刁瑋琳,尹敏,李翠

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科,山東 青島 266003)

真菌性角膜炎是最嚴(yán)重的感染性角膜病之一,其發(fā)病率持續(xù)上升[1]。煙曲霉菌(AF)是角膜感染的主要真菌病原體,角膜上皮損傷是角膜炎的關(guān)鍵誘發(fā)因素[2]。真菌侵入角膜基質(zhì)層時誘發(fā)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷[3]。桃葉珊瑚苷(AU)存在于許多天然植物中[4],具有廣泛的藥理學(xué)特性,如抗炎、抗菌、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)以及抗纖維化等作用[5-9]。研究顯示,AU能夠降低干眼癥小鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)等炎癥因子表達(dá)預(yù)防角膜上皮損傷[10],AU通過TOLL樣受體4/髓樣分化因子88/人核因子κB抑制蛋白α/核因子κB信號通路抑制脊髓損傷模型中的炎癥,從而促進(jìn)神經(jīng)元功能恢復(fù)[11];AU通過抑制肌醇依賴酶1α/硫氧還蛋白互作蛋白信號通路緩解炎癥反應(yīng),從而延緩2型糖尿病誘導(dǎo)的肝纖維化發(fā)展[12]。因此,AU具有抗炎潛力并且可能成為治療真菌性角膜炎的藥物。本研究探討AU對AF誘導(dǎo)的真菌性角膜炎炎癥反應(yīng)的作用。

1 材料和方法

1.1 真菌制備

AF標(biāo)準(zhǔn)菌株(菌株3.0772,中國微生物中心)于固體瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng),振蕩研磨后收集菌絲,以12 000 r/min離心15 min,用無菌PBS洗滌。將收集的活化菌絲用于動物實驗;用體積分?jǐn)?shù)0.70乙醇處理滅活菌絲,并將濃度調(diào)整為3×1011CFU/L用于細(xì)胞實驗。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與刺激

人角膜上皮細(xì)胞(HCECs)由中國福建廈門大學(xué)實驗室提供。將HCECs接種于6孔板或者12孔板之中,在含有胎牛血清的F12細(xì)胞培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng),至細(xì)胞生長密度達(dá)到80%,將細(xì)胞分為DMSO組、AU組、AF+DMSO組、AF+AU組,其中DMSO組與AU組分別加入含有體積分?jǐn)?shù)0.005 DMSO和20 mg/L AU的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng);AF+DMSO組與AF+AU組分別加入體積分?jǐn)?shù)0.005 DMSO和20 mg/L的AU預(yù)處理2 h后,加入滅活菌絲。收集菌絲刺激8 h后的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR,收集刺激24 h的細(xì)胞進(jìn)行Western blot和ELISA檢測。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1藥物細(xì)胞毒性評估 將HCECs接種于96孔板中,分別加入含有不同濃度AU(5、10、20、40、80、160、320 mg/L)細(xì)胞培養(yǎng)液,37 ℃下培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑(Solarbio,中國北京)后培養(yǎng)2 h,用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度值,以其評估各組細(xì)胞存活率。

1.3.2小鼠AF角膜炎模型的建立及AU對其作用健康8周齡雌性C57BL/6小鼠購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司,所有治療均符合視覺與眼科研究協(xié)會關(guān)于在眼科和視覺研究中使用動物的聲明要求。在正常小鼠右眼中分別滴入體積分?jǐn)?shù)0.005的DMSO(DMSO組)以及20 mg/L的AU(AU組)5 μL,每天2次。選取小鼠的右眼作為實驗眼,80 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后刮取小鼠右眼中央2 mm角膜上皮,在眼表面涂抹AF(5 μL,3×1011CFU/L),放置軟接觸鏡后縫合眼瞼24 h以形成潰瘍。眼瞼縫線拆除后,分別將體積分?jǐn)?shù)0.005的DMSO及20 mg/L AU 5 μL滴入小鼠結(jié)膜囊,每天2次,分別作為AF+DMSO組及AF+AU組。感染后第1天和第3天,裂隙燈下觀察小鼠角膜炎嚴(yán)重程度,參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行臨床評分評估角膜炎嚴(yán)重程度[13],根據(jù)潰瘍面積、混濁程度和潰瘍形態(tài)分為Ⅰ～Ⅳ級,分別對應(yīng)1～4分。臨床評分總分為3項觀察指標(biāo)分?jǐn)?shù)相加,總分0～5為輕度感染,6～9為中度感染,10～12為嚴(yán)重感染。收集各組小鼠角膜用于實時熒光定量PCR(RT-PCR)、Western blot、ELISA和髓過氧化物酶(MPO)實驗,收集小鼠眼球用于免疫熒光染色。

