陳華蕊,蓋江濤,何書強(qiáng),馮振翠,陳業(yè)淵

(1 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所,?？?571101;2 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院,海南三亞,572025)

火龍果屬于仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereusundatus)多漿類植物,是熱帶地區(qū)獨(dú)具特色的新奇特果樹?；瘕埞麑?shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,是集水果、花卉、蔬菜、醫(yī)療保健等為一體的新型水果。生產(chǎn)中火龍果的種苗主要通過扦插或嫁接繁育,然而這些方法周期長(zhǎng)、繁殖速度慢,并且在后代的遺傳中極易發(fā)生變異。開展火龍果的愈傷組織誘導(dǎo)及其再生體系的建立,既能有效提高種苗良種繁育系數(shù),也為火龍果的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供支撐。彭思維等[1]研究認(rèn)為,紫紅龍品種的幼嫩莖段通過添加TDZ、2,4-D 和NAA的組合配比能成功誘導(dǎo)出愈傷組織,誘導(dǎo)率高達(dá)89.1%。邢玉良等[2]以幼嫩莖段為試材,研究發(fā)現(xiàn),最適誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基是MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L,誘導(dǎo)率達(dá)92.7%。也有研究表明,以莖段和子葉作為外植體均能誘導(dǎo)出愈傷組織[3]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上探索利用紅皮紅肉品種“金都一號(hào)”不同成熟期莖段為外植體,通過對(duì)影響火龍果再生的諸多因素開展研究,篩選和優(yōu)化火龍果植株再生適宜的培養(yǎng)基配方,獲得高效的火龍果愈傷組織誘導(dǎo)及分化方法,建立穩(wěn)定的火龍果再生體系,為火龍果規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料火龍果品種:金都一號(hào),取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所火龍果種質(zhì)圃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體處理 選取成年火龍果植株上無(wú)病害的幼嫩莖段、成熟莖在自來(lái)水下將表面的灰塵沖洗20 min,用毛刷經(jīng)過洗潔精刷洗干凈后,去除莖段上的黏液,然后用手術(shù)刀將沖洗后的莖段沿髓部將3棱分開,切成2 cm左右的片段。幼嫩莖段經(jīng)過75%酒精30 s+次氯酸鈉5 min+0.1 %升汞10 min處理,再用無(wú)菌水沖洗5次;成熟莖段采用75%酒精30 s+次氯酸鈉10 min+0.1%升汞15 min消毒,無(wú)菌水沖洗5次,備用。

將消毒滅菌的幼嫩莖段接入不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,待不定芽長(zhǎng)到4～6 cm長(zhǎng)時(shí),將不定芽切下并切成2 cm左右的莖段,備用。培養(yǎng)條件(25±2)℃,光強(qiáng)2 000～2 500 lx,光照時(shí)間12 h/d。

1.2.2 不同成熟度莖段對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)影響 將以上處理好的幼嫩莖段、成熟莖段、幼苗莖段橫接在MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基上,每個(gè)類型外植體接種10瓶,每瓶3個(gè)外植體,重復(fù)3次。觀察記錄不同外植體類型愈傷組織形態(tài)及誘導(dǎo)率。

將幼苗莖段切成1～2 cm以水平接和垂直接的方式接種于MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中,觀察比較2種接種方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

1.2.3 不同基本培養(yǎng)基類型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 取備用的幼嫩莖段接入不同的培養(yǎng)基中:MS、1/2MS、1/4MS、B5,分別添加TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,每個(gè)類型的培養(yǎng)基中接15瓶,每瓶2個(gè)外植體,重復(fù)3次。觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長(zhǎng)形態(tài)及誘導(dǎo)率。

