宋奇鋒，高良輝，林師佈，張譯中，沈立

作者單位：海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，海南 ?？?70100

肝癌是在全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的致命惡性腫瘤，而在所有的肝癌病人中，超過(guò)90%為肝細(xì)胞癌［1］。盡管近年來(lái)由于治療方法的改進(jìn)有效地降低了肝癌的發(fā)病率，但肝癌病人的長(zhǎng)期預(yù)后仍不理想［2］。因此，探索有效的生物標(biāo)志物對(duì)于改善肝癌的預(yù)后具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸。雖然LncRNA不具備蛋白質(zhì)編碼能力，但它們?cè)诒碛^遺傳學(xué)和調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面具有重要作用［3］。已證實(shí)LncRNA參與腦發(fā)育、胚胎發(fā)育、組織學(xué)分化和器官發(fā)生，且已有大量研究表明LncRNA還參與了癌癥中許多復(fù)雜的細(xì)胞過(guò)程［4］。例如，LncRNA人去泛素化酶含有卵巢腫瘤結(jié)構(gòu)域的6B反義RNA1（OTUD6B-AS1）被證實(shí)在肝癌中高表達(dá)［5］，然而，其在肝癌預(yù)后中的作用仍不清楚。微RNA（miRNA）是基因表達(dá)過(guò)程中重要調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等過(guò)程，其在癌癥中功能已得到普遍認(rèn)可。miR-365a-3p在多種類型癌癥中具有抑癌作用，已有研究表明miR-365a-3p能夠通過(guò)靶向抑制E2F2表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖［6］；且另有研究認(rèn)為，miR-365a-3p可作為肝細(xì)胞癌的預(yù)后生物標(biāo)志物［7］。本研究通過(guò)Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得出miR-365a-3p可能與LncRNA OTUD6B-AS1存在靶向關(guān)系。于是，在本研究中首先對(duì)肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而評(píng)估了其表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性，以期為肝癌病人做出最佳的臨床治療決策提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2015年3月至2017年3月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的肝癌病人86例（肝癌病人組），和同期體檢的健康志愿者86例（健康對(duì)照組）。其中肝癌病人組男性54例，女性32例，年齡（55.32±5.38）歲。健康對(duì)照組男性48例，女性38例，年齡（54.25±4.86）歲。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。另外，收集整理肝癌病人腫瘤長(zhǎng)徑、TNM分期等臨床病理特征資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）》［8］中診斷標(biāo)準(zhǔn)；②具備手術(shù)指征，行手術(shù)切除，術(shù)后經(jīng)病理確診為肝細(xì)胞癌；③病人入組前未接受過(guò)靶向治療等相關(guān)治療項(xiàng)目；④病人或其近親屬在充分了解研究目的和過(guò)程后簽署知情同意書(shū)；⑤臨床資料均完整，且獲得長(zhǎng)期隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤；②患有腎臟疾??；③入院前感染；④合并嚴(yán)重的心腦功能障礙；⑤不愿配合后續(xù)研究；⑥有免疫缺陷。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 血清及組織樣品收集 采集所有研究對(duì)象的外周血（5 mL），靜置30 min，然后在3 000 r/min和25 ℃下離心10 min，收集血清用于后續(xù)檢測(cè)。收集術(shù)中切除的肝癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織，立即置于液氮中，隨后放置在-80 ℃貯存。

1.3 血清及組織中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達(dá)檢測(cè) RNA分離試劑盒（15596018，美國(guó)Invitrogen）從血清樣本及組織樣本中提取總RNA。按照TransScript Green兩步qRT-PCR Super-Mix試劑盒（AQ201-01，北京TransGen Biotech）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并在StepOne? Real-Time PCR系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystems）上進(jìn)行LncRNA OTUD6BAS1、miR-365a-3p表達(dá)檢測(cè)。以β-actin或U6為內(nèi)參使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 生物信息學(xué)分析 使用Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p之間的靶向關(guān)系進(jìn)行分析。

1.5 隨訪 隨訪5年，采用電話、微信隨訪，來(lái)院復(fù)查形式進(jìn)行定期隨訪，獲取疾病情況及生存資料，隨訪截止2022年4月30日，記錄術(shù)后5年累積生存時(shí)間，即術(shù)后第1天至死亡時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。GraphPad prism7用于繪制圖像。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組件比較采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間比較為獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)。Pearson分析血清中LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p表達(dá)的相關(guān)性。以Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并通過(guò)log-rank檢驗(yàn)比較生存率差異。Cox回歸模型分析肝癌病人預(yù)后的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清及組織中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達(dá)水平比較 肝癌病人組血清LncRNA OTUD6B-AS1表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，miR-365a-3p表達(dá)水平低于健康對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組血清LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達(dá)水平比較/

表2 兩組血清LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達(dá)水平比較/

組別健康對(duì)照組肝癌病人組t值P值例數(shù)86 86 LncRNA OTUD6B-AS1 1.02±0.32 1.59±0.41 10.16＜0.001 miR-365a-3p 1.05±0.26 0.42±0.15 19.46＜0.001

肝癌組織LncRNA OTUD6B-AS1表達(dá)水平高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，miR-365a-3p表達(dá)水平低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 肝癌病人肝組織LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達(dá)水平比較/

表3 肝癌病人肝組織LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達(dá)水平比較/

組別癌旁組織肝癌組織t值P值例數(shù)86 86 LncRNA OTUD6B-AS1 0.97±0.16 1.70±0.44 14.46＜0.001 miR-365a-3p 1.01±0.14 0.53±0.17 20.21＜0.001