1.3.3RT-PCR檢測相關(guān)受體與炎癥因子mRNA表達(dá) 使用RNAiso Plus試劑盒(Takara,大連,中國)從滅活A(yù)F菌絲刺激8 h后的HCECs或小鼠角膜中提取總RNA,使用Prime Script RT試劑盒(Takara,大連,中國)將RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,用RT-PCR儀器(Eppendorf公司,德國)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系:目的基因上、下游引物各0.5 μL,SYBR 10.0 μL,樣本cDNA 2.0 μL,滅菌DEPC水7.0 μL。根據(jù)循環(huán)數(shù)計算基因的相對表達(dá)量,以β-actin作為內(nèi)參照,分別檢測重組與合成蛋白(Nrf2)、血紅素氧合酶-1(HO-1)、IL-1β以及白細(xì)胞介素-6(IL-6)mRNA表達(dá)。PCR引物及其序列見表1。

表1 PCR引物及其序列

1.3.4Western blot檢測Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)用比例為98∶1∶1的RIPA緩沖液、PMSF和磷酸酶抑制劑的混合液裂解細(xì)胞蛋白,BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio,中國北京)測定蛋白質(zhì)的濃度后,應(yīng)用體積分?jǐn)?shù)0.10 SDS-PAGE分離總蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用封閉液(beyotime,中國北京)封閉膜,并將膜分別浸泡于一抗Nrf2(1∶1 000, CST)、HO-1(1∶20 000, Abcam)、β-actin(1∶1 000, Elabscience)和 β-tubulin(1∶1 000, Elabscience)中4 ℃孵育過夜,用PBST洗滌3次后,將膜與相應(yīng)的二抗(1∶1 000, Elabscience)37 ℃下孵育1 h,于UVP(VILBER LOURM,美國)下顯像并拍照。應(yīng)用Image J軟件分析各組蛋白條帶的灰度值,以其表示蛋白表達(dá)水平。

1.3.5ELISA方法檢測IL-1β、IL-6蛋白表達(dá) 滅活A(yù)F菌絲刺激HCECs 24 h,離心并收集細(xì)胞上清液,應(yīng)用ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平,按試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用酶標(biāo)儀檢測450 nm和570 nm波長處的吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線計算各組樣本蛋白表達(dá)濃度。

1.3.6免疫熒光染色檢測AU對中性粒細(xì)胞募集的影響 收集小鼠感染第3天的眼球置于OCT包埋劑中液氮冷凍,-25 ℃下切成8 μm厚的連續(xù)切片,4 ℃下用丙酮固定5 min。加入山羊血清(1∶100,Solarbio)封閉30 min后,在4 ℃下用NIMP-R14(1∶100,Santa Cruz Biotechnology Company)孵育樣本過夜。加入相應(yīng)的二抗(1∶200,Elabscience)避光孵育1 h,DAPI染色10 min。熒光顯微鏡(Zeiss Axio Vert,放大倍數(shù)400倍)觀察并拍照,觀察樣本中性粒細(xì)胞的定位。

1.3.7MPO實驗檢測中性粒細(xì)胞MPO活性 收集小鼠感染第3天角膜,應(yīng)用MPO試劑盒(南京建成生物工程研究所,中國江蘇)檢測各組樣本MPO活性,按試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。在37 ℃下用酶標(biāo)儀測量460 nm處吸光度值,以其作為MPO活性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 AU對細(xì)胞的毒性評估

CCK-8實驗顯示,各處理組之間HCECs存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.696,P<0.05)。濃度為80、160、320 mg/L的AU處理降低了HCECs存活率(P<0.05),濃度≤40 mg/L的AU處理對HCECs存活率無影響(P>0.05)。見表2。