1.2.4 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度及外植體類型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將消毒滅菌后的成熟莖段、幼嫩莖段、幼苗莖段接種于以蔗糖(30 g/L)+卡拉膠(8 g/L)的MS為基本培養(yǎng)基,分別附加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑TDZ(0.2、0.6、1.0 mg/L)、KT(0.6、0.8、1.0 mg/L)、2,4-D( 0.5、1.0、2.0 mg/L)、6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)的培養(yǎng)基上培養(yǎng),每個(gè)處理接種10瓶,每瓶2個(gè)外植體,重復(fù)3次。接種后定期觀察愈傷組織的生長(zhǎng)狀況,50 d后計(jì)算誘導(dǎo)率。

1.2.5 愈傷組織誘導(dǎo)不定芽生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的篩選 將初代培養(yǎng)誘導(dǎo)出來(lái)的黃綠色致密的愈傷組織切割成約0.5 cm×0.5 cm大小,接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基用MS基本培養(yǎng)基,附加6-BA、NAA生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合設(shè)計(jì)。每處理接種10個(gè)外植體,重復(fù)5次,接種后40 d對(duì)不定芽數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),初步篩選獲得最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度配比。

1.2.6 生根培養(yǎng) 當(dāng)芽苗長(zhǎng)至2～4 cm時(shí),切下單個(gè)芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng),以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,分別附加NAA 0.1～0.5 mg/L、 6-BA 0.5～1.5 mg/L,每種培養(yǎng)基接種10瓶,每瓶接種3株,重復(fù)3次。接種20 d后調(diào)查誘導(dǎo)生根情況。50 d后統(tǒng)計(jì)生根率(生根芽苗數(shù)/接種芽苗數(shù)×100%)及平均生根數(shù),并觀察生根苗長(zhǎng)勢(shì)。待不定根平均3～4條時(shí)于室溫中煉苗7 d后移栽至營(yíng)養(yǎng)土中。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理分析 愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100;愈傷組織分化率(%)=分化出芽的愈傷組織外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100。采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度莖段對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同外植體接種10 d左右,切口慢慢膨大,隨后切口處逐漸產(chǎn)生黃白色或黃綠色的愈傷組織。從表1可知,“金都一號(hào)”火龍果的不同成熟度莖段均能誘導(dǎo)出愈傷組織,幼苗莖段誘導(dǎo)率為81.5%,顯著高于成熟莖段和幼嫩莖段,而成熟莖段的誘導(dǎo)率最低為38.9%。成熟莖段誘導(dǎo)的愈傷組織呈黃白色疏松狀,在后期培養(yǎng)過程中疏松狀愈傷組織會(huì)逐漸變褐色,甚至死亡。利用幼嫩莖段或幼苗莖段誘導(dǎo)愈傷組織,誘導(dǎo)率高,愈傷組織呈黃綠色堅(jiān)硬致密狀,在后期培養(yǎng)中容易增殖并分化成苗。

表1 不同成熟度莖段對(duì)火龍果愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同接種方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

莖段的接種方式主要有水平接和垂直接(見圖1)。水平接的莖段能較大面積地接觸培養(yǎng)基,莖段上的刺座及兩個(gè)切面均能誘導(dǎo)出愈傷組織,而垂直接只有莖段的單個(gè)切面接觸培養(yǎng)基,而愈傷組織一般在刺座和切口周圍萌發(fā),因此,水平接誘導(dǎo)的愈傷組織明顯多于垂直接,有利于愈傷組織的誘導(dǎo)。

注:A 水平接;B 垂直接。

2.3 不同基本培養(yǎng)基類型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如表2所示,在MS、1/2MS、1/4MS、B5等4種不同的基本培養(yǎng)基中添加TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,愈傷組織的誘導(dǎo)率差異達(dá)顯著水平,其中以MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高,達(dá)到76.7%,愈傷組織呈黃綠色致密狀,體積較大,誘導(dǎo)率最低的是B5培養(yǎng)基,未見愈傷組織產(chǎn)生。因此,本實(shí)驗(yàn)采用MS為基本的培養(yǎng)基。

