朱文欣 趙芷慧 黃永華 程錦生 陳 威 李 錚

(1 上海交通大學(xué)機(jī)械與動(dòng)力工程學(xué)院 上海 200240;2 上海東富龍醫(yī)療裝備有限公司 上海 201108;3 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿中心男科 上海 200080)

細(xì)胞療法被認(rèn)為是未來(lái)醫(yī)學(xué)的三大支柱之一,生物樣本將成為重要戰(zhàn)略資源[1]。由于生物的活性在低溫環(huán)境中受到抑制,代謝等化學(xué)反應(yīng)減慢近乎停滯[2-3],使細(xì)胞等生物長(zhǎng)期凍存成為可能[4]。然而,冷凍過(guò)程溫跨大,造成細(xì)胞等生物在冷凍過(guò)程中產(chǎn)生不可逆損傷,如氧化性損傷、滲透性損傷和機(jī)械損傷等[5-6]。

為減少冷凍損傷,多種冷凍方法在細(xì)胞等生物樣本凍存領(lǐng)域獲得應(yīng)用[7],如直接接觸液氮冷卻法[8]、環(huán)網(wǎng)狀冷凍法[9]、微流控冷凍法[10]等。然而上述方法均易造成樣品受熱不均、回收困難并存在樣品污染的風(fēng)險(xiǎn)。而固體表面玻璃化冷凍法(solid surface vitrification,SSV)由于降溫速率快、降溫速率控制性好、樣品不直接與液氮接觸、易回收、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn),被越來(lái)越多地應(yīng)用于低溫生物凍存[11-12]。目前,針對(duì)SSV方法的研究多數(shù)為實(shí)驗(yàn)或經(jīng)驗(yàn)性報(bào)道[13-14],主要聚焦于降溫速率的大小,對(duì)于SSV方法在凍存過(guò)程中造成的冷凍樣品結(jié)晶機(jī)理與結(jié)晶度變化規(guī)律鮮有涉及。此外,由于凍存過(guò)程時(shí)間短,通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段以高時(shí)間分辨率獲得全冷凍過(guò)程樣品全域溫度、結(jié)晶度變化仍較為困難,如采用熱電偶測(cè)溫不僅侵入性大、易結(jié)露、漏熱嚴(yán)重,而且無(wú)法測(cè)量結(jié)晶度;低溫顯微系統(tǒng)價(jià)格昂貴且無(wú)法定量分析冷凍過(guò)程的結(jié)晶變化[15]等。

鑒于此,本文采用數(shù)值計(jì)算方法探究SSV方法實(shí)現(xiàn)快速降溫的核心要素,并通過(guò)建立凍存過(guò)程的非等溫結(jié)晶預(yù)測(cè)模型,研究預(yù)冷溫度、樣品體積及形狀對(duì)冷凍結(jié)晶效果的影響,為冷凍方法優(yōu)化、冷凍對(duì)象體積形狀等設(shè)計(jì)提供理論指導(dǎo)。

1 基于非等溫結(jié)晶模型的SSV方法建模

SSV方法采用一定質(zhì)量的高導(dǎo)熱金屬(銅、銀或鋁合金)塊或片浸入液氮或其他低溫介質(zhì)預(yù)冷,將樣品滴在預(yù)冷后的低溫表面,通過(guò)瞬間接觸導(dǎo)熱實(shí)現(xiàn)快速降溫冷凍,物理過(guò)程如圖1所示。

圖1 SSV方法工作原理

聚焦液滴碰觸金屬表面之后的傳熱過(guò)程,建立如圖2所示的數(shù)學(xué)物理模型。鑒于軸對(duì)稱性,該模型采用二維軸對(duì)稱形式,取一半,其中左上角凸出部分為液滴,其余長(zhǎng)方形區(qū)域?yàn)榻饘倩纵d冷臺(tái)。以5 μL液體冷凍為例,真實(shí)滴落液滴的幾何尺寸可以近似為半徑1.82 mm,中心高度為0.89 mm的球冠,液滴的底部與金屬塊的上表面直接接觸。此處考慮無(wú)氧銅材質(zhì)的基底載冷臺(tái),其導(dǎo)熱系數(shù)在低溫下達(dá)400 W/(m·K)。為了消除邊緣效應(yīng),取銅塊的寬度為50 mm,高度為20 mm,此時(shí)相對(duì)液滴而言,可以認(rèn)為銅塊無(wú)限大。