表2 不同濃度AU對HCECs細(xì)胞存活率的影響

2.2 AU對AF性角膜炎的嚴(yán)重程度和中性粒細(xì)胞的影響

裂隙燈觀察顯示,與AF+DMSO組相比,感染第3天AF+AU組小鼠角膜潰瘍面積減少,混濁程度減輕(圖1A～D)。重復(fù)測量設(shè)計方差分析顯示,時間、組別、時間與組別的交互作用對臨床評分均有影響(F時間=91.207,F分組=16.200,F時間×分組=20.862,P<0.01)。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示,感染第1天AF+AU組與AF+DMSO組臨床評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.385,P>0.05);感染第3天AF+AU組臨床評分較AF+DMSO組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=35.714,P<0.001);感染第3天AF+DMSO組、AF+AU組小鼠臨床評分與第1天相比均明顯提高(F=99.655、12.414,P<0.01)。見表3。免疫熒光染色檢測顯示,AF+AU組小鼠角膜中性粒細(xì)胞浸潤少于AF+DMSO組(圖1E～J)。MPO實驗結(jié)果顯示,經(jīng)過AU處理后小鼠角膜中性粒細(xì)胞活性小于AF+DMSO組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.882,P<0.001)。見表3。

A、B分別為AF+DMSO組與AF+AU組小鼠感染第1天的裂隙燈拍照圖像;C、D分別為AF+DMSO組與AF+AU組小鼠感染第3天的裂隙燈拍照圖像;E～G為AF+DMSO組小鼠感染第3天中性粒細(xì)胞免疫熒光染色圖片(400倍);H～J為AF+AU組小鼠感染第3天中性粒細(xì)胞免疫熒光染色圖片(400倍)。綠色圖像(E、H)為使用NIMP-R14-FITC標(biāo)記的中性粒細(xì)胞,藍(lán)色圖像(F、I)為使用DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核,Merge(G、J)指示中性粒細(xì)胞在角膜組織中的定位。

表3 AU處理對臨床評分和MPO活性影響

2.3 AU對小鼠AF角膜炎中炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)的影響

析因設(shè)計方差分析顯示,AU處理、AF處理、AU與AF處理的交互作用對IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)均有影響(FAU=23.154、34.673,FAF=41.883、82.697,FAU×AF=23.173、34.942,P均<0.001)。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示,不用AF處理時,AU處理與不處理的小鼠炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);不用AU處理時,AF處理與不處理相比IL-1β和IL-6mRNA表達(dá)上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=57.595、128.336,P<0.001);用AF處理時,感染第3天時AU處理與不處理相比小鼠角膜IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)明顯下降,差異有顯著性(F=59.356、110.224,P<0.001);用AU處理時,AF處理與不處理相比小鼠IL-1βmRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.511,P<0.05),IL-6mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)比較

析因設(shè)計方差分析顯示,FAU=23.154、34.673,FAF=41.883、82.697,FAU×AF=23.173、34.942,P<0.001。與DMSO組比較,*F=57.595、128.336,P<0.001;與AF+DMSO組比較,#F=59.356、110.224,P<0.001;與AU組比較,&F=4.511,P<0.05。

2.4 AU對HCECs中AF誘導(dǎo)的炎癥的影響

析因設(shè)計方差分析顯示,AU處理、AF處理、AU與AF處理的交互作用對Nrf2、HO-1、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)均有影響(FAU=9.111～60.965,FAF=84.676～673.934,FAU×AF=9.295～47.024,P<0.01)。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示,不用AF處理時,AU處理與不處理Nrf2、HO-1、IL-1β和IL-6mRNA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);不用AU處理時,AF處理與不處理相比上述受體和炎癥因子的mRNA表達(dá)明顯上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.877～538.499,P<0.001);用AF處理時,AU處理與不處理相比Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)明顯上升,IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平明顯下降(F=17.569～103.117,P<0.001);用AU處理時,AF處理與不處理相比Nrf2、HO-1、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=71.630～431.986,P<0.001)。見表5。

表5 各組HCECs受體和相關(guān)炎癥因子的mRNA表達(dá)比較

析因設(shè)計方差分析顯示,AU處理、AF處理、AU與AF處理的交互作用對Nrf2、HO-1和IL-6蛋白表達(dá)均有影響(FAU=61.030～95.257,FAF=106.921～663.812,FAU×AF=48.953～69.333,P<0.01)。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示,不用AF處理時,AU處理與不處理相比Nrf2、HO-1和IL-6蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);不用AU處理時, AF處理與不處理相比上述受體和炎癥因子蛋白表達(dá)上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=69.637～169.483,P<0.001);用AF處理時,AU處理與不處理相比,AU處理上調(diào)了Nrf2、HO-1蛋白表達(dá),下調(diào)了IL-6蛋白表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=109.650～146.436,P<0.001);用AU處理時,AF處理與不處理相比Nrf2、HO-1、IL-6蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.590～548.402,P<0.05)。見表6。

