蘭 帥， 張 雨， 杜威龍， 賈丹丹， 曹 磊， 王東軍

（1. 河北科技師范學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院； 2. 分析測試中心, 秦皇島 066004）

綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）因其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)而備受關(guān)注， 并在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［1～12］. GFP 通過有規(guī)則的分子內(nèi)氫鍵作用，β-折疊形成了β-筒狀結(jié)構(gòu)， 且α-螺旋恰好位于這個(gè)筒狀結(jié)構(gòu)的兩端， 形成了一個(gè)接近完美的圓柱體結(jié)構(gòu)（“β-can”結(jié)構(gòu)）， 使得GFP獲得了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［13～20］. 值得注意的是， 大多數(shù)GFP的核心生色團(tuán)是非共軛基團(tuán)， 只有位于β-筒狀結(jié)構(gòu)的中心才能發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光（“Light in a can”）， 而位于β-筒外的則是非發(fā)光基團(tuán)，這說明GFP發(fā)光是基于一種特殊的核-殼結(jié)構(gòu)［21～23］.

近年來， 科學(xué)家嘗試通過化學(xué)方法合成并模擬GFP功能結(jié)構(gòu)［24～30］. 但由于制備的生色團(tuán)缺乏類似β-筒狀結(jié)構(gòu)的保護(hù)與限制， 導(dǎo)致其無法獲得高熒光性能的體系［31～34］. 因此， 探究新的制備手段以構(gòu)建類似GFP發(fā)光結(jié)構(gòu)的化學(xué)體系具有非常重要的理論和應(yīng)用意義.

通過對多種膠束前驅(qū)體的篩選， 我們發(fā)現(xiàn)環(huán)烷基醇類化合物形成的膠束可有效促進(jìn)并保護(hù)非共軛有機(jī)胺構(gòu)建熒光中心. 本文以二乙烯三胺（DETA）與環(huán)己基甲醇（CHM）體系為例模擬出類似GFP機(jī)理的化學(xué)發(fā)光體系（圖1）， 研究了濃度、 溫度、 陳化時(shí)間等因素對于熒光性能的影響. 同時(shí)， 通過幾種環(huán)烷基醇類化合物的對比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 膠束結(jié)構(gòu)的微小改變可顯著影響體系的發(fā)光能力. 最后， 基于此類熒光體系的溫度敏感特性， 研究了其應(yīng)用于溫度傳感器的可行性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

乙二胺、 二乙烯三胺、 三乙烯四胺、 四乙烯五胺、 聚乙烯亞胺、 環(huán)己基甲醇、 環(huán)己烷乙醇、 羅丹明6G和硫酸奎寧均為分析純， 購自阿拉丁試劑（上海）有限公司. 實(shí)驗(yàn)所用試劑均直接使用， 未進(jìn)行進(jìn)一步純化， 實(shí)驗(yàn)過程中均使用超純水.

UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis）， 日本島津公司； F-7000型熒光分光光度計(jì)（Flu）， 日本Hitachi 公司； FLS-920型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀（PL）， 英國Edinburgh 公司； SU-8010型掃描電子顯微鏡（SEM）， 日本Hitachi公司； F-7650型透射電子顯微鏡（TEM）， 日本Hitachi公司； Avance Ⅲ 600 Hz型核磁共振波譜儀（NMR）， 瑞士Bruker公司； BX51型熒光顯微鏡（LSCM）， 日本Olympus公司； ZF-1型紫外燈， 上海京工實(shí)業(yè)有限公司； FA20048型分析天平， 上海佑科儀器儀表有限公司； DZF-6050型真空干燥箱， 上海程造儀器設(shè)備有限公司； DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)干燥箱， 上海米青科實(shí)業(yè)有限公司.

1.2 小分子胺/環(huán)己基甲醇膠束體系的制備

在10 mL試劑瓶中分別加入不同質(zhì)量的DETA溶液和CHM溶液， 攪拌均勻， 配制一系列不同濃度（DETA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%～20%）的樣品. 將混合均勻的樣品分別于室溫和60 ℃條件下進(jìn)行陳化， 實(shí)時(shí)觀察.

1.3 不同胺類與環(huán)己基甲醇體系樣品的制備

在10 mL 試劑瓶內(nèi)分別加入0.05 g 胺（乙二胺、 三乙烯四胺、 四乙烯五胺、 聚乙烯亞胺）和9.95 g環(huán)己基甲醇（或環(huán)己烷乙醇）， 攪拌均勻， 配制胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的不同樣品， 在室溫下進(jìn)行陳化， 實(shí)時(shí)觀察.

