孫志濤，姜輝，張寶玉，高晶晶，肖偉，周國慶，宋東旭，張亞玲，馬紅艷

作者單位：滄州市人民醫(yī)院，a胃腸外科，b肛腸外科，c神經(jīng)外科，d病理科，河北 滄州061000

結(jié)直腸癌是常見消化道惡性腫瘤，發(fā)病率與病死率在我國呈上升趨勢，由于其具有侵襲性，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，多數(shù)病人確診時已到局部晚期或遠處轉(zhuǎn)移，治療效果不理想，病人預(yù)后較差，晚期病人的5年生存率較低，因此，對結(jié)直腸癌的早期診斷及預(yù)后評估具有重要意義［1-2］。音猬因子（sonic hedgehog，SHH）是信號通路蛋白，是干細(xì)胞自我更新的重要調(diào)控蛋白，與腫瘤的發(fā)生與惡性進展有關(guān)，研究表明，結(jié)直腸癌組織中SHH表達明顯上調(diào)，抑制SHH通路激活可抑制結(jié)直腸癌的遷移與侵襲［3-4］。經(jīng)Targetscan在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)，微RNA-582-5p（miR-582-5p）與SHH存在靶向結(jié)合位點，而目前研究發(fā)現(xiàn)miR-582-5p在多數(shù)腫瘤中呈低表達，如在膀胱癌中，過表達miR-582-5p可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡［5］。另有研究顯示，環(huán)狀RNA泛素相關(guān)蛋白2（circUBAP2）通過調(diào)節(jié)miR-582-5p/叉頭盒蛋白O1（FOXO1）增強自噬并促進結(jié)直腸癌進展和轉(zhuǎn)移［6］，故推測miR-582-5p也參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。miR-582-5p是否與SHH共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展尚未見報道，本研究檢測結(jié)直腸癌組織中miR-582-5p與SHH的表達情況，分析miR-582-5p與SHH水平在結(jié)直腸癌病人病理診斷和預(yù)后評估中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年6月至2018年12月在滄州市人民醫(yī)院收治的125例結(jié)直腸癌病人作為觀察對象，所選病人均取結(jié)直腸癌組織及癌旁組織，125例病人中，腫瘤長徑＜5 cm 69例，≥5 cm 56例；腫瘤部位為結(jié)腸77例，直腸48例；腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期60例；有脈管侵犯51例，無脈管侵犯74例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例。另選同期經(jīng)病理診斷為結(jié)直腸息肉的97例病人作為結(jié)直腸息肉組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸癌；（2）術(shù)前未經(jīng)過抗腫瘤治療；（3）病人臨床資料與隨訪資料完整；（4）病人或其近親屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌病人；（2）合并高血壓、糖尿病、感染性疾病病人；（3）合并肝腎功能不全者。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。獲得所有組織標(biāo)本一部分-80 ℃冰箱保存，一部分使用4%甲醛溶液固定使用石蠟包埋。

1.2 研究方法

1.2.1 qRT-PCR檢測miR-582-5p及SHH mRNA的表達 各組織標(biāo)本-80 ℃冰箱保存，各標(biāo)本取50 mg，研磨后加入Trizol試劑（上海，Beyotime）提取總RNA，PrimeScript? RT Master Mix（日本，Takara）合成cDNA后，采用SYBR Green Master（德國，Roche）進行PCR擴增，各引物引物序列（廣州，Ribobio）見表1。反應(yīng)結(jié)束后，分別以U6、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt分析法計算miR-582-5p、SHH mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 各標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)切片后，使用兔抗人SHH單克隆抗體（上海，Beyotime）（1∶1 000稀釋），SupervisionTM二步法免疫組化染色，陰性對照以PBS作為一抗，陽性對照為已知SHH陽性組織切片，由兩位資深病理醫(yī)師雙盲診斷。

染色結(jié)果判斷：SHH陽性表現(xiàn)為黃色顆粒，主要分布于細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞數(shù)分別為0～10%、＞10%～25%、＞25%～50%、＞50%～75%、＞75%，計為0、1、2、3、4分；細(xì)胞染色強度無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計0、1、2、3分。兩項積分相乘≤1分為陰性（-），≥2分為陽性（+）。

1.2.3 miR-582-5p與SHH的靶向驗證 結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116（上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫）以每孔5×104個細(xì)胞接種在24孔板中，待細(xì)胞貼壁生長至約60%時，將構(gòu)建的pmirGLO雙螢光素酶野生型（wt）與突變型（mut）SHH表達載體（Promega公司）分別與miR-582-5p mimics、miR-NC質(zhì)粒（廣州，Ribobio）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h，每組設(shè)置6個復(fù)孔，檢測各組細(xì)胞螢光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，miR-582-5p、SHH mRNA表達水平用表示，兩組比較行t檢驗，多組比較行單因素方差分析；計數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；Pearson分析結(jié)直腸癌組織中miR-582-5p與SHH mRNA表達的相關(guān)性，Kaplan-Meier曲線分析miR-582-5p、SHH表達與病人預(yù)后相關(guān)性；受試者操作特征（ROC）曲線分析miR-582-5p、SHH mRNA對結(jié)直腸癌的診斷價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-582-5p及SHH mRNA表達水平比較qRT-PCR結(jié)果顯示，在癌旁組織、結(jié)直腸息肉組織、結(jié)直腸癌組織中miR-582-5p表達水平依次降低（F=521.23，P＜0.001），SHH mRNA表達水平依次升高（F=661.24，P＜0.001），見表2。