圖2 數(shù)學(xué)物理模型和邊界條件

基于傅里葉導(dǎo)熱定律,金屬塊內(nèi)的導(dǎo)熱可表示為:

(1)

式中:T為溫度,K;ρ為密度,kg/m3;λ為導(dǎo)熱系數(shù),W/(m·K);cp為比定壓熱容,J/(kg·K);t為時(shí)間,s。

(2)

(3)

式中:L為熔融潛熱,kJ/mol;X為結(jié)晶度。忽略結(jié)晶界面處由于分子擴(kuò)散對(duì)冰晶前沿生長(zhǎng)速率的影響,根據(jù)半經(jīng)驗(yàn)非等溫結(jié)晶模型[16-20]:

(4)

式中:Tm為熔融溫度,K;k1為結(jié)晶常數(shù),與液體種類(lèi)、質(zhì)量濃度相關(guān);Q為活化能,kJ/mol;R為氣體常數(shù)8.314 J/(mol·K)。

由于實(shí)際采用的拋光銅表面粗糙度Ra為0.8,視作光滑表面條件,且該銅表面與液滴直接接觸,因此在進(jìn)行建模時(shí)忽略了金屬塊與液滴樣品間的接觸熱阻:

TS=TC

(5)

(6)

在邊界條件方面,將金屬塊與液氮接觸邊界設(shè)為第一類(lèi)邊界條件,由于金屬塊與液氮蒸氣對(duì)流換熱,因此其他邊界設(shè)為第三類(lèi)邊界條件,對(duì)流換熱表面?zhèn)鳠嵯禂?shù)h取為100 W/(m2·K)[21]。

在熱物性方面,銅塊選用常物性參數(shù),如表1所示。

表1 固體材料熱物性參數(shù)

需要說(shuō)明的是,該模型側(cè)重于了解被冷凍液滴所經(jīng)歷的傳熱過(guò)程,并實(shí)現(xiàn)與系統(tǒng)的傳質(zhì)過(guò)程解耦,其分析尺度大于冰晶生長(zhǎng)的微結(jié)構(gòu),且不包含溶液傳質(zhì)濃度變化對(duì)冰晶微結(jié)構(gòu)的影響。

在COMSOL軟件中,模型劃分自由三角形網(wǎng)格,在樣品與預(yù)冷表面接觸處做細(xì)化處理,共劃分了1 500、2 500、3 035、4 000四種密度的網(wǎng)格,網(wǎng)格平均質(zhì)量均優(yōu)于0.93。經(jīng)網(wǎng)格無(wú)關(guān)性驗(yàn)證,取3 035個(gè)網(wǎng)格進(jìn)行計(jì)算在速度和精度方面均滿足要求。對(duì)金屬塊用固體傳熱接口求解,對(duì)CPA液滴利用導(dǎo)熱接口添加廣義熱源項(xiàng),通過(guò)域常微分和微分代數(shù)方程接口定義非等溫結(jié)晶源項(xiàng),并耦合求解。添加溫度判據(jù)以保證結(jié)晶在熔融溫度下才發(fā)生。為保證對(duì)極其微小量數(shù)值計(jì)算正常,將結(jié)晶度初始值設(shè)為1×10-16(可識(shí)別的接近0的最小正值)。采用瞬態(tài)求解器,向后差分方法,時(shí)間步長(zhǎng)不超過(guò)0.01 s,相對(duì)容差控制為1×10-6。

采用文獻(xiàn)[22]的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證模型的適用性,針對(duì)西林瓶(類(lèi)薄層式SSV結(jié)構(gòu))中1.9 mL甘油水溶液置于液氮中冷凍過(guò)程溫度變化進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證。需要說(shuō)明的是,驗(yàn)證時(shí)模型中固體材料選用玻璃,溶液選用甘油水溶液,與文獻(xiàn)[22]的實(shí)驗(yàn)保持一致。預(yù)測(cè)結(jié)果和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比如圖3所示。由圖3可知,耦合非等溫結(jié)晶源項(xiàng)的傳熱區(qū)域模型可以較好地預(yù)測(cè)冷凍過(guò)程,最大誤差約為10%,平均誤差小于2%。后期溫度略高于實(shí)驗(yàn)值,可能是由于被測(cè)樣品溶液的導(dǎo)熱系數(shù)在低溫時(shí)有所升高。

