利剛慧， 劉俊杰， 彭帥英 ， 梁穎茵， 鄢陸琪， 李昆太

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088；2.江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，江西南昌 330045）

角蛋白是動物毛發(fā)和甲角的主要成分， 其是自然界中繼纖維素類和甲殼素類之后產(chǎn)量第三大的蛋白質(zhì)類有機聚合物（Bealer 等，2020）。角蛋白富含各類氨基酸，除高達10% ～14%的半胱氨酸外，還含有精氨酸、絲氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸等必需氨基酸（Hassan 等，2020）。 國外將來自家禽加工廠和屠宰場的羽毛、毛發(fā)和其他角化副產(chǎn)品歸類為第三類動物副產(chǎn)品，這意味著它們屬于對人體和動物健康風險程度較低的原材料（Verma，2017）。 因此，角蛋白被視為潛在的優(yōu)良蛋白質(zhì)或氨基酸資源，可資源化應用于飼料、肥料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)。

由于角蛋白分子富含相互交聯(lián)的二硫鍵、氫鍵以及疏水氨基酸，致使其結(jié)構(gòu)極為致密，不僅不溶于水、弱酸、有機溶劑，而且不易被胰蛋白酶或胃蛋白酶等常規(guī)蛋白水解酶水解， 給其資源化利用帶來極大困難（De Oliveira 等，2020）。目前工業(yè)降解角蛋白的方式主要有高溫高壓水解法、 酸堿水解法和物理膨化法，但這些方法存在能耗高、氨基酸營養(yǎng)損失大和環(huán)境二次污染等諸多缺點（Lazarus 等，2021）。 角蛋白酶系一種可特異性降解角蛋白的酶類，不僅綠色環(huán)保、經(jīng)濟實用，而且不會破壞氨基酸的天然結(jié)構(gòu)， 在角蛋白降解領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應用潛力和生態(tài)價值（Srivastava等，2020）。 角蛋白酶產(chǎn)生菌的來源與分布十分廣泛，在細菌、放線菌和真菌中均發(fā)現(xiàn)有角蛋白酶的產(chǎn)生（Gupta 等，2006）。 目前發(fā)現(xiàn)的角蛋白酶大多產(chǎn)于細菌，其中以芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）為主，如地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）、解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）和蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）等（Su 等，2020；Li 等，2019）。

然而，產(chǎn)量低、活性差、性質(zhì)弱一直是制約角蛋白酶工業(yè)化生產(chǎn)和應用的問題 （蔣少龍等，2019）。 尤其是野生型產(chǎn)角蛋白酶菌株的酶表達量不高（胡洪，2013），難以滿足工業(yè)化所需。近年來， 隨著分子生物學和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，研究學者們對角蛋白酶的分子研究主要集中在角蛋白酶的異源表達和角蛋白酶分子改造兩個方面，極大促進了角蛋白酶穩(wěn)定性和產(chǎn)量的提高（Su 等，2020）。 目前已報道的用于角蛋白酶異源表達的宿主菌主要有大腸桿菌、芽孢桿菌和畢赤酵母等。 其中，枯草芽孢桿菌因其具有完整的蛋白質(zhì)折疊分泌機制，且在表達來源于芽孢桿菌屬的角蛋白酶基因時不存在密碼子偏好性問題，在異源表達角蛋白酶方面有著得天獨厚的優(yōu)勢（Liu 等，2014）。 例如，Peng 等（2020）將來源于地衣芽孢桿菌BBE11-1 （B.licheniformis BBE11-1)的角蛋白酶基因KerZ1 在枯草芽孢桿菌WB600中分泌表達， 并通過優(yōu)化工程菌在15-L 罐上發(fā)酵產(chǎn)酶的溫度、pH、溶氧、補料等過程參數(shù)，使得重組角蛋白酶KerZ1 的酶活達到426.60 KU/mL，較原始菌株的角蛋白酶酶活（120.1 U/mL）提高了3552 倍。 Yang 等（2015）將來源于解淀粉芽孢桿菌K11（B.amyloliquefaciens K11）的角蛋白酶基因KerK 在不能降解羽毛的枯草芽孢桿菌SCK6 中進行表達， 重組表達角蛋白酶基因的枯草芽孢桿菌能在24 h 內(nèi)完全降解羽毛。 Gong 等（2020） 采用aprE 啟動子將角蛋白酶基因kerBv在枯草芽孢桿菌中進行異源表達，其酶活性提高了15 倍左右。 本研究以自主構(gòu)建的角蛋白酶kerJY-23 分泌表達工程菌枯草芽孢桿菌WB600為研究對象，對其產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，旨在為該重組角蛋白酶工業(yè)化降解角蛋白提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1.1 菌株 重組角蛋白酶工程菌枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23，由本實驗室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 主要試劑和儀器 5%可溶性角蛋白購自東京化成工業(yè)株式會社；LB 肉湯購自北京陸橋技術(shù)有限公司； 酵母浸膏購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司； 福林酚試劑購自上海源葉生物科技有限公司；卡那霉素購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、氯化鈉等化學試劑均購自上海麥克林生化科技有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-100A）：上海云泰儀器儀表有限公司；電熱恒溫水槽（SSW-420-2S）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；上海雷磁pH 計（PHS-3C）：上海儀電科學儀器股份有限公司；恒溫振蕩器（HZQ-X500C）：上海一恒科技有限公司；紫外可見分光光度計（UV-5500PC）：上海元析儀器有限公司；高速冷凍離心機（KDC-160HR）：安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容至1 L，pH（7.0±0.2）。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g，蛋白胨20 g，K2HPO41.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.025 g，CaCl20.025 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.015 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.4 ～7.6，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2 試驗方法

