲備液存放于-80 ℃；RNAex pro reagent裂解液由艾科瑞生物公司提供；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒由Biolegend公司提供；HiScript Ⅲ RT SuperMix（南京諾唯贊生物公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 煙曲霉菌絲制備 將煙曲霉菌接種到沙氏液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48～72 h（37 ℃，含體積分數(shù)0.05 CO₂培養(yǎng)箱），待培養(yǎng)基中覆蓋白色絨毛團塊狀菌落，將菌落轉(zhuǎn)移至玻璃研磨棒中研磨至勻漿狀態(tài)，加入體積分數(shù)0.75乙醇滅活（4 ℃，48 h）后得到滅活煙曲霉菌絲，使用血細胞計數(shù)器計數(shù)并調(diào)整菌絲濃度至1×10¹¹CFU/L后用于體外細胞實驗。

1.2.2 FA溶液制備 用無菌PBS將FA溶液稀釋至實驗需要濃度（0～300 μmol/L）用于后續(xù)實驗，F(xiàn)A溶液中DMSO含量低于1‰。

1.2.3 CCK-8細胞毒性實驗檢測HCEC存活率96孔板中加入HCEC，達到80%融合時，向細胞中加入新的DMEM細胞培養(yǎng)液或含不同濃度FA（0～300 μmol/L）的DMEM細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h（37 ℃，含體積分數(shù)0.05 CO₂培養(yǎng)箱），棄去培養(yǎng)液并加入PBS洗去懸浮細胞及藥物殘留。向96孔板中分別加入100 μL的DMEM細胞培養(yǎng)液和10 μL CCK-8檢測試劑，37 ℃孵育2 h。使用酶標儀檢測各孔450、600 nm波長處吸光度并計算細胞存活率。

1.2.4 實時聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測HCEC中炎癥因子及核因子E2相關因子2（Nrf2）mRNA表達 將細胞加入12孔板或96孔板，隨機分為空白對照組（A組）、單純FA處理組（B組）、單純加菌處理組（C組）和加菌+FA處理組（D組），向HCEC加或不加FA（終濃度250 μmol/L）預處理2 h，并向每孔中加入滅活煙曲霉菌菌絲（1×10¹¹CFU/L）60 μL培養(yǎng)24 h（37 ℃，含體積分數(shù)0.05 CO₂培養(yǎng)箱）。吸棄培養(yǎng)液并加入PBS洗滌3次，各孔中加入500 μL RNAex pro reagent裂解液，充分研磨并轉(zhuǎn)移入EP管中提取總RNA。采用RNA紫外線可見光度法（Nanodrop 2000，Thermo Fisher）測定總RNA濃度，應用HiScript Ⅲ RT SuperMix處理RNA樣本并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)產(chǎn)品說明書方法向cDNA樣本中加入DEPC水和SYBR預混液，進行RT-PCR分析（QuantStudio^TM5 實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)，Thermo Fisher）。RT-PCR的引物及其序列見表1。

1.2.5 ELISA法檢測HCEC炎癥因子IL-6及單核細胞趨化蛋白（MCP-1）蛋白表達水平 根據(jù)1.2.4方法將HCEC分組并處理，4 ℃、5 000 r/min離心后取上清液并轉(zhuǎn)入新的EP管中，應用ELISA試劑盒采用雙抗體夾心法檢測各組IL-6和MCP-1蛋白表達水平，按試劑盒說明進行操作。酶標儀檢測450 nm及570 nm波長處吸光度，以其表示IL-6和MCP-1蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用Graph Pad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料結(jié)果采用±s表示，多組比較采用單因素方差分析（組間兩兩比較采用Bonferroni法）及雙因素析因設計方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度FA溶液對HCEC活力的影響

不同濃度的FA（0、50、100、150、200、250及300 μmol/L）與HCEC共孵育24 h后，300 μmol/L FA溶液處理組HCEC存活率低于其他各組，差異均有統(tǒng)計學意義（n=6，F(xiàn)=5.390，P<0.05）。250 μmol/L及以下濃度FA溶液處理組的HCEC存活率與正常對照組（N組）相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。后續(xù)實驗選擇250 μmol/L作為研究濃度。