圖3 模型計(jì)算值與文獻(xiàn)[22]實(shí)驗(yàn)值對(duì)比

2 計(jì)算結(jié)果與分析

模型驗(yàn)證采用的實(shí)驗(yàn)樣本液滴為生物細(xì)胞冷凍操作常用的冷凍保護(hù)劑(CPA)丙二醇溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%),其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg為160 K,冷凍結(jié)晶的危險(xiǎn)溫區(qū)介于Tg與熔化溫度Tm之間(160～255.5 K)。由于CPA物性參數(shù)通常缺乏低溫區(qū)的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù),采用常溫區(qū)參數(shù)一般會(huì)低估物性參數(shù)的變化;而若采用水和冰的物性參數(shù)替代低溫保護(hù)劑物性參數(shù),會(huì)高估低溫區(qū)物性參數(shù)的變化。在沒(méi)有準(zhǔn)確合適的物性參數(shù)數(shù)據(jù)時(shí),有必要假設(shè)物性參數(shù)不隨溫度變化來(lái)參考計(jì)算[23]。一般而言,隨著溫度的降低,CPA導(dǎo)熱系數(shù)增加,而比熱容和密度降低,總體上熱擴(kuò)散系數(shù)增加。因此利用常物性參數(shù)計(jì)算可能會(huì)低估冷卻速率,即實(shí)際降溫效果優(yōu)于計(jì)算值。樣品液滴(丙二醇溶液)物性參數(shù)來(lái)源于文獻(xiàn)[24-25],如表2所示。利用上述模型和物性參數(shù),開(kāi)展被冷凍樣品滴落后的冷卻和結(jié)晶特性研究。

表2 冷凍液滴熱物性參數(shù)

2.1 非等溫結(jié)晶特性

首先從液滴對(duì)稱軸的高、中、低三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行局部降溫結(jié)晶特性分析,如圖4所示。三個(gè)位點(diǎn)的冷凍降溫過(guò)程均未呈現(xiàn)溫度平臺(tái)期,無(wú)明顯的一級(jí)相變特征。由于低點(diǎn)最接近預(yù)冷表面,傳熱路徑短、熱阻小,因此液滴溫度在低點(diǎn)處最接近預(yù)冷表面溫度,降溫速率最快,相比于液滴中點(diǎn)及高點(diǎn)的降溫速率有數(shù)量級(jí)優(yōu)勢(shì)。不同的降溫特性導(dǎo)致液滴起始結(jié)晶時(shí)間和最終結(jié)晶度不同。根據(jù)Uhlmann理論,結(jié)晶度小于10-6即為玻璃化[26],低點(diǎn)的結(jié)晶度幾乎不變,趨向初始設(shè)定值10-16量級(jí),實(shí)現(xiàn)了玻璃化轉(zhuǎn)變。中點(diǎn)降溫速度比高點(diǎn)更快,先于高點(diǎn)降溫到熔融溫度,所以結(jié)晶比高點(diǎn)更早產(chǎn)生。同時(shí),由于中點(diǎn)比高點(diǎn)的傳熱路徑更小,傳熱速率更大,能較快通過(guò)結(jié)晶危險(xiǎn)溫區(qū),最終結(jié)晶度小于高點(diǎn)。只有以較高的溫變速率快速通過(guò)結(jié)晶危險(xiǎn)溫區(qū),才能實(shí)現(xiàn)被冷凍樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變。

圖4 樣品內(nèi)低、中、高點(diǎn)處溫度與結(jié)晶度變化規(guī)律

對(duì)液滴樣品選取切面進(jìn)行整體降溫結(jié)晶特性分析,如圖5所示(注:圖中只針對(duì)實(shí)現(xiàn)玻璃化冷凍及處于危險(xiǎn)溫區(qū)的部分顯示云圖)。液滴的降溫最先從底部發(fā)生并實(shí)現(xiàn)玻璃化轉(zhuǎn)變。樣品中間結(jié)晶度增大,并向上擴(kuò)散結(jié)晶,由于液滴邊緣薄中間厚,結(jié)晶度與等溫線均呈上凹形。但最大結(jié)晶度未出現(xiàn)在距離冷源最遠(yuǎn)、溫度最高的液滴頂端,而出現(xiàn)于距頂端一定距離的中部。需要說(shuō)明的是,由于本文結(jié)晶模型與傳質(zhì)解耦,因此,液滴中部存在最大結(jié)晶度這一現(xiàn)象與冷凍過(guò)程中樣品界面處存在液氣-固氣相變無(wú)關(guān),今后可進(jìn)一步分析液滴內(nèi)部復(fù)雜的溫度變化情況對(duì)樣品結(jié)晶度的影響。