2 結(jié)果與討論

2.1 濃度對DETA/CHM體系熒光性質(zhì)的影響

DETA和CHM均為沒有熒光的非共軛結(jié)構(gòu)的前驅(qū)體. 將DETA和CHM混合制備出DETA質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.01%～20%范圍內(nèi)的一系列樣品. 各濃度樣品剛混合時(shí)都沒有熒光， 陳化幾小時(shí)后樣品在440 nm處出現(xiàn)熒光發(fā)射峰， 激發(fā)峰位于約364 nm 處， 并且熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（此變化趨勢下文討論）. 同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)DETA的含量對熒光強(qiáng)度有決定作用， 如圖2（A）和（B）所示. 隨著DETA含量的增加， 熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)， 當(dāng)DETA 濃度達(dá)到0.5%時(shí)， 熒光強(qiáng)度達(dá)到最大， 體系量子產(chǎn)率達(dá)到60%［35，36］， 高于一般非共軛熒光體系的熒光量子產(chǎn)率. 然而隨著DETA濃度的進(jìn)一步增加， 熒光強(qiáng)度逐漸減弱， 當(dāng)DETA濃度高于2%時(shí)樣品熒光逐漸消失. 這是由于DETA分子是極性試劑， 傾向存在于環(huán)己基甲醇形成的膠束內(nèi)部. 當(dāng)其濃度逐漸增大時(shí)， 進(jìn)入膠束的DETA增加， 使得膠束尺寸增大， 導(dǎo)致限域效應(yīng)消失， 熒光逐漸消失. 另外， DETA濃度的增加也可能導(dǎo)致熒光體系的微環(huán)境變化， 對熒光中心產(chǎn)生影響. 對不同濃度的DETA/CHM 混合-陳化樣品進(jìn)行了UV-Vis吸收測試， 如圖2（C）所示， 在364 nm處出現(xiàn)一個(gè)明顯的吸收峰， 與體系的熒光激發(fā)峰值相吻合. 尤其重要的是， DETA濃度為0.5%（即熒光最佳濃度）時(shí)的樣品具有最大吸收值， 而不是那些DETA濃度更高的樣品， 此結(jié)果在一定程度上證明了DETA/CHM熒光體系具有特殊結(jié)構(gòu). 同時(shí)， 我們發(fā)現(xiàn)吸收強(qiáng)度隨濃度的變化趨勢與熒光強(qiáng)度的變化趨勢一致［圖2（B）和（C）中插圖］. 由一系列濃度樣品在紫外燈365 nm下的照片［圖2（D）］可以觀察到0.5%樣品的熒光強(qiáng)度較強(qiáng). 為解釋上述熒光和吸收的特殊現(xiàn)象， 我們認(rèn)為體系可能形成了膠束結(jié)構(gòu)， 構(gòu)建出類似GFP模式的核-殼結(jié)構(gòu)發(fā)光體系.

2.2 DETA/CHM體系的TEM和SEM表征

如圖3 所示， DETA/CHM 體系在最佳濃度（DETA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%）時(shí)， 膠束尺寸約為4 nm［圖3（A）］. 當(dāng)DETA濃度高于0.5%時(shí)， 膠束的尺寸主要集中在20～100 nm， 并與一些幾微米的大膠束共存［圖3（B）～（D）］. 此測試結(jié)果表明DETA的濃度對膠束的大小起著決定性作用， 低濃度才能出現(xiàn)納米級膠束. 濃度增大生成大膠束， 熒光逐漸消失， 這一規(guī)律和熒光強(qiáng)度的變化相符. 該結(jié)果說明環(huán)己基甲醇自身形成一種膠束作為保護(hù)殼層， 同時(shí)為熒光的形成提供了理想的空間， DETA分子作為極性試劑， 傾向于存在于膠束內(nèi)， 在CHM形成的球形結(jié)構(gòu)內(nèi)相互聚集， 由于限制效應(yīng)而形成強(qiáng)烈發(fā)射. 膠束內(nèi)DETA含量增加會(huì)使膠束尺寸增大， 導(dǎo)致限制效應(yīng)消失， 從而熒光消失. 由此可見， 此發(fā)光體系在機(jī)理和結(jié)構(gòu)等方面與GFP有著極為相近的特征： （1） 殼層具有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)和尺寸， 提供保護(hù)層和內(nèi)部空間； （2） 非共軛基團(tuán)在殼層內(nèi)形成高效的熒光中心， 而在殼層外無法發(fā)光. 值得注意的是， 只有環(huán)烷基醇類前驅(qū)體才能形成有效的殼層， 而胺-線性醇類（如正己醇等）體系不具有發(fā)光性能（見本文支持信息圖S1）.