然而，用哺乳動物瘦素處理銀大馬哈魚(Oncorhynchus kisutch)[39]、鯰(Ictalurus punctatus)[40]和綠海魴(Lepomis cyanellus)[27]，卻不改變它們的攝食行為或能量代謝。

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子制備： 取出于甘油中-80 ℃凍存的枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 菌液，先后于-20 ℃和4 ℃解凍，吸取200 μL 接種于50 mL LB 液體培養(yǎng)基 （含50 μg/mL 卡那霉素）中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h 獲得種子液。

初始發(fā)酵條件： 以2% 接種量接種重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 種子液于裝量為50 mL 初始發(fā)酵培養(yǎng)基 （含50 μg/mL 卡那霉素） 的250 mL 三角瓶中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 角蛋白酶活性的測定 參考Yamamura 等（2002）的測定方法并進行適當修改，使用1% 的可溶性角蛋白 （在50 mmol pH 8.0 的Tris-HCl中稀釋）作為底物來測定角蛋白酶活性。向1 mL底物中加入1 mL 適當稀釋的粗酶液， 在60 ℃下孵育20 min。 加入2 mL 0.4 mol/L 的三氯乙酸終止反應，以12000 r/min 離心5 min，收集上清液1 mL 至試管中，加入1 mL 福林酚試劑和5 mL 0.4 mol/L Na2CO3，混勻后置于60 ℃水浴中孵育20 min，測定660 nm 處的吸光度。 對于空白對照的測定，1 mL 菌液先加入2 mL 0.4 mol/L TCA使酶失活，再加入1 mL 1%可溶性角蛋白。 試驗結(jié)果為多組試驗的平均值。 酶活定義：在上述反應條件下，660 nm 下吸光度值每增加0.01 定義為一個酶活力單位（U/mL）。

1.2.3 單因素試驗優(yōu)化產(chǎn)酶條件 培養(yǎng)基組分的單因素優(yōu)化： 通過改變發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的單一組分， 研究不同組分對菌株發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響。其中，碳源種類的優(yōu)化分別采用濃度為50 g/L的葡萄糖、蔗糖、葡萄糖：蔗糖（25：25 g/L）、麥芽糖、可溶性淀粉；有機氮源種類的優(yōu)化分別采用濃度為20 g/L 的酵母浸膏、牛肉膏、蛋白胨、玉米漿粉、 黃豆餅粉； 硫酸銨添加濃度的優(yōu)化分別采用0、2.5、5、7.5、10、12.5 g/L；金屬離子的優(yōu)化分別采用添加濃度為0.05 g/L 的K+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+。

發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化： 分別考察不同發(fā)酵溫度 （29、33、37、41、45 ℃）、 培養(yǎng)基初始pH（6、6.5、7、7.5、8 和8.5）、裝液量（250 mL 三角瓶中分別裝有40、45、50、55、60、65 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基）、接種量（2%、4%、6%、8%和10%）、搖床轉(zhuǎn)速（140、160、180、200、220 r/min）、發(fā)酵周期（12、24、36、48 h）對菌株發(fā)酵產(chǎn)角蛋白的影響。

1.2.4 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗 以發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，對葡萄糖：蔗糖（X1）、酵母浸膏（X2）、硫酸銨（X3）、MnCl2（X4）四個因素進行4 因素5 水平的二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗， 用以優(yōu)化菌株產(chǎn)角蛋白酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。 試驗因素水平及編碼如表1 所示。

表1 二次通用旋轉(zhuǎn)組合的試驗設(shè)計因素與水平 g/L

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進行處理，Origin 2021 軟件進行作圖分析， 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計的試驗結(jié)果分析均在DPS 數(shù)據(jù)處理軟件上運行， 試驗中各產(chǎn)酶條件的優(yōu)化均為3次平行試驗， 結(jié)果以3 次試驗的 “平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 碳源對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖1 可知，當葡萄糖和蔗糖復配時對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶促進作用最大。 根據(jù)不同碳源的酶活力差異性分析， 對其大小進行排序為葡萄糖：蔗糖＞葡萄糖＞可溶性淀粉＞蔗糖＞麥芽糖。 單一的蔗糖和麥芽糖作碳源時產(chǎn)酶酶活相對較小，不適合作培養(yǎng)基中的碳源，因而選擇葡萄糖和蔗糖復配作為該菌發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的碳源。