圖5 液滴內(nèi)部結(jié)晶度和溫度云圖

進(jìn)一步對(duì)冷凍過(guò)程中的液滴頂點(diǎn)處與結(jié)晶度最大點(diǎn)處開(kāi)展降溫速率和結(jié)晶度變化速率特性分析,如圖6所示。頂點(diǎn)的降溫速率和最大結(jié)晶處的降溫速率趨勢(shì)一致,但被冷凍液滴內(nèi)部的降溫速度存在不均勻性,不利于大體積樣品的均勻冷凍。最大結(jié)晶度變化速率點(diǎn)比最大降溫速率點(diǎn)滯后約0.3 s,表明結(jié)晶過(guò)程存在滯后性。在整個(gè)液滴均出現(xiàn)結(jié)晶度后,頂點(diǎn)的降溫速率始終大于最大結(jié)晶點(diǎn)處的降溫速率,頂點(diǎn)的液體更快通過(guò)結(jié)晶危險(xiǎn)溫區(qū),表明更大的降溫速率可以抑制結(jié)晶,使被冷凍樣品更容易實(shí)現(xiàn)玻璃化。

圖6 液滴頂點(diǎn)、結(jié)晶度最大處的降溫速率與結(jié)晶度變化速率

需要說(shuō)明的是,上文通過(guò)引入冷凍樣品的結(jié)晶度X,更直觀地展示了樣品在被冷凍過(guò)程中的內(nèi)部狀態(tài),可預(yù)測(cè)樣品的被冷凍效果,為設(shè)法實(shí)現(xiàn)無(wú)損凍存的各種嘗試提供便捷高效的驗(yàn)證方法。

2.2 固體表面玻璃化冷凍影響因素

針對(duì)不同的生物樣本,通常需要設(shè)定不同的冷卻預(yù)冷溫度。因此,有必要探索預(yù)冷溫度對(duì)樣品在固體表面被玻璃化冷凍的影響。液氮是冷卻金屬載物臺(tái)最常見(jiàn)的工質(zhì),其預(yù)冷極限溫度Tprec,min為78 K,而35%丙二醇溶液的Tm為255.5 K,Tg為160 K。因此,分別選取Tprec為80、100、120、140、160、200、250 K。圖7所示為預(yù)冷溫度對(duì)液滴結(jié)晶度和穿越危險(xiǎn)溫區(qū)時(shí)降溫最慢處的平均降溫速率vcr的影響。預(yù)冷溫度越低,降溫速率越慢,結(jié)晶度越小,預(yù)冷溫度與降溫速率和結(jié)晶度均無(wú)線性關(guān)系。此外,當(dāng)預(yù)冷溫度低于樣品玻璃化轉(zhuǎn)變溫度時(shí),樣品的降溫速率均較快,達(dá)到103K/min量級(jí),其結(jié)晶度在10-5量級(jí);而當(dāng)預(yù)冷溫度高于Tg時(shí),降溫速率在102K/min量級(jí),結(jié)晶度在10-5～10-4量級(jí);當(dāng)預(yù)冷溫度越接近熔融溫度,降溫速率越慢,極易結(jié)晶。因此,預(yù)冷溫度越低,傳熱溫差越大,越有利于實(shí)現(xiàn)樣品的玻璃化冷凍。

