郭潔，田春陽，夏永欣

作者單位：南陽市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 南陽473000

結(jié)直腸癌是臨床位居第三的常見惡性腫瘤，近年來由于人們生活方式及飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1-2］。雖然醫(yī)療技術(shù)在不斷提高，但對(duì)于結(jié)直腸癌病人5年生存率并沒有太大改善，而影響結(jié)直腸癌病人預(yù)后的主要原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［3-4］。因此，尋找影響疾病發(fā)生與發(fā)展的指標(biāo)對(duì)于改善病人預(yù)后，減少復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有重要意義。中心體相關(guān)蛋白55（centrosome-associated protein 55，CEP55）是卷曲螺旋蛋白家族成員，能夠起到調(diào)控細(xì)胞周期的作用［5］。研究顯示CEP55 mRNA和蛋白表達(dá)在食管鱗狀細(xì)胞癌中明顯升高，CEP55高表達(dá)病人較CEP55低表達(dá)病人預(yù)后更差［6］。睪丸表達(dá)基因14（testis expressed gene 14，TEX14）是在睪丸中鑒定表達(dá)的一個(gè)基因，其高表達(dá)與侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人的不良預(yù)后有關(guān)［7］。但CEP55、TEX14在結(jié)直腸癌中的作用及與病人預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究通過檢測(cè)結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中CEP55、TEX14 mRNA和蛋白表達(dá)情況，分析與病人臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年10月至2016年10月在南陽市中心醫(yī)院行手術(shù)治療的78例結(jié)直腸癌病人癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織作為研究對(duì)象。病人男40例，女38例；年齡范圍為40～80歲，年齡（62.33±7.92）歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期50例；腫瘤長徑（2.92±1.60）cm；分化類型：高分化26例，中分化30例，低分化22例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)診斷確診為結(jié)直腸癌病人；②未接受過放化療者；③臨床資料完整，病人或其近親屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有免疫系統(tǒng)疾病者；②合并其他部位腫瘤者；③合并其他消化道疾病者。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫分析 利用Ualcan數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）分析CEP55和TEX14在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法檢測(cè)CEP55和TEX14 mRNA表達(dá) 按照Trizol試劑盒（深圳輝諾生物科技有限公司）中的方法提取結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海博爾森生物科技有限公司）中的方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA。CEP55和TEX14 mRNA均以β-action作為內(nèi)參進(jìn)行分析，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，見表1。反應(yīng)條件為95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，40個(gè)循環(huán)。計(jì)算Ct值，并根據(jù)公式2-ΔΔCt對(duì)CEP55和TEX14 mRNA進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 免疫組化染色法檢測(cè)CEP55和TEX14蛋白表達(dá) 將術(shù)中切除的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織使用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切成5 μm片狀。以下步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，經(jīng)過脫蠟和水化后，進(jìn)行微波煮沸將抗原修復(fù)，滴入封閉液，分別加入CEP55和TEX14蛋白第一抗體（1∶200稀釋），在4 ℃下孵育過夜，經(jīng)PBS沖洗，之后加入生物素標(biāo)記的第二抗體（1∶100稀釋），在37 ℃下孵育30 min，PBS緩沖液沖洗，DAB染色，顯色后用自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，自來水沖洗反藍(lán)，二甲苯脫水，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野觀察染色情況和陽性細(xì)胞占比。用CEP55和TEX14蛋白的陽性病理切片做陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.4 判定結(jié)果 由病理科兩位醫(yī)生使用雙盲法在顯微鏡下觀察各張染色切片結(jié)果，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)分。CEP55與TEX14蛋白陽性表達(dá)均主要為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色均勻顆粒。①根據(jù)陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。0分為無著色；1分為淡黃色染色；2分為棕黃色染色；3分為棕褐色染色。②根據(jù)陽性細(xì)胞著色百分比進(jìn)行評(píng)分。陽性細(xì)胞占比0～5%記0分；陽性細(xì)胞占比＞5%～25%記1分；陽性細(xì)胞占比＞25%～50%記2分；陽性細(xì)胞占比＞50%～75%記3分；陽性細(xì)胞占比＞75%記4分。綜合評(píng)分=陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞著色所占百分比，綜合評(píng)分≤3分表達(dá)為陰性，綜合評(píng)分＞3分表達(dá)為陽性［8］。

1.3 隨訪觀察 對(duì)所有結(jié)直腸癌病人進(jìn)行為期5年的隨訪，采用門診復(fù)查及電話隨訪的方式，截至2021年10月31日，其中第1年3個(gè)月隨訪1次，第2～3年6個(gè)月隨訪1次，第4～5年1年隨訪1次，分析不同CEP55和TEX14蛋白的表達(dá)情況與結(jié)直腸癌病人生存率的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。不同CEP55和TEX14蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌病人生存率的關(guān)系以Kaplan-Meier法進(jìn)行分析，行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)；影響結(jié)直腸癌病人預(yù)后的因素以Cox回歸模型進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ualcan數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果 Ualcan數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中CEP55和TEX14表達(dá)量均明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Ualcan數(shù)據(jù)庫結(jié)直腸癌組織中CEP55和TEX14表達(dá)分析結(jié)果：A為CEP55表達(dá)；B為TEX14表達(dá)

2.2 CEP55和TEX14 mRNA在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況 qRT-PCR結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中CEP55和TEX14 mRNA水平均明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。見表2。

表2 CEP55和TEX14 mRNA在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況/

表2 CEP55和TEX14 mRNA在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況/

組別結(jié)直腸癌組織癌旁組織t值P值例數(shù)78 78 CEP55 mRNA 2.34±0.70 1.00±0.26 15.34＜0.001 TEX14 mRNA 1.57±0.44 0.98±0.25 10.42＜0.001