表2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)火龍果愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 TDZ對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效果

TDZ具有極強(qiáng)的細(xì)胞分裂活性,對(duì)誘導(dǎo)植物愈傷組織的效果顯著[1,4]。為篩選合適的濃度,研究了添加不同濃度TDZ對(duì)火龍果幼嫩莖段愈傷組織誘導(dǎo)的效果。由表3可看出,愈傷組織誘導(dǎo)率隨TDZ濃度增加而增加,TDZ濃度為0.1 mg/L時(shí),愈傷組織誘導(dǎo)率為16.7%;TDZ濃度為0.6 mg/L時(shí),誘導(dǎo)率達(dá)到56.7%,顯著高于其他濃度水平(p<0. 05);TDZ濃度升高為1.0～1.5 mg/L時(shí),誘導(dǎo)率為50%～55%,略有下降,但是變化不大。TDZ濃度在0.6～1.0 mg/L之間有利于愈傷組織的誘導(dǎo)。

表3 不同濃度TDZ對(duì)火龍果幼嫩莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.5 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度及外植體類型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效果

成熟莖段在添加TDZ、KT和2,4-D的組合中均能誘導(dǎo)出愈傷組織,但并未見不定芽發(fā)生。愈傷組織形態(tài)特征主要表現(xiàn)為乳白色疏松、黃白色疏松,黃綠色致密、白色帶紅色疏松(見圖2)。當(dāng)TDZ的濃度相同時(shí),愈傷組織誘導(dǎo)率隨著KT和2,4-D濃度的增加而增加,而當(dāng)2,4-D的濃度一定時(shí),愈傷組織誘導(dǎo)率隨著TDZ和KT濃度的增加而增加。當(dāng)TDZ 1.0 mg/L+KT 0.8 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高,達(dá)到58.3%(見表4),誘導(dǎo)的愈傷組織大部分呈黃白疏松狀,只有少量的致密黃綠色愈傷組織產(chǎn)生。在后期的培養(yǎng)中,呈疏松狀的白色或黃白色帶紅色愈傷組織容易褐化死亡,很難分化成不定芽(見圖3)。

注:A 乳白色疏松愈傷組織;B 黃白色疏松愈傷組織;C 綠色致密愈傷組織;D 白色帶紅色疏松愈傷組織。

圖3 愈傷組織褐化和愈傷組織誘導(dǎo)不定芽

由表5可以看出,將幼嫩莖段接種于培養(yǎng)基20 d 后,莖段切口開始膨大誘導(dǎo)形成愈傷組織,同時(shí)刺座部位膨大隆起并冒出不定芽。愈傷組織形態(tài)呈綠色致密、黃綠色致密以及黃白色疏松狀。TDZ添加KT和2,4-D的效果明顯優(yōu)于TDZ單獨(dú)使用。隨著TDZ濃度的增加,愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸升高,高濃度TDZ有利于愈傷組織誘導(dǎo),0.2、0.6 mg/L TDZ添加KT、2,4-D后誘導(dǎo)的愈傷組織呈綠色或黃綠致密狀,愈傷組織的誘導(dǎo)率也隨著KT濃度的增加而增加,最高達(dá)到81.7%,顯著高于其他組合,不定芽再生率也隨著KT、2,4-D濃度的增加而增加,最高達(dá)到36.3%。當(dāng)TDZ濃度為1.0 mg/L時(shí),愈傷組織質(zhì)地疏松,呈黃白色,誘導(dǎo)率隨著KT濃度增加而增加,不定芽誘導(dǎo)率隨著KT濃度增加而降低,KT增加到1.0 mg/L時(shí),不定芽再生率為19.8%。由此可見,TDZ在一定范圍內(nèi)能成功誘導(dǎo)出愈傷組織,但過高的濃度會(huì)致使愈傷組織質(zhì)地疏松,不利于后期愈傷組織的分化。因此,較適宜幼嫩莖段誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.6 mg/L+KT 0.8 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L。