2.2 肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性 以肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達(dá)水平中位數(shù)（1.57、0.43）為界限，其中LncRNA OTUD6B-AS1表達(dá)水平＞1.57的病人為L(zhǎng)ncRNA OTUD6B-AS1高表達(dá)組（n=43），≤1.57的病人為L(zhǎng)ncRNA OTUD6B-AS1低表達(dá)組（n=43），miR-365a-3p表達(dá)水平＞0.43的病人為miR-365a-3p高表達(dá)組（n=43），≤0.43的病人為miR-365a-3p低表達(dá)組（n=43）。結(jié)果顯示，肝癌病人血清LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達(dá)水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡、腫瘤長(zhǎng)徑、乙肝病毒、血管侵犯無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 肝癌病人86例血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性/例（%）

2.3 肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p表達(dá)的相關(guān)性分析 經(jīng)Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r=-0.47，P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p表達(dá)的相關(guān)性

2.4 肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性 所有病人隨訪5年，死亡64例，86例肝癌病人的生存率為25.58%（22/86）。LncRNA OTUD6B-AS1低表達(dá)組生存率37.21%（16/43）高于LncRNA OTUD6B-AS1高表達(dá)組13.95%（6/43）（χ2=6.11，P=0.013）；miR-365a-3p高表達(dá)組生存率41.86%（18/43）高于miR-365a-3p低表達(dá)組9.30%（4/43）（χ2=8.03，P=0.005）。

以預(yù)后（死亡=1，存活=0）為自變量，將單因素分析有差異因素為自變量，多因素Cox回歸分析顯示，LncRNA OTUD6B-AS1高表達(dá)以及miR-365a-3p低表達(dá)是影響肝癌病人死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 Cox回歸分析影響肝癌86例預(yù)后的影響因素

3 討論

肝癌是全球最常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，好發(fā)于過(guò)度飲酒、感染肝炎病毒、肝硬化等人群，近年來(lái)發(fā)病率和死亡率呈明顯的上升趨勢(shì)，危害大［9］。由于早期肝癌的臨床癥狀比較隱蔽，診斷時(shí)病情常較嚴(yán)重，即可能已發(fā)展至中期，甚至是晚期，臨床治療效果不好。且早發(fā)現(xiàn)、早治療的肝癌病人較中晚期病人生存時(shí)間長(zhǎng)。因此，探討能輔助評(píng)估肝癌病人預(yù)后的指標(biāo)至關(guān)重要。

LncRNA是長(zhǎng)度超過(guò)200 nt非編碼RNA，在表觀遺傳變化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后修飾中發(fā)揮作用［10］，通過(guò)對(duì)miRNA和靶蛋白的靶向調(diào)控，參與各種疾病的發(fā)生和發(fā)展。已有研究表明LncRNA參與并調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程，與肝癌等多種惡性腫瘤有關(guān)［11］。LncRNA OTUD6BAS1也是LnRNA中的一員，近期張小博等［5］報(bào)道也證明LncRNA OTUD6B-AS1可促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)展。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，LncRNA OTUD6B-AS1在肝癌組織中高表達(dá)，通過(guò)miR-664b-3p調(diào)節(jié)GSKIP/Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲［12］。本研究結(jié)果顯示，LncRNA OTUD6B-AS1在肝癌病人血清及肝癌組織中高表達(dá)，與既往報(bào)道一致［12］，且與肝癌病人的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分化程度有關(guān)，說(shuō)明LncRNA OTUD6B-AS1表達(dá)升高可能參與肝癌發(fā)生及病情惡性進(jìn)展，其機(jī)制可能與LncRNA OTUD6B-AS1能靶向調(diào)控肝癌病理機(jī)制中關(guān)鍵基因進(jìn)而調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

miRNA作為一種新型生物標(biāo)志物，在癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、分化和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［13］。大量研究表明，miR-365a-3p在多種人類癌癥中充當(dāng)腫瘤抑制因子，如Yang等［14］表明miR-365a-3p過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞周期停滯在G1期，顯著抑制細(xì)胞增殖；黃君華等［15］研究顯示，miR-365a-3p與三陰性乳腺癌的不良進(jìn)展相關(guān)，可通過(guò)調(diào)節(jié)JAKSTAT通路抑制腫瘤惡性進(jìn)展。但miR-365a-3p在肝癌中的作用尚不清楚，因此，本研究檢測(cè)了血清及肝癌組織中miR-365a-3p表達(dá)情況，結(jié)果顯示，肝癌病人血清及肝癌組織中miR-365a-3p表達(dá)降低，說(shuō)明miR-365a-3p可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)，且血清與癌組織中miR-365a-3p表達(dá)具有一致性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-365a-3p表達(dá)與肝癌病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)，提示miR-365a-3p可能參與并影響肝癌發(fā)展過(guò)程，其可能在肝癌發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，LncRNA OTUD6B-AS1高表達(dá)與miR-365a-3p低表達(dá)肝癌病人具有更低的5年累積生存率，且LncRNA OTUD6B-AS1高表達(dá)及miR-365a-3p低表達(dá)均為肝癌病人預(yù)后不良獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示LncRNAOTUD6B-AS1與miR-365a-3p可作為評(píng)估肝癌預(yù)后的標(biāo)志物。另外，通過(guò)Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，相關(guān)性分析也證實(shí)肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)，說(shuō)明二者可能共同參與肝癌發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，肝癌病人血清及肝癌組織中LncRNA OTUD6B-AS1表達(dá)上調(diào)，miR-365a-3p表達(dá)下調(diào)，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)，二者的異常表達(dá)可作為肝癌病人的預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物。然而，本研究仍存在不足之處，肝癌病人中乙肝病毒感染率較高，可能影響LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p檢測(cè)水平的準(zhǔn)確性；LncRNA OTUD6BAS1、miR-365a-3p參與肝癌的具體調(diào)控機(jī)制還需深入探究。