Fig.3 TEM(A, B) and SEM(C, D) images for the DETA/CHM samples at different concentrations of DETA

2.3 DETA/CHM體系的核磁數(shù)據(jù)分析

如圖4（A）所示， 純DETA分子1H NMR譜的質(zhì)子信號范圍為δ2.5～2.9. 如圖4（B）所示， 純CHM分子中C原子上H的質(zhì)子信號范圍為δ1.0～5.5， CHM中羥基的質(zhì)子信號峰出現(xiàn)在δ3.44附近， 與羥基相連C原子上的質(zhì)子因?yàn)槭艿降钠帘巫饔幂^小， 電子云的密度較低， 信號峰出現(xiàn)在δ5.28附近.

對于DETA/CHM混合后形成的熒光體系， 將其核磁共振波譜圖與混合前驅(qū)體DETA和CHM的核磁共振波譜圖分別進(jìn)行對比， 并未發(fā)現(xiàn)新的質(zhì)子信號峰， 說明熒光體系的形成過程是物理變化過程， 而非化學(xué)變化過程. 對比測試了不同濃度的熒光樣品核磁數(shù)據(jù)［圖4（C）］， 其中CHM的核磁信號在不同濃度樣品中沒有顯著變化［圖4（C）右側(cè)圖］. 但仔細(xì)對比不同濃度樣品的DETA核磁信號時(shí)［圖4（C）左側(cè)圖］發(fā)現(xiàn)， 存在于CHM膠束中的DETA化學(xué)位移均比純DETA的大， 而且核磁峰交疊明顯， 隨DETA濃度降低上述特征更加明顯. 當(dāng)DETA濃度控制在0.4%～0.5%范圍時(shí)， 熒光樣品的DETA核磁信號交疊在一起. 此結(jié)果在一定程度上證實(shí)了上文的推測， 即DETA在CHM膠束中的特殊環(huán)境形成了特殊的電子云空間共軛［37］.

Fig.4 1H NMR spectra of DETA(A), CHM(B) and their fluorescent mixtures at different concentrations(C) in CDCl3

2.4 陳化時(shí)間和溫度對DETA/CHM體系熒光性質(zhì)的影響

配制0.5%DETA/CHM 混合樣品， 在室溫下進(jìn)行陳化. 隨著陳化時(shí)間的延長， 樣品的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)， 當(dāng)陳化時(shí)間為6 d 時(shí)， 熒光強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng). 同時(shí)紫外吸收強(qiáng)度也隨著陳化時(shí)間的延長而增強(qiáng)［圖5（A）～（C）］. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 膠束熒光中心在室溫下的形成是一個(gè)緩慢的過程， 而且形成熒光中心需要一定時(shí)間， 以達(dá)到其最佳空間構(gòu)型. 基于此， 進(jìn)一步考察了陳化溫度對膠束形成及熒光性能的影響. 將膠束的陳化溫度調(diào)整為60 ℃， 僅6 h膠束即可獲得最大熒光強(qiáng)度， 遠(yuǎn)低于常溫下所需的陳化時(shí)間（6 d）. 由此證明適當(dāng)?shù)年惢瘻囟葘晒怏w系的形成有利， 可加速形成熒光中心. 同時(shí)由圖5（D）～（F）可見， 提高陳化溫度僅加速了DETA/CHM 體系中熒光中心生色團(tuán)的形成速率， 并沒有改變該體系熒光中心的結(jié)構(gòu)和性質(zhì).

Fig.5 Fluorescence(A, D) and UV-Vis(B, E) spectra and relative line chart of fluorescence intensity versus time(C, F) of 0.5% DETA/CHM samples aging at room temperature(A—C) and 60 ℃(D—F)