2.2 FA對煙曲霉菌誘導的HCEC炎癥因子以及Nrf2 mRNA表達的影響

RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)A處理（F_FA=7.195～18.560，P<0.01）、滅活菌絲處理（F_AF=23.130～141.468，P<0.001）、FA與滅活菌絲處理產(chǎn)生的交互效應（F_FA×AF=8.731～18.536，P<0.01）對HCEC炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA表達的影響均有統(tǒng)計學意義。單獨效應結(jié)果顯示，不用滅活菌絲處理時，F(xiàn)A處理和不處理對mRNA的表達均無影響（P>0.05）；用滅活菌絲處理時，F(xiàn)A處理組的IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA表達較不處理組明顯降低（F=15.889～47.471，P<0.001）。不用FA處理時，滅活菌絲處理和不處理對IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA表達的影響均有統(tǒng)計學意義（F=30.141～94.603，P<0.001）；用FA處理時，滅活菌絲處理和不處理相比，各因子mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（F=4.720～23.860，P<0.05）。雙因素析因方差分析還顯示，F(xiàn)A處理（F_FA=4.860，P<0.05）及滅活菌絲處理（F_AF=37.652，P<0.05）對Nrf2 mRNA表達影響有統(tǒng)計學意義；但FA與滅活菌絲處理無交互效應（F_FA×AF=2.757，P>0.05）。見表2。

2.3 FA對煙曲霉菌誘導的HCEC中IL-6以及MCP-1蛋白表達的影響

ELISA方法檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)A處理（F_FA=299.155、388.573，P<0.01）、滅活菌絲處理（F_AF=421.591、809.406，P<0.01）、FA與滅活菌絲處理產(chǎn)生的交互效應（F_FA×AF=258.206、298.778，P<0.01）對IL-6及MCP-1蛋白表達的影響均有統(tǒng)計學意義。單獨效應結(jié)果顯示，不用滅活菌絲處理時，F(xiàn)A處理和不處理對IL-6及MCP-1蛋白的表達均無影響（P>0.05）；用滅活菌絲處理時，F(xiàn)A處理較不處理IL-6及MCP-1蛋白表達均明顯降低（F=556.608、684.406，P<0.01）。不用FA處理時，滅活菌絲處理和不處理對IL-6及MCP-1蛋白表達的影響差異均有顯著性（F=715.097、990.964，P<0.01）；用FA處理時，滅活菌絲處理和不處理相比，IL-6及MCP-1蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（F=5.273、76.648，P<0.05）。見表3。

3 討論

真菌性角膜炎是導致病人眼部潰瘍、穿孔甚至失明的一種嚴重的眼部感染性疾病^[14]。在亞洲發(fā)展中國家的真菌感染中，絲狀真菌感染占據(jù)主導地位^[15]。植物性角膜損傷、角膜接觸鏡的使用及局部類固醇的使用已被公認為真菌性角膜炎的主要危險因素^[15]。真菌侵入宿主角膜組織后，真菌細胞壁上的病原體相關分子模式受體通過釋放毒素攻擊受損的角膜組織，并被宿主先天免疫細胞表達的模式識別受體識別^[16]。這一相互作用誘導細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生及釋放^[17]，并招募中性粒細胞及巨噬細胞向感染灶聚集^[18]，真菌釋放的細胞毒性物質(zhì)及免疫細胞聚集引發(fā)的過度炎癥反應使得真菌性角膜炎潰瘍愈合緩慢、預后不良。真菌性角膜炎的發(fā)病率逐年增高，亟待找到新的治療藥物。

FA為從當歸、川芎、赤芍等中草藥中提取的一種酚酸類化合物，相關研究發(fā)現(xiàn)它具有抗氧化^[19]、抗炎^[20]、抗凋亡^[9]、抗菌^[21]、心肌保護^[22]及神經(jīng)保護^[23]等藥理作用。ERMIS等^[24]研究發(fā)現(xiàn)，在吲哚美辛誘導的大鼠胃潰瘍模型中，F(xiàn)A通過抑制中性粒細胞浸潤及降低炎癥因子IL-6及TNFα的表達，減輕胃黏膜充血、出血及潰瘍的嚴重程度，從而改善大鼠胃潰瘍的預后。而FA在真菌性角膜炎中的作用尚未見報道。本文研究結(jié)果顯示，250 μmol/L FA對HCEC的活性沒有影響，因此250 μmol/L FA可作為安全濃度用于后續(xù)實驗。

