張思微， 聶 雅 ， 劉 瑜， 高嫣珺， 卜仕金

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

隨著全球畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展， 魚粉作為飼料的主要蛋白原料需求日益增加 （彭凱等，2022）。近年來，大宗飼料蛋白原料供應(yīng)匱乏，魚粉因其蛋白含量高、氨基酸平衡和適口性好等優(yōu)點(diǎn)，價(jià)格居高不下（Guo 等，2022）。 植物蛋白如大豆粉、玉米粉等，來源廣泛且價(jià)格低，是理想的魚粉替代品（Gatlin 等，2007），但植物蛋白含有抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)、氨基酸不平衡和纖維素含量高等缺點(diǎn)，限制了其進(jìn)一步使用 （Hansen 等，2011；De Francesco等，2004），不受海洋資源、農(nóng)業(yè)用地和氣候變化限制的可持續(xù)蛋白質(zhì)的需求不斷增加（Dalton，2005），因此通過回收秸稈、溫室廢氣等從細(xì)菌、真菌和微藻中獲得的單細(xì)胞蛋白（SCP）具有廣闊的應(yīng)用前景（o/verland 等，2010）。 甲烷是天然氣的主要成分，在自然界中分布廣泛且供應(yīng)充足，是產(chǎn)生菌體蛋白的理想培養(yǎng)基（傅曉瑩等，2022；Hanson等，1996）。 莢膜甲基球菌蛋白（MBM）是一種由甲烷與莢膜甲基球菌自然發(fā)酵產(chǎn)生的SCP， 粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)65%，同時(shí)氨基酸組成平衡，相當(dāng)于高品質(zhì)魚粉（Biswas 等，2020）。盡管作為魚粉的替代物， 國內(nèi)外已有研究證明了MBM 在多種動(dòng)物的安全性和有效性（Hellwing 等，2006；Skrede 等，2003），但其在我國尚未批準(zhǔn)作為飼料添加劑?！缎嘛暳虾托嘛暳咸砑觿┕芾磙k法》中（中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2012）規(guī)定，新飼料添加劑的申請資料應(yīng)包括毒理學(xué)安全評(píng)價(jià)報(bào)告。目前，國內(nèi)鮮見對MBM 進(jìn)行系統(tǒng)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究， 本研究進(jìn)行MBM 的大、 小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)和90 d 毒性試驗(yàn)即亞慢性毒性試驗(yàn)， 旨在確定其半數(shù)致死量（LD50）及長期飼喂不同劑量MBM 的有害效應(yīng)劑量、毒作用性質(zhì)和靶器官（沈建忠，2002），以期為MBM 的毒理學(xué)評(píng)價(jià)和臨床使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 莢膜甲基球菌蛋白（MBM）：粗蛋白質(zhì)含量≥65%， 褐色粉末。 批號(hào)為FNJ012-20210308，由愷迪蘇（重慶）有限公司南京中試基地提供，使用0.5%羧甲基纖維素鈉制備混懸液。羧甲基纖維素鈉、甲醛、蘇木素伊紅、石蠟均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器 病理切片機(jī)，購自徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；生物顯微鏡，購自德國ZEISS；電子天平，購自上海友聲衡器有限公司；電子分析天平購自德國賽多利斯天平公司； 貝克曼Unicel Dxc800 synchron 型全自動(dòng)生化分析儀；Sysmex XE-2100 型全自動(dòng)血液分析儀。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與飼料 急性毒性試驗(yàn)：Wistar 大鼠（清潔級(jí)），6 ～7 周齡，雄性196.9 ～210.3 g，雌性180.8 ～185.2 g；ICR 小鼠 （清潔級(jí)），4 ～5 周齡，雄性18.8 ～22.0 g，雌性18.7 ～22.0 g，喂食普通飼料。 亞慢性毒性試驗(yàn)：Wistar 大鼠（SPF 級(jí)），4 ～5 周齡， 雄性70.6 ～103.0 g， 雌性80.3 ～106.9 g。 喂食添加不同濃度MBM 的飼料和空白飼料， 飼料委托江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司加工制作。 動(dòng)物均由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供， 動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （蘇）2017-0007；使用許可證：SYXK（蘇）2017-0044。