表5 不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比對(duì)火龍果幼嫩莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

幼苗的莖段接種于含有不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織,結(jié)果如表6所示。6-BA濃度在1.0～3.0 mg/L時(shí)配合2,4-D使用均能誘導(dǎo)出愈傷組織。愈傷組織的表現(xiàn)形態(tài)有差異,有白色疏松狀、黃綠色致密,綠色帶白疏松狀(見圖4)。經(jīng)方差分析結(jié)果表明,不同濃度的6-BA和2,4-D配比對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有顯著效果。當(dāng)6-BA的濃度不變時(shí),愈傷組織的誘導(dǎo)率隨著2,4-D濃度的增加而增加,最高可達(dá)到93.3%。6-BA增加至3.0 mg/L時(shí),誘導(dǎo)的愈傷組織中間綠色邊緣泛白,疏松狀,后期培養(yǎng)的過程中容易增殖但不容易分化。當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L,2,4-D濃度為1.0 mg/L時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)率最高,達(dá)到91.7%。明顯高于幼嫩和成熟莖段的誘導(dǎo)率。

注:A 白色疏松狀;B:黃綠色致密;C:綠色帶白,疏松狀。

表6 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比對(duì)火龍果幼苗莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.6 愈傷組織誘導(dǎo)不定芽

接種10 d之后,呈致密狀黃綠色的愈傷組織逐漸膨大;培養(yǎng)40 d后,愈傷組織上有綠色的芽點(diǎn)產(chǎn)生(見圖4)。如表7所示,6-BA濃度在 1.0～4.0 mg/L 時(shí)配合NAA濃度 0.1～0.5 mg/L均能誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生。不同濃度的6-BA、 NAA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽都有顯著影響,當(dāng)較低濃度的6-BA(1.0 mg/L)與適當(dāng)濃度的NAA組合時(shí),不定芽的誘導(dǎo)率較低,誘導(dǎo)率5%～17%;當(dāng)較高濃度的 6-BA(2.0～4.0 mg/L)與適當(dāng)濃度的NAA組合時(shí),愈傷組織不定芽的誘導(dǎo)率較高,可高達(dá)88%。在合適的范圍內(nèi),當(dāng) 6-BA濃度相同時(shí),不定芽誘導(dǎo)率基本隨著NAA濃度的提高而增加,但當(dāng)NAA升高到0.5 mg/L時(shí),愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)率有所下降,但是變化不大。綜上所述,不同濃度6-BA和NAA組合對(duì)愈傷組織不定芽誘導(dǎo)的影響不同,其中以MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)效果最好,達(dá)到了88%。

表7 不同濃度6-BA與NAA組合的培養(yǎng)基對(duì)火龍果不定芽誘導(dǎo)的影響

2.7 生根培養(yǎng)

再生不定芽接種30 d后開始有根系的生成,60 d后即可煉苗移栽。由表8可知,不同處理組合間再生芽的生根率存在極顯著差異,且誘導(dǎo)形成的不定根長(zhǎng)勢(shì)不一致。隨著 6-BA濃度的升高,莖段生根率極顯著提高,從23.3%上升到97.8%,且平均根數(shù)從2.3根增加到7.2根。6-BA的濃度增加到1.5 mg/L時(shí),生根率顯著下降,降到62.2%。因此,在MS培養(yǎng)基中添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L,芽和根長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)壯,平均根長(zhǎng)為8.8 cm,平均根數(shù)為7.2條,生根率為 97.8%。研究發(fā)現(xiàn),在添加6-BA和NAA的生根培養(yǎng)基上同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)出腋芽,當(dāng)6-BA的濃度大于0.5 mg/L時(shí),誘導(dǎo)的腋芽明顯增多且長(zhǎng)勢(shì)健壯,這與彭思維等的研究結(jié)果一致[1]。苗在室溫中煉苗5～7 d,移栽到營(yíng)養(yǎng)盆中,成活率達(dá)到100%。