2.5 膠束殼層微結(jié)構(gòu)變化對熒光體系的影響

本課題組在前期工作中已經(jīng)合成了DETA/CHA類GFP膠束［38］， 本文在此基礎(chǔ)上又合成了二乙烯三胺/環(huán)己烷乙醇（DETA/CHE）體系. 由圖6（B）中可見， DETA/CHM的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)， 遠(yuǎn)高于其它兩個(gè)膠束. 隨著六元環(huán)上碳鏈的增長， DETA/CHA（λem=456 nm）， DETA/CHM（λem=440）及DETA/CHE（λem=432 nm）膠束的發(fā)射波長逐漸藍(lán)移， 如圖6（B）和（C）所示. 從激發(fā)波長看， DETA/CHA陳化過程中只有兩個(gè)激發(fā)峰［λex=268， 364 nm， 圖6（D）］. DETA/CHM最開始在λex=270， 360 mn有兩個(gè)激發(fā)峰， 第七天出現(xiàn)3 個(gè)激發(fā)峰［λex=280， 336， 384 nm， 圖6（E）］. DETA/CHE 同時(shí)存在有3 個(gè)激發(fā)峰［λex=272， 324， 356 nm， 圖6（F）］. 上述結(jié)果表明， 得到的核-殼型熒光體系的性質(zhì)不僅取決于構(gòu)成熒光中心的DETA， 還嚴(yán)重依賴于其存在環(huán)境， 膠束前驅(qū)體的微小改變會(huì)顯著影響體系的光學(xué)性質(zhì).

Fig.6 Comparison of fluorescent properties for the three systems prepared with DETA and CHA,CHM and CHE

2.6 不同非共軛胺在CHM膠束中的熒光性能

嘗試用不同的非共軛胺： 乙二胺（EDA）、 三乙烯四胺（TETA）、 四乙烯五胺（TEPA）、 聚乙烯亞胺（PEI）代替DETA， 采用該合成路線成功制備出5 種以CHM 為外殼的類GFP 熒光膠束， 通過對比圖7（A）發(fā)現(xiàn)， DETA/CHM膠束的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于其它膠束. 圖7（B）表明， 隨著胺分子的增大， 膠束的發(fā)射波長發(fā)生一定程度的紅移. 另外， 對典型熒光膠束DETA/CHM， TETA/CHM， DETA/CHA， DETA/CHE進(jìn)行了熒光壽命測試［圖7（C）］， 典型樣品的激發(fā)態(tài)壽命值列于表1. 可見， 盡管各樣品熒光壽命值存在差異， 但差距不明顯， 表明此類樣品的熒光中心相近.

Table 1 Excited state lifetime values of four typical samples

2.7 溫度響應(yīng)特性的應(yīng)用研究

相對于基于分子剛性共軛結(jié)構(gòu)的傳統(tǒng)共軛發(fā)光有機(jī)物， 本文制備的胺-膠束結(jié)構(gòu)體系不具備剛性共軛結(jié)構(gòu)， 而是一種相對松散的核-殼型發(fā)光體系. 因此可推測這種特殊的熒光體系的發(fā)光性能與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光物質(zhì)有著顯著區(qū)別. 如圖8（A）所示， 隨著溫度的升高， DETA/CHM體系在440 nm處的熒光峰呈現(xiàn)減弱的趨勢， 在0～90 ℃溫度范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度減弱了76%， 表明其比傳統(tǒng)的熒光物質(zhì)羅丹明6G和硫酸奎寧具有更高的溫度敏感性［圖8（B）， 圖S2， 見本文支持信息］. 同時(shí)， 熒光強(qiáng)度與溫度呈線性關(guān)系， 隨著溫度的升高逐漸減弱. 這可能是由于膠束相對體積較大、 結(jié)構(gòu)松散， 溫度的升高增加了膠束結(jié)構(gòu)的振動(dòng)和變形， 破壞了其內(nèi)部胺分子形成的熒光中心， 導(dǎo)致熒光強(qiáng)度成倍下降. 冷-熱循環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 5 次平行實(shí)驗(yàn)中， 這些光譜變化過程具有良好的可逆性［圖8（C）］. 這進(jìn)一步表明DETA/CHM膠束體系在溫度傳感器方面有廣泛的應(yīng)用潛力.

Fig.8 Temperature response emission characteristics of DETA/CHM recorded between 0 and 90 ℃(λex=364 nm; measured with 10 ℃ temperature interval)

3 結(jié) 論

模擬GFP發(fā)光機(jī)理， 以DETA（二乙烯三胺）和CHM（環(huán)己甲醇）為前驅(qū)體， 通過簡單的混合-陳化步驟， 得到了具有較高熒光效率的核-殼型化學(xué)熒光體系. 實(shí)驗(yàn)探究了濃度、 膠束尺寸、 陳化時(shí)間和溫度等因素對體系熒光性能的影響， 同時(shí)對比了不同環(huán)烷基醇化合物形成的熒光膠束， 發(fā)現(xiàn)此類熒光體系決定于環(huán)境膠束誘導(dǎo)發(fā)光， 為研究該體系的發(fā)光機(jī)理提供了數(shù)據(jù)支撐. 由于該膠束體系良好的溫度敏感性， 在溫度傳感器等方面具有應(yīng)用潛力.

支持信息見http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/20230096.