1.4 急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用限量法設(shè)計(jì)MBM大、小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)。采用隨機(jī)分組法將大鼠和小鼠各分為對照組和給藥組，每組20 只（雌雄各半）。 大鼠分兩次經(jīng)口灌胃MBM 混懸液（0.5 g/mL），間隔4 h，每次劑量為10 mL/kg·bw；小鼠一次經(jīng)口灌胃MBM 混懸液，劑量為20 mL/kg·bw。第1 天上午8 點(diǎn)染毒， 受試物在染毒結(jié)束后持續(xù)觀察30 min，2 h 后再觀察一次， 之后每天上午8點(diǎn)觀察一次，連續(xù)觀察14 d，期間動(dòng)物自由采食和飲水。 試驗(yàn)期間觀察記錄動(dòng)物健康狀況、飲食、體重及死亡情況，觀察結(jié)束后將所有存活大、小鼠處死后進(jìn)行大體剖檢觀察。

1.5 亞慢性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 試驗(yàn)分組及給藥 80 只大鼠隨機(jī)分為4組，每組20 只（雌雄各半），分別為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，三個(gè)劑量暴露組的飼料MBM 添加濃度分別設(shè)為10000 mg/kg （相當(dāng)于1.0%添加量）、25000 mg/kg（相當(dāng)于2.5%添加量）和50000 mg/kg（相當(dāng)于5.0%添加量），對照組給予空白飼料，連續(xù)給藥90 d。

1.5.2 毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo) 試驗(yàn)期間， 每日進(jìn)行一般與臨床觀察，記錄異常現(xiàn)象。 每周稱量體重，統(tǒng)計(jì)飲水及飼料消耗。試驗(yàn)中期（給藥第45 天）和末期（給藥第90 天）各組稱重采血后剖殺10 只動(dòng)物（雌雄各半）進(jìn)行大體剖檢，采集心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、睪丸及卵巢稱重并計(jì)算臟器系數(shù)，主要臟器組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。 采集的血液用于血液學(xué)和血液生化相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單樣本Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)不同指標(biāo)各劑量組數(shù)據(jù)是否符從正態(tài)分布， 符從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)；不符從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用Mann-Whitney 檢驗(yàn)； 相關(guān)性分析使用Spearman 相關(guān)性分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 本試驗(yàn)劑量條件下，大、小鼠經(jīng)口灌胃給予MBM 10 g/kg·bw 劑量，給藥后未見明顯異常反應(yīng)。 試驗(yàn)第3 天給藥組有一只小鼠死亡，剖檢可見胃壁破裂，肝臟覆有藥液，判斷死因?yàn)楣辔覆僮鞑划?dāng)， 其余大、 小鼠均未死亡。 試驗(yàn)觀察期內(nèi)采食、飲水和排便等均正常，體重正常增長，未出現(xiàn)中毒反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行大體剖檢，各臟器組織均未見明顯異常，毒性劑量和毒性靶器官均未明確顯示。

2.2 亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 臨床表現(xiàn) 各組動(dòng)物在給藥期內(nèi)， 均未出現(xiàn)中毒及異常死亡情況，行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、分泌排泄物等臨床觀察內(nèi)容均未見異常情況。

2.2.2 體重和攝食與飲水量 試驗(yàn)各周期雌、雄大鼠體重變化見圖1a。 雄性大鼠低劑量組與對照組相比各周期均無顯著性差異（P ≥0.05）；中劑量組第6 周與對照組相比差異極顯著（P ＜0.01）；高劑量組第5、6 周顯著高于對照組（P ＜0.05）。雌性大鼠低、 中劑量組各周期體重與對照組相比均無顯著性差異（P ≥0.05）；高劑量組第3 周與對照組相比差異顯著（P ＜0.05），第4 ～13 周差異極顯著（P ＜0.01）。 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，雄性大鼠第5、6 和10 ～13 周、 雌性大鼠第3 ～13 周體重與MBM 飼料添加量呈正相關(guān)（P ＜0.05）。