表8 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)火龍果生根的影響

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn),火龍果不同的外植體類型誘導(dǎo)的愈傷組織主要有以下幾種形態(tài)類型:白色疏松狀、黃白色疏松狀、黃綠色疏松狀、白色帶紅色疏松狀、黃綠色致密顆粒狀,這與彭思維等的研究結(jié)果一致[5]。其中,白色疏松狀、黃白色疏松狀、白色帶紅色疏松狀愈傷組織在培養(yǎng)過程中容易褐化死亡,而黃綠色致密顆粒狀的愈傷組織在后期的培養(yǎng)中能夠增殖并誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),為了抑制疏松狀愈傷組織褐化死亡,主要采用短時(shí)間內(nèi)多次轉(zhuǎn)瓶或暗培養(yǎng)等措施來(lái)減少褐化率,但未得到良好的效果,愈傷組織最后還是會(huì)褐化死亡。Asmus B、彭思維等[1,6]認(rèn)為,愈傷組織呈疏松狀是由于代謝活動(dòng)過強(qiáng)引起的,而褐化現(xiàn)象可能是醌類物質(zhì)擴(kuò)散到培養(yǎng)基中而使其顏色變化引起的酶促變褐色。

關(guān)于火龍果愈傷組織再生方面的研究已有報(bào)道,主要是成熟莖段、幼嫩莖段、幼苗莖段、子葉或花粉作為外植體[2,7-10]?；瘕埞黄贩N不同類型外植體誘導(dǎo)愈傷組織的效果也不同。有研究學(xué)者認(rèn)為,幼嫩莖段更容易誘導(dǎo)愈傷組織,誘導(dǎo)率達(dá)到89.1%[1]。本研究以不同成熟度的莖段為外植體作為研究對(duì)象,結(jié)果表明,幼芽誘導(dǎo)率(91.7%)明顯大于幼嫩莖段(81.7%)和成熟莖段(58.3%)。由此說(shuō)明,愈傷組織的誘導(dǎo)率與外植體的類型有關(guān),也與外植體本身的生理特性有關(guān)。采用幼芽莖段作為外植體,其生長(zhǎng)狀態(tài)屬于幼嫩階段,再生能力較強(qiáng)。黃紅梅等[3]的研究也表明,幼芽誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率更高,與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。

本試驗(yàn)研究了不同質(zhì)量濃度TDZ 、KT、2,4-D、6-BA的混合配比對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同外植體對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的敏感度不一樣,老熟莖段誘導(dǎo)的愈傷組織以疏松狀為主,在后期增殖分化培養(yǎng)基中容易褐化死亡,而以幼嫩莖段或幼苗莖段誘導(dǎo)的愈傷組織大部分呈黃綠色致密狀或綠色致密狀,在后期培養(yǎng)中容易分化成不定芽。因此,應(yīng)選擇幼嫩或幼苗莖段作為外植體。研究還發(fā)現(xiàn),添加不同濃度TDZ對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有顯著差異,在幼嫩莖段誘導(dǎo)愈傷組織過程中,愈傷組織的誘導(dǎo)率隨著TDZ濃度的增加而增加,當(dāng)TDZ濃度大于1.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率逐漸降低,誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地變疏松,不利于后期的增殖和分化。

不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及配比是組織再生的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度6-BA、NAA組合對(duì)火龍果愈傷組織分化不定芽均存在極顯著影響。一定濃度6-BA與低濃度NAA配合使用,愈傷組織分化的效果較好,但當(dāng)NAA濃度提高到0.5 mg/L時(shí),芽的分化率會(huì)降低。不同濃度6-BA和NAA組合對(duì)愈傷組織不定芽誘導(dǎo)的影響不同,其中以MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)效果最好。