表6 各組HCECs受體和相關(guān)炎癥因子蛋白表達(dá)比較

3 討 論

真菌性角膜炎是一種具有高致盲率的嚴(yán)重角膜感染性疾病[14]。宿主炎癥反應(yīng)是角膜病變破壞的重要原因之一[15]。過度免疫反應(yīng)會導(dǎo)致角膜混濁,甚至發(fā)生角膜穿孔威脅視力[3]。AU是一種來源于傳統(tǒng)草藥的環(huán)烯醚萜苷,是一種具有豐富潛在來源、良好安全性和眾多有益生物活性的化合物,具有很高的潛在應(yīng)用價值。

本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過AU處理的感染第3天小鼠角膜潰瘍面積減小,角膜透明度提高,臨床評分降低,提示AU對真菌性角膜炎起到保護(hù)作用。炎癥細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞浸潤角膜是角膜炎結(jié)局的主要決定因素[16]。MPO是一種含陽離子血紅素的酶,存在于中性粒細(xì)胞中,炎癥激活的中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥因子和MPO的釋放,進(jìn)一步引起炎癥部位組織損傷,從而導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害[17-18]。既往研究表明,中性粒細(xì)胞增多會導(dǎo)致銅綠假單胞菌角膜炎不可逆的角膜組織破壞[19]。本研究結(jié)果顯示,AU顯著減輕了AF角膜炎中性粒細(xì)胞浸潤程度,抑制了MPO的活性。既往研究顯示,AU能夠使LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的肺組織病理損傷評分和中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著降低,從而減輕炎癥反應(yīng)[20]。本文研究結(jié)果與其一致。推斷AU通過抑制中性粒細(xì)胞募集從而在AF角膜炎中發(fā)揮抗炎作用。

本文研究還探究了AU對AF誘導(dǎo)的小鼠角膜和HCECs炎癥中炎癥因子表達(dá)的影響。白細(xì)胞介素-1家族(IL-1家族)的細(xì)胞因子和受體在炎癥中的作用是眾所周知的。其中IL-1β的產(chǎn)生與疾病嚴(yán)重程度相關(guān),其在自身免疫性和慢性炎癥中發(fā)揮作用[21]。IL-6是先天免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子,其具有與宿主防御、免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)、增殖和分化相關(guān)的廣泛的生理功能[22]。本文研究結(jié)果顯示,AF刺激能夠使HCECs和小鼠角膜中的IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)上升,而AU能夠下調(diào)這些炎癥因子表達(dá)。有研究結(jié)果顯示,AU能夠降低LPS誘導(dǎo)的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥中IL-1β、IL-6的表達(dá)[23]。本文研究結(jié)果與其相一致。真菌細(xì)胞壁的主要組成部分葡聚糖是宿主細(xì)胞識別的主要病原相關(guān)分子模式[24]。研究表明,真菌β-葡聚糖通過Nrf2途徑誘導(dǎo)口腔角質(zhì)細(xì)胞中HO-1的表達(dá),在宿主防御口腔上皮念珠菌感染引起的應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用[25]。另有研究結(jié)果表明,在高葡萄糖誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜病變的細(xì)胞模型中,Nrf2/HO-1通路的激活可以保護(hù)人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞免受高葡萄糖誘導(dǎo)的炎癥損傷[26]。Nrf2和HO-1的激活能夠下調(diào)炎癥因子水平,從而抑制真菌性角膜炎的炎癥反應(yīng)。本文研究結(jié)果顯示,AU能夠顯著上調(diào)AF誘導(dǎo)的HCECs中Nrf2和HO-1的表達(dá),提示AU可能通過Nrf2/HO-1通路下調(diào)炎癥因子的表達(dá),從而在AF誘導(dǎo)的炎癥中發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述,AU能夠抑制中性粒細(xì)胞募集,減輕AF角膜炎小鼠病情嚴(yán)重程度,下調(diào)體內(nèi)外炎癥因子IL-1β、IL-6的表達(dá)水平,并且AU預(yù)處理能夠激活模式識別受體Nrf2和HO-1表達(dá),提示AU可能通過Nrf2/HO-1通路在AF誘導(dǎo)的炎癥過程中發(fā)揮抗炎作用。