圖1 體重和攝食及飲水量結(jié)果

試驗(yàn)各周期雌、 雄大鼠平均飲水和攝食量見圖1b。 與對照組相比，低劑量組雌、雄大鼠平均攝食量無顯著差異（P ≥0.05）、中、高劑量組差異極顯著（P ＜0.01）；低、中劑量組雌、雄大鼠及高劑量組雌鼠平均飲水量無顯著差異（P ≥0.05）；高劑量組雄鼠平均飲水量差異極顯著（P ＜0.01）。

根據(jù)平均攝食量和飼料MBM 濃度， 標(biāo)準(zhǔn)化MBM 攝入量：雄性大鼠平均每日MBM 攝入量分別為582、1601、3281 mg/kg·bw； 雌性大鼠分別588、1561、3138 mg/kg·bw。

2.2.3 血液學(xué)和血液生化 試驗(yàn)中期和末期，雌、雄大鼠各組血液學(xué)和血液生化檢測結(jié)果分別見表1 和表2。 血液學(xué)檢測結(jié)果顯示，僅中期雄性大鼠淋巴細(xì)胞絕對值（LYM）與對照組差異顯著（P ＜0.05）；血液生化檢測結(jié)果顯示，雌、雄大鼠各劑量組與對照組比較，各項(xiàng)指標(biāo)在試驗(yàn)中、末期均無顯著差異（P ≥0.05）。

表1 試驗(yàn)中期和末期雌、雄大鼠血液學(xué)檢測結(jié)果

2.2.4 臟器系數(shù)和病理檢查 試驗(yàn)中期和末期，雌、雄大鼠各組臟器系數(shù)見表3。 給藥中期，與對照組各臟器系數(shù)相比，雄性大鼠低劑量組腎、睪丸差異顯著（P ＜0.05）， 中劑量組肝臟差異極顯著（P ＜0.01）；雌性大鼠中劑量組脾、肺及高劑量組脾、卵巢差異顯著（P ＜0.05）。給藥末期，與對照組各臟器系數(shù)相比， 雄性大鼠各劑量組均無顯著差異（P ≥0.05）；雌性大鼠僅低劑量組腎臟及高劑量組肝臟差異顯著（P ＜0.05）。

表3 試驗(yàn)中期和末期雌、雄大鼠臟器系數(shù) %

試驗(yàn)中期和末期， 各劑量組與對照組大體剖檢均未見任何肉眼可見的異?；虿∽儭?進(jìn)一步對試驗(yàn)?zāi)┢诟邉┝拷M和對照組大鼠進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，各組織器官組織病理學(xué)檢查結(jié)果見圖2，未觀察到與給藥相關(guān)的組織病理學(xué)變化。

3 討論

《獸藥急性毒性試驗(yàn)（LD50測定）指導(dǎo)原則》中（中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2009）要求，劑量達(dá)5000 mg/kg·bw 時(shí)無動(dòng)物死亡， 增加動(dòng)物數(shù)至10重復(fù)兩次無死亡，即可確定LD50。鑒于已有研究顯示菌體蛋白在小鼠LD50≥20 g/kg·bw （趙葉，2009），結(jié)合前期預(yù)試驗(yàn)的劑量探索，為進(jìn)一步精確LD50范圍， 大、 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)參考GB15193.3-2014（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，2014）采用限量法， 即給予動(dòng)物最大使用濃度和最大灌胃容量的MBM 溶液，由于大、小鼠的最大灌胃容量分別為4 mL/200 g·bw 和0.4 mL/20 g·bw，而其常用的單次灌胃容量分別為2 mL/200 g·bw 和0.4 mL/20 g·bw， 因此大鼠分兩次灌胃給予MBM 混懸液。 盡管MBM 在水中具有較好的溶解性，但其水溶液很快產(chǎn)生沉淀， 為在正式試驗(yàn)時(shí)劑量足夠準(zhǔn)確，使用0.5%羧甲基纖維素鈉制備混懸液，濃度為0.5 g/mL。 通過急性毒性試驗(yàn)確定LD50時(shí)，死亡動(dòng)物數(shù)為其主要依據(jù)（孫明杰等，2022），試驗(yàn)中因灌胃操作不當(dāng)導(dǎo)致給藥組一只小鼠死亡， 未及時(shí)補(bǔ)充動(dòng)物或提前增加備用動(dòng)物， 這是本研究的設(shè)計(jì)缺陷之一。 由于前期預(yù)試驗(yàn)采用正式試驗(yàn)相同的劑量，動(dòng)物死亡率為0/4，因此該小鼠的死亡并未對結(jié)果的判定產(chǎn)生影響。試驗(yàn)期間，其他動(dòng)物均未出現(xiàn)中毒反應(yīng)和死亡， 且大體剖檢各組織器官均未見病變， MBM 在大、小鼠的LD50均≥10 g/kg·bw?！东F藥急性毒性試驗(yàn)（LD50測定）指導(dǎo)原則》中并未要求設(shè)置溶媒對照組， 本研究在急性毒性試驗(yàn)中大、小鼠各設(shè)置相同動(dòng)物數(shù)的對照組，旨在排除由試驗(yàn)操作等引起的誤差， 并獲得體重?cái)?shù)據(jù)為后期試驗(yàn)提供參考， 體重在本研究中不作為判定毒性的指標(biāo)，因此不在本文中呈現(xiàn)。