前文非等溫結(jié)晶模型計(jì)算表明,最大結(jié)晶處可能在被冷凍樣品的中上部。因此,有必要探究樣品體積對(duì)用SSV方法冷凍的樣本的降溫速率和結(jié)晶度的影響?；诂F(xiàn)有實(shí)際應(yīng)用和文獻(xiàn)調(diào)研情況,樣品體積V分別選取1、5、10、20、50、100、500 μL,定義玻璃化比例VR為樣品中實(shí)現(xiàn)玻璃化冷凍體積與樣品總體積之比,計(jì)算結(jié)果如圖8所示。當(dāng)體積為1 μL時(shí),樣品完全玻璃化冷凍,因此,完全玻璃化轉(zhuǎn)變的安全樣品體積為1 μL。隨著樣本體積增加,樣本內(nèi)部導(dǎo)熱路徑變長(zhǎng),降溫速率變慢,結(jié)晶顯著增加,VR不斷下降,且呈非線性關(guān)系。在一定范圍內(nèi),體積越大,結(jié)晶度變化越劇烈;而體積過(guò)大,結(jié)晶度將完全結(jié)晶。因此,樣本體積是影響SSV方法的關(guān)鍵因素之一。本文提出的耦合熱源項(xiàng)的非等溫結(jié)晶模型可以預(yù)測(cè)不同體積的樣品內(nèi)部結(jié)晶程度和不同條件下玻璃化安全體積,為實(shí)際固體表面玻璃化冷凍設(shè)計(jì)提供一定依據(jù)。

圖8 不同體積樣品中結(jié)晶度和玻璃化轉(zhuǎn)變率

此外,根據(jù)傅里葉導(dǎo)熱定律和牛頓冷卻公式,有效傳熱面積是研究傳熱問(wèn)題的關(guān)鍵因素之一。因此,引入傳熱面積與總體積比值A(chǔ)/V參數(shù),研究樣品形狀對(duì)SSV方法冷凍的影響。樣品體積為5 μL,改變樣品形狀,如圖9所示。正球缺即為圖 2介紹的模型;反球缺與正球缺尺寸相同倒置在挖空的金屬預(yù)冷表面;反半球形樣品半徑為1.34 mm;反圓柱形半徑為1.51 mm,厚0.7 mm;反薄層形半徑為2.3 mm,厚0.3 mm。

圖9 樣品形狀

不同形狀液滴結(jié)晶度和玻璃化比例的計(jì)算結(jié)果如圖10所示。由圖10可知,相同體積下薄層形樣品的A/V更大,玻璃化程度更高,而其他形狀樣品出現(xiàn)部分結(jié)晶。因此,A/V一定程度上可以反映傳熱拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的優(yōu)劣。相同情況下,A/V值越大,結(jié)晶度越小,樣品越容易實(shí)現(xiàn)玻璃化冷凍。若以實(shí)現(xiàn)玻璃化冷凍為目標(biāo),樣品形狀應(yīng)盡量薄層化。說(shuō)明本文模型可以簡(jiǎn)便高效地研究不同形狀樣品在冷凍時(shí)內(nèi)部結(jié)晶情況,可為實(shí)際冷凍樣品形狀設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

圖10 不同形狀液滴結(jié)晶度和玻璃化比例

3 結(jié)論

本文對(duì)基于固體表面玻璃化冷凍方法的冷凍液滴建立了耦合非等溫結(jié)晶源項(xiàng)的傳熱區(qū)域模型,研究了液滴降溫特性和冷凍液滴內(nèi)部的結(jié)晶情況,得到如下結(jié)論:

1)固體表面玻璃化冷凍方法可以實(shí)現(xiàn)快速降溫,降溫速率可達(dá)到103K/min量級(jí)。其可獲得快速降溫能力的核心要素是固體冷臺(tái)得到了充分預(yù)冷并儲(chǔ)存足夠冷量。

2)降溫速率越快,結(jié)晶程度越小。結(jié)晶易出現(xiàn)在遠(yuǎn)離預(yù)冷表面的樣品上部,結(jié)晶最嚴(yán)重區(qū)域不一定位于樣品頂端。

3)預(yù)冷溫度越低、樣品體積越小、樣品面積/體積(即薄層化)越大,結(jié)晶程度越小,越容易實(shí)現(xiàn)玻璃化冷凍。

4)耦合非等溫結(jié)晶源項(xiàng)的傳熱區(qū)域模型可以通過(guò)結(jié)晶度X反映冷凍過(guò)程中樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化,可作為設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)新型冷凍設(shè)備和低溫保護(hù)劑的輔助手段。

本文受上海市科委創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃(20S31903400);上海交通大學(xué)“交大之星”計(jì)劃醫(yī)工交叉研究基金(YG2021QN86)項(xiàng)目資助。(The project was supported by Innovation Action Plan of Shanghai Science and Technology Commission (No. 20S31903400), and Shanghai Jiao Tong University Med-Engineering Fund (No. YG2021QN86).)