真菌性角膜炎早期通過招募固有免疫細胞產(chǎn)生炎癥反應，發(fā)揮對真菌的清除作用，但持續(xù)的炎癥反應會加重組織的損傷^[25]。中性粒細胞等免疫細胞的持續(xù)激活和招募會進一步導致更多的炎癥因子及趨化因子的產(chǎn)生和釋放^[26]，這不利于真菌性角膜炎的預后。本文RT-PCR檢測結(jié)果表明，加菌刺激組炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA表達顯著，即在真菌感染早期炎癥因子如IL-1β、IL-6及TNF-α等表達增加，從而誘導炎癥細胞的浸潤及釋放多種炎癥遞質(zhì)進一步放大炎癥反應來抵御真菌；而加菌處理后給予FA治療可以顯著抑制HCEC中IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA的表達，從而減輕相關炎癥反應。LI等^[27]研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導的人HMC3小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)炎癥模型中，F(xiàn)A通過抑制IL-1β、TNF-α及一氧化氮的產(chǎn)生及表達發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥作用。本文研究結(jié)果與其相一致。為了進一步確認FA在煙曲霉菌刺激的HCEC中的抗炎作用，本研究應用ELISA方法檢測IL-6及MCP-1蛋白表達，結(jié)果顯示，250 μmol/L的FA能夠顯著抑制煙曲霉菌刺激的HCEC炎癥反應中IL-6及MCP-1蛋白表達上調(diào)。有研究顯示，在乙醇誘導的C57BL/6小鼠肝損傷模型中，F(xiàn)A可以顯著降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的血清酶活性，減少乙醇刺激后小鼠肝臟細胞細胞質(zhì)的空泡性壞死及炎癥細胞的浸潤，抑制MCP-1和IL-6的表達，減輕乙醇對小鼠肝臟的損害^[13]。本文研究結(jié)果與其相一致。提示FA可以通過下調(diào)真菌性角膜炎炎癥因子及趨化因子的過度表達來改善真菌性角膜炎的炎癥反應。

在真菌性角膜炎病程中，在控制真菌感染后期炎癥反應的同時可以著力促進角膜上皮的修復，從而改善真菌性角膜炎的預后。已有研究顯示，Nrf2不僅可以抑制促炎因子及炎癥標志物的過表達，還可以通過與血紅素氧合酶（HO-1）啟動子抗氧化反應元件結(jié)合上調(diào)HO-1的表達，從而進一步抑制促炎因子的過表達，提示Nrf2/HO-1信號通路在炎癥反應中發(fā)揮負調(diào)控作用^[28-29]。我們實驗室早先的研究發(fā)現(xiàn)，萜類化合物紫蘇醛、衣康酸二甲酯及沒食子酸可通過增加Nrf2和HO-1的表達，抑制IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α等炎癥因子的表達，在真菌性角膜炎中發(fā)揮強大的抑炎作用^[26，30]。而FAN等^[26]的研究結(jié)果顯示，紫蘇醛通過Nrf2/HO-1信號通路下調(diào)IL-1β、IL-6及TNF-α的表達水平從而發(fā)揮強大的抗炎作用。其研究還發(fā)現(xiàn)，在煙曲霉菌感染的早期Nrf2表達水平上調(diào)，參與煙曲霉菌感染的免疫應答，且Nrf2/HO-1信號通路可通過抑制下游炎癥因子的表達水平發(fā)揮抗炎作用。本文研究結(jié)果顯示，單純加菌處理組Nrf2 mRNA的表達增加，而加菌加FA處理組Nrf2 mRNA表達相較于單純加菌處理組顯著上調(diào)。由此我們認為，在煙曲霉菌刺激的HCEC中，F(xiàn)A通過增加Nrf2的表達水平發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，F(xiàn)A能夠通過增強Nrf2的表達和調(diào)控炎癥因子及趨化因子的表達，減輕煙曲霉菌感染后HCEC的炎癥反應。以后的研究可能傾向于探討FA在體內(nèi)外煙曲霉菌感染模型中發(fā)揮抗炎作用的多種機制，以期推進FA用于真菌性角膜炎治療的臨床研究。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）