亞慢性毒性試驗(yàn)中， 飼料中MBM 添加量為1%、2.5%和5%，飼喂大鼠90 d，各劑量組動(dòng)物均未出現(xiàn)中毒表現(xiàn)，表現(xiàn)出良好的耐受。 試驗(yàn)期間，雄性大鼠中、 高劑量組個(gè)別周期體重顯著高于對照組，相關(guān)性分析結(jié)果顯示除差異顯著的周期外，另有部分周期與MBM 飼料添加濃度呈正相關(guān)；與雄性相近，雌性大鼠自第3 周至第13 周，體重均顯著高于對照組， 且與MBM 飼料添加濃度呈正相關(guān)。 由此可見，在5%濃度范圍內(nèi)，大鼠部分生長周期體重隨MBM 飼料添加濃度增加而增加，且這一現(xiàn)象在雌性大鼠更為突出。一項(xiàng)對日糧蛋白質(zhì)水平的研究表明， 日糧蛋白質(zhì)水平的提高增加了生長期大鼠對飼料的轉(zhuǎn)化效率， 從而使大鼠體重增加（劉闖，2014），由此推測本研究中動(dòng)物體重的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異可能與MBM 較高的蛋白含量有關(guān)，伴隨動(dòng)物體重增加，部分組別平均攝食和飲水量的存在顯著差異，與MBM 毒性無關(guān)，為正常生理現(xiàn)象。 本研究未在空白對照組以外設(shè)置與高劑量組飼料蛋白質(zhì)水平相當(dāng)?shù)膶φ战M， 為本研究的設(shè)計(jì)缺陷之二。 血液學(xué)和血液生化指標(biāo)僅雄性大鼠給藥中期LYM 存在顯著差異，但未呈劑量相關(guān)性且至末期差異即不存在， 同時(shí)該值在Wistar大鼠的參考值范圍內(nèi)（錢江等，2018）。 試驗(yàn)中期雌、 雄性大鼠三個(gè)劑量組個(gè)別臟器的臟器系數(shù)與對照組相比存在差異，但至末期差異已不存在；雌性大鼠至試驗(yàn)?zāi)┢冢?高劑量組肝和低劑量組腎與對照組比較存在差異，病理學(xué)檢查和反映肝、腎功能血液生化指標(biāo)均未提示該差異與MBM 毒性有關(guān)，推測為動(dòng)物生理狀況差異所致。以上指標(biāo)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果結(jié)合對照組和高劑量組中大體剖檢和組織病理學(xué)檢查，表明MBM 1%、2.5%和5%添加于飼料，連續(xù)飼喂Wistar 大鼠90 d，各劑量組均未出現(xiàn)明顯的毒性作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)劑量條件下，急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，MBM 在大、 小鼠的LD50均≥10 g/kg·bw， 根據(jù)WTO 有關(guān)外源性化學(xué)物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，屬實(shí)際無毒；亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，添加5%MBM 于飼料中連續(xù)飼喂大鼠90 d， 未觀察到明顯的有害作用，無作用劑量至少達(dá)到3100 mg/kg·bw。 MBM 作為飼料添加劑使用基本安全。