表2 miR-582-5p及SHH mRNA表達水平比較/

表2 miR-582-5p及SHH mRNA表達水平比較/

注：miR-582-5p為微RNA-582-5p，SHH為音猬因子。①與癌旁組織比較，P＜0.05。②與結(jié)直腸息肉組織比較，P＜0.05。

組別癌旁組織結(jié)直腸息肉組織結(jié)直腸癌組織F值P值SHH mRNA 1.03±0.12 1.78±0.34①2.47±0.41①②661.24＜0.001例數(shù)125 97 125 miR-582-5p 1.05±0.15 0.83±0.12①0.65±0.09①②521.23＜0.001

2.2 SHH蛋白表達水平比較 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，SHH蛋白在結(jié)直腸癌組織、結(jié)直腸息肉組織、癌旁組織中陽性表達率分別為67.20%（84/125）、34.48%（30/87）、19.20%（24/129），三組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=61.58，P＜0.001），結(jié)直腸癌組織、結(jié)直腸息肉組織SHH蛋白陽性表達率高于癌旁組織（χ2=6.31，P=0.012；χ2=58.68，P＜0.001），結(jié)直腸癌組織SHH蛋白陽性表達率顯著高于結(jié)直腸息肉組織（χ2=22.09，P＜0.001），見圖1，表3。

圖1 結(jié)直腸癌癌旁組織、結(jié)直腸息肉組織、結(jié)直腸癌組織SHH蛋白表達（SP×200）:A為癌旁組織SHH陰性表達;B為結(jié)直腸息肉組織陽性表達;C為結(jié)直腸癌組織SHH陽性表達

表3 音猬因子（SHH）蛋白在三種標(biāo)本的表達/

表3 音猬因子（SHH）蛋白在三種標(biāo)本的表達/

注：①與癌旁組織比較，P＜0.05。②與結(jié)直腸息肉組織比較，P＜0.05。

陰性/例101 67 41組別癌旁組織結(jié)直腸息肉組織結(jié)直腸癌組織例數(shù)125 97 125陽性/例24 30 84陽性率/%19.20 30.93①67.20①②

2.3 結(jié)直腸癌組織中miR-582-5p與SHH mRNA的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-582-5p與SHH mRNA表達呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.63，P＜0.05），如圖2。

圖2 結(jié)直腸癌組織中miR-582-5p與SHH mRNA相關(guān)性

2.4 miR-582-5p與SHH的靶向驗證 如圖3所示，經(jīng)Targetscan在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-582-5p與SHH存在靶向結(jié)合位點。雙螢光素酶實驗檢測結(jié)果顯示，野生型（wt）SHH表達載體與miR-582-5p mimics共轉(zhuǎn)染HCT116后，與miR-NC比較，相對螢光素活性顯著降低（P＜0.05），見表4。

圖3 微RNA-582-5p（miR-582-5p）與音猬因子（SHH）的靶向結(jié)合位點預(yù)測

表4 雙螢光素酶活性檢測結(jié)果/

表4 雙螢光素酶活性檢測結(jié)果/

注：miR-582-5p為微RNA-582-5p，SHH為音猬因子。

組別miR-NC miR-582-5p mimics t值P值SHH-mut 0.98±0.09 1.03±0.10 0.91 0.384 SHH-wt 1.01±0.13 0.37±0.05 11.26＜0.001

2.5 miR-582-5p、SHH與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 miR-582-5p在腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、有脈管侵犯和有淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中表達水平低于腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、無脈管侵犯和無淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織（P＜0.05），SHH在腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、有脈管侵犯和有淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中陽性表達率高于腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、無脈管侵犯和無淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織（P＜0.05），見表5。

2.6 miR-582-5p、SHH mRNA對結(jié)直腸癌的診斷價值分析 以是否為結(jié)直腸癌作為因變量，以結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸癌中miR-582-5p、SHH mRNA表達為自變量，經(jīng)ROC曲線分析顯示，miR-582-5p診斷結(jié)直腸癌的AUC為0.82，95%CI：（0.76，0.87），P＜0.05，截斷值為0.71，靈敏度為76.00%，特異度為77.32%，SHH mRNA診斷結(jié)直腸癌的AUC為0.86，95%CI：（0.81，0.90），P＜0.05，截斷值為2.11，靈敏度為80.00%，特異度為79.38%，二者聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的AUC為0.92，95%CI：（0.88，0.95），P＜0.05，靈敏度為86.40%，特異度為85.57%，聯(lián)合診斷效能高于單獨檢測（Z=3.00，P=0.002；Z=2.31，P=0.021）。