圖1 碳源種類對枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.1.2 有機氮源對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖2 可見， 酵母浸膏作為氮源時， 重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶酶活最高。根據(jù)不同氮源的酶活力差異性分析， 對其大小進行排序為酵母浸膏＞玉米漿粉＞蛋白胨＞牛肉膏＞黃豆餅粉。 其中，黃豆餅粉作為氮源時角蛋白酶的表達量最低， 這可能是由于黃豆餅粉為遲效氮源，導致菌株生長代謝較緩慢，從而使得產(chǎn)酶較低。 因而， 選取酵母浸膏作為重組枯草芽孢桿菌WB600 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的有機氮源。

圖2 有機氮源種類對枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.1.3 硫酸銨添加量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖3 可見，隨著硫酸銨添加量的提高，發(fā)酵所產(chǎn)的角蛋白酶酶活逐漸增加，當硫酸銨添加量為10 g/L時，角蛋白酶產(chǎn)酶量最大。 當硫酸銨添加量進一步增大至12.5 g/L，角蛋白酶的酶活出現(xiàn)明顯下降。因此，重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的最佳硫酸銨添加量為10 g/L。

圖3 硫酸銨添加量對枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.1.4 金屬離子對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖4 可見，當培養(yǎng)基添加氯化錳時，發(fā)酵所產(chǎn)的角蛋白酶酶活最高。 根據(jù)不同金屬離子的酶活力差異性分析，對其大小進行排序為Mn2+＞K+＞Fe3+＞Zn2+＞Cu2+，而添加硫酸銅則會對菌株產(chǎn)酶有抑制作用。 金屬離子一般作為輔酶成分或充當輔酶功能（丁莉莉，2017），添加氯化錳顯著提高了重組枯草芽孢桿菌WB600 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的酶活，但是額外添加硫酸鋅會抑制角蛋白酶產(chǎn)酶， 這與Arokiyaraj 等（2019）的報道相似。

圖4 金屬離子對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 接種量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 圖5 表明，接種量為2% ～6%時，菌株所產(chǎn)的角蛋白酶與接種量呈正相關(guān)， 繼續(xù)增大接種量則導致角蛋白酶產(chǎn)量明顯下降。 當接種量為6%時，重組角蛋白酶的酶活達到最大值。 接種量太少，細胞生長延滯，酶的合成受到影響；而接種量過高時，前期細胞生長迅速，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，后期供需不足從而會影響酶的合成（Lu 等，2020）。因此，重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的最佳接種量確定為6%。

圖5 接種量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.2.2 裝液量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖6 可知，在發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為45 mL/250 mL 時，重組角蛋白酶的酶活達到最高值。裝液量會影響到搖瓶發(fā)酵的供氧狀況， 在重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的過程中， 隨著裝液量不斷增大，通氣和溶氧隨之減小，從而導致角蛋白酶的合成因氧供應不足而受到抑制。

圖6 裝液量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.2.3 發(fā)酵時間對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖7 可見， 隨著發(fā)酵時間的延長， 重組枯草芽孢桿菌WB600 所產(chǎn)角蛋白酶的酶活先升高而后降低，在第36 h 時所產(chǎn)酶活最高。 發(fā)酵時間過長，由于發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)耗竭，導致菌體產(chǎn)生自溶并且累積有害代謝產(chǎn)物，反而使得角蛋白酶酶活有所下降。

圖7 發(fā)酵時間對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.2.4 發(fā)酵溫度對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖8 可知，溫度在37 ℃以下時，隨溫度上升酶活逐漸提高，在37 ℃時酶活達到最大。 但是當溫度繼續(xù)升高時，由于超過了重組枯草芽孢桿菌WB600 的最適生長溫度，菌株生長代謝受阻，導致角蛋白酶的酶活力迅速下降。 因此， 重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的最適溫度為37 ℃。

圖8 發(fā)酵溫度對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.2.5 初始pH 對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖9 可知，pH 從6 ～8 的過程中，酶活隨著pH 的升高而逐漸增大，pH 繼續(xù)升高， 菌株產(chǎn)酶活力有所下降。 在pH 8 時，菌株產(chǎn)酶量達到最高酶活。 大多數(shù)細菌產(chǎn)角蛋白酶的最適pH 在中性或者略偏堿性，這與之前報道的Pseudomonas sp.LM19 在pH 8 時產(chǎn)酶最高相似（Mohamad 等，2017）。