2.3 CEP55和TEX14蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示，CEP55和TEX14蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，見圖2。CEP55和TEX14蛋白在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織中CEP55和TEX14蛋白的陽性表達(dá)率（P＜0.05）。見表3。

圖2 CEP55和TEX14蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)（免疫組化染色×400）：A為結(jié)直腸癌組織中CEP55；B為癌旁組織中CEP55；C為結(jié)直腸癌組織中TEX14；D為癌旁組織中TEX14

表3 CEP55和TEX14蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況/例（%）

2.4 結(jié)直腸癌組織中CEP55和TEX14蛋白表達(dá)與病人臨床病理特征的關(guān)系 CEP55和TEX14蛋白表達(dá)與病人性別、年齡、部位、病理類型、腫瘤長徑、腫瘤形態(tài)無關(guān)（P＞0.05），與分化類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、有無神經(jīng)浸潤、有無肝轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。見表4。

2.5 CEP55和TEX14蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌病人5年生存率的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中CEP55蛋白陽性病人生存率為52.73%（29/55），明顯低于CEP55蛋白陰性病人生存率78.26%（18/23）（χ2=4.44，P=0.035）；TEX14蛋白陽性病人生存率為52.63%（30/57），明顯低于TEX14蛋白陰性病人生存率80.95%（17/21）（χ2=5.43，P=0.020）。

2.6 影響結(jié)直腸癌病人5年預(yù)后的因素分析 低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、CEP55蛋白陽性、TEX14蛋白陽性是影響結(jié)直腸癌病人5年預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表5。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，飲食及生活習(xí)慣的改變可促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展［9-10］。目前，結(jié)直腸癌的治療措施有手術(shù)、放化療及靶向治療等，但對(duì)預(yù)后的改變并不理想［11-12］。這主要與結(jié)直腸癌晚期發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［13］。因此尋找與結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物，可能對(duì)提高病人生存率有幫助。

CEP55是一種調(diào)節(jié)蛋白，參與著紡錘體的裝配，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用［14］。李志強(qiáng)等［15］對(duì)124例宮頸癌病人進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CEP55在宮頸癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，且隨著臨床分期，疾病的惡化，其高表達(dá)率逐漸上升。Lin等［16］研究報(bào)道，CEP55在結(jié)直腸癌組織和腫瘤細(xì)胞中均上調(diào)。本研究對(duì)78例結(jié)直腸癌病人進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中CEP55 mRNA水平和蛋白表達(dá)陽性率均明顯高于癌旁組織，與Lin等［16］結(jié)果基本一致，且與本研究Ualcan數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致，提示CEP55可能參與結(jié)直腸癌發(fā)病。進(jìn)一步分析結(jié)直腸癌病人病理特征，發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移、低分化、Ⅲ～Ⅳ期、有神經(jīng)浸潤病人CEP55蛋白表達(dá)陽性率升高，提示CEP55蛋白陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌的進(jìn)展密切相關(guān)。Wu等［17］研究報(bào)道，肺腺癌組織中CEP55表達(dá)水平較相鄰正常組織高，且CEP55表達(dá)與肺腺癌病人預(yù)后獨(dú)立相關(guān)。Huang等［18］研究表明，與CEP55低表達(dá)的有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌病人相比，CEP55高表達(dá)病人具有更低的5年生存率。本研究對(duì)結(jié)直腸癌病人進(jìn)行5年生存分析，發(fā)現(xiàn)CEP55蛋白陽性病人5年生存率明顯低于CEP55蛋白陰性病人，與Huang等［18］結(jié)果類似，提示CEP55表達(dá)水平可能與結(jié)直腸癌病人預(yù)后相關(guān)。

TEX14基因位于染色體17q22，含有35個(gè)外顯子，在細(xì)胞有絲分裂中發(fā)揮著重要作用［19］。TEX14是一種無活性的激酶，在生殖細(xì)胞中充當(dāng)CEP55的內(nèi)源性抑制劑，以阻止細(xì)胞脫落，從而形成合胞體［20］。畢乙超等［7］研究結(jié)果顯示，TEX14在乳腺癌中呈高表達(dá)，并且可促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。本研究Ualcan數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中TEX14表達(dá)量明顯高于癌旁組織，且通過qRT-PCR和免疫組化檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中TEX14 mRNA水平及蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織，與畢乙超等［7］研究類似，提示高水平的TEX14可能與結(jié)直腸癌發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TEX14蛋白表達(dá)與分化類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、有無神經(jīng)浸潤、有無肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示TEX14可能促進(jìn)結(jié)直腸癌病人病情進(jìn)展。生存分析結(jié)果顯示，TEX14蛋白陰性病人具有較高的5年生存率，提示TEX14表達(dá)與結(jié)直腸癌病人預(yù)后有一定關(guān)系。此外，本研究進(jìn)行了Cox回歸模型分析，結(jié)果顯示低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、CEP55蛋白陽性、TEX14蛋白陽性是影響結(jié)直腸癌病人5年預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示臨床除需關(guān)注結(jié)直腸癌病人常見預(yù)后指標(biāo)外，還需關(guān)注CEP55、TEX14表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響。

綜上所述，CEP55和TEX14在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，且CEP55和TEX14蛋白陽性病人5年生存率低于陰性病人，有望成為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌病人預(yù)后的有效指標(biāo)。但由于本研究樣本量較少，對(duì)于CEP55和TEX14表達(dá)是否受其他因素影響，需要進(jìn)一步研究。