2.7 miR-582-5p、SHH與結(jié)直腸癌病人預(yù)后關(guān)系根據(jù)ROC曲線診斷的截斷值，將miR-582-5p表達分為高表達組（≥0.71）與低表達組（＜0.71），Kaplan-Meier曲線分析顯示，miR-582-5p低表達和SHH陽性表達病人無進展生存期和總生存期顯著低于miR-582-5p高表達（χ2=4.70，P=0.030；χ2=5.43，P=0.020）和SHH陰性表達（χ2=12.72，P＜0.001；χ2=6.51，P=0.010），見圖4。

圖4 miR-582-5p、SHH與結(jié)直腸癌病人預(yù)后關(guān)系

3 討論

miRNA可參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤耐藥性等過程，在腫瘤中異常表達，成為腫瘤診斷和預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物［7］。miR-582-5p與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，多項研究［8-10］顯示，miR-582-5p在胃癌、肺癌、骨肉瘤等多種腫瘤中明顯低表達，過表達miR-582-5p可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲，發(fā)揮抑癌作用。Huang、Dai等［11］研究表明，長鏈非編碼RNA DCST1-AS1通過靶向miR-582-5p表達調(diào)控HMGB1蛋白表達，促進結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長與侵襲。本研究結(jié)果顯示，miR-582-5p在結(jié)直腸癌組織中表達水平顯著降低，與Huang、Dai等［11］研究結(jié)果一致，且miR-582-5p表達顯著低于結(jié)直腸息肉組織中表達水平，提示miR-582-5p可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，其機制可能與miR-582-5p參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)。研究［12］顯示，在非小細(xì)胞肺癌中，miR-582-5p的表達在TNM分期較高、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人癌組織中表達水平較低，提示miR-582-5p表達與腫瘤進展有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，miR-582-5p在腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、有脈管侵犯和有淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中表達水平顯著低于腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、無脈管侵犯和無淋巴轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中的表達水平，提示miR-582-5p的低表達與結(jié)直腸癌的進展和發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究［10］顯示，在骨肉瘤中，與miR-582-5p低表達，過表達miR-582-5通過靶向抑制神經(jīng)腫瘤腹側(cè)抗原1表達，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力。在前列腺癌中過表達miR-582-5p通過抑制TGF-β信號通路抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移［13］。這些研究表明，miR-582-5p通過調(diào)控不同的靶基因或通路影響腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，推測其在結(jié)直腸癌中的轉(zhuǎn)移與侵襲中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

SHH信號通路是參與干細(xì)胞自我更新調(diào)控的重要通路，在調(diào)節(jié)干細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育過程中起著重要的作用，此外，SHH信號通路也調(diào)控著腫瘤干細(xì)胞的自我更新，在維持腫瘤干細(xì)胞樣特性、腫瘤惡性進展發(fā)揮關(guān)鍵作用［14］。多項報道［15-16］顯示，多種腫瘤如肝癌、膀胱癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等與SHH信號通路異常激活有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中SHH mRNA表達水平及蛋白陽性表達率顯著升高，且在腫瘤分期較高、有脈管侵犯和有淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中蛋白陽性表達率更高，與報道一致，研究［17］顯示，SHH在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)，且SHH的上調(diào)表達在維持結(jié)腸癌細(xì)胞干性時發(fā)揮重要作用。表明在結(jié)直腸癌中，存在SHH信號通路激活，而抑制SHH信號通路激活可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲［18］。提示SHH通路在結(jié)直腸癌中可能發(fā)揮促進腫瘤細(xì)胞增殖與遷移，進而促進結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中miR-582-5p表達水平與SHH mRNA表達呈負(fù)相關(guān)性，且通過生物信息學(xué)軟件targetscan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-582-5p與SHH存在靶向結(jié)合位點，雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果證實miR-582-5p和SHH存在靶向關(guān)系，

推測miR-582-5p可能通過靶向調(diào)控SHH表達調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，促進結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。另外，本研究還顯示，miR-582-5p、SHH對結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸癌的鑒別診斷有一定臨床意義，二者聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的靈敏度與特異度更高，提示miR-582-5p、SHH可能成為結(jié)直腸癌病理診斷的標(biāo)志物。

基因異常表達與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，研究［19］顯示miR-582-5p、SHH表達還與癌癥病人預(yù)后相關(guān)，miR-582-5p的低表達與SHH高表達與病人不良預(yù)后有關(guān)。本研究顯示，miR-582-5p低表達和SHH陽性表達病人的無進展生存期和總生存期顯著低于miR-582-5p高表達和SHH陰性表達病人，提示miR-582-5p、SHH與病人預(yù)后有關(guān)，提示miR-582-5p、SHH可能作為評估結(jié)直腸癌預(yù)后的標(biāo)志物，推測其原因為miR-582-5p低表達和SHH陽性表達結(jié)直腸癌惡性進展更快，可能發(fā)生轉(zhuǎn)移進而影響預(yù)后。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中miR-582-5p低表達、SHH高表達，且與結(jié)直腸癌病人臨床病理特征和預(yù)后有關(guān)，可能成為結(jié)直腸癌的病理診斷和預(yù)后評估的標(biāo)志物，對臨床診斷具有一定價值意義，其具體作用機制需更深入地研究。