圖9 初始pH 對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.2.6 搖床轉(zhuǎn)速對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖10 可知，在搖床轉(zhuǎn)速為140 ～200 r/min 時，重組枯草芽孢桿菌WB600 產(chǎn)酶酶活隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高而增大。 在200 r/min 的搖床轉(zhuǎn)速下，角蛋白酶的酶活達到最高，繼續(xù)加大轉(zhuǎn)速至220 r/min，酶活反而有所下降。在發(fā)酵過程中，轉(zhuǎn)速會影響物質(zhì)和溶解氧的交換， 在轉(zhuǎn)速為140 ～200 r/min 時，轉(zhuǎn)速不斷增大使發(fā)酵溶氧和物質(zhì)交換增加， 菌株產(chǎn)酶能力增強；當轉(zhuǎn)速增大至220 r/min 后，剪切力也隨轉(zhuǎn)速的增加而增大， 制約了菌株生長和產(chǎn)酶（劉婕，2013）。 因此，重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的最佳轉(zhuǎn)速為200 r/min。

圖10 搖床轉(zhuǎn)速對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的二次通用旋轉(zhuǎn)正交組合優(yōu)化與驗證 重組枯草芽孢桿菌WB600 發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖：蔗糖（X1）、酵母浸膏（X2）、硫酸銨（X3）、MnCl2（X4）等組分的二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗及其結(jié)果如表2 所示，方差分析結(jié)果如表3 所示。

表2 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗方案及結(jié)果

表3 試驗結(jié)果方差分析表

根據(jù)表2 所示的試驗結(jié)果， 以角蛋白酶活為響應值進行多元回歸擬合， 得到回歸方程：Y=1392.51+73.42X1-124.81X2+86.59X3+100.92X4-141X12+12.21X22+115.80X32+12.15X42+203.96X1X2-174.46X1X3-36.63X1X4。

回歸方程中Y 表示角蛋白酶活（U/mL），X1、X2、X3、X4分別表示葡萄糖：蔗糖、酵母浸膏、硫酸銨、MnCl2在培養(yǎng)基中的濃度（g/L）。

根據(jù)試驗結(jié)果進行方差分析可知， 回歸方程失擬性檢驗F1=3.20＜F0.05（5，3）=5.41，差異不顯著，而顯著性檢驗F2=14.74＞F0.05（11，8）=2.95，回歸方程顯著。 這說明該模型擬合度較好； 在α=0.10 顯著水平剔除不顯著項后， 簡化后的回歸方程為：Y=1392.51+73.42X1-124.81X2+86.59X3+100.92X4-141X12+115.80X32+203.96X1X2-174.46X1X3。

2.4 數(shù)學模型的應用分析

2.4.1 單因素分析 根據(jù)表4 和圖11 對單因子試驗分析，碳源對酶活的影響最大，其次為硫酸銨添加量、酵母浸膏，氯化錳添加量影響最小。 隨著葡萄糖和蔗糖復配添加量的增加， 酶活呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。

圖11 各單因子與角蛋白酶酶活關(guān)系圖

表4 單因子效應分析

2.4.2 產(chǎn)酶優(yōu)化與驗證 根據(jù)上述分析，在95%置信區(qū)間的優(yōu)化方案為： 葡萄糖24.95 ～26.15 g/L，蔗糖24.95 ～26.15 g/L， 酵母浸膏18.3 ～20.35 g/L，硫酸銨9.78 ～10.53 g/L， 氯化錳0.05 ～0.06 g/L（表5）。 考慮到實際操作及試劑成本的情況下，將優(yōu)化方案定為葡萄糖25 g/L，蔗糖25 g/L，酵母浸膏20 g/L，氯化錳0.05 g/L。 對此方案進行試驗驗證，得到酶活為（2110.33±15.011）U/mL，較優(yōu)化前提高了5.10 倍。

表5 各變量取值頻率分布

3 結(jié)論

本研究對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。 在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方（葡萄糖25 g/L，蔗糖25 g/L，酵母浸膏20 g/L，硫酸銨10 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，氯化鈉0.3 g/L，氯化鈣0.025 g/L， 硫酸鎂0.025 g/L， 硫酸亞鐵0.015 g/L，氯化錳0.05 g/L）和發(fā)酵條件（培養(yǎng)基初始pH 8， 裝液量45 mL/250 mL 三角瓶， 接種量6%，培養(yǎng)溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵周期36 h）下，重組枯草芽孢桿菌WB600 所產(chǎn)的角蛋白酶活性達到（2110.33±15.011）U/mL，較優(yōu)化前提高了5.10 倍。 本研究通過培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的優(yōu)化，提高了重組枯草芽孢桿菌WB600 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的酶活， 為該酶后續(xù)應用于角蛋白資源的高值化利用提供了一定的理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。