王浩田,蔣景龍,吳 強,秦公偉,任可心,李 麗,丁德寬

(1 陜西理工大學生物科學與工程學院,陜西漢中,723000;2 漢臺區(qū)蔬菜果品技術(shù)推廣中心,陜西漢中,723000;3 城固縣果業(yè)技術(shù)指導站,陜西漢中,723200)

“枳雀”(CitruswilsoniiTanaka ‘Zhique’)為蕓香科,柑桔亞科,柑桔屬,香圓種植物,別名有香櫞、氣柑、宜昌檸檬等,是陜南地區(qū)一種天然地方柑桔品種,至今已有500多年的栽培歷史,目前發(fā)現(xiàn)枳雀的最大樹齡已經(jīng)超過300年,生產(chǎn)中又可分為粗皮枳雀和細皮枳雀兩種類型[1-3]。李航等[4]研究認為,枳雀的母本為柚類或者具有柚類母本血緣的雜交柑桔品種,父本是一個具有枳的血緣的雜交柑桔品種。枳雀是陜南柑桔苗木繁育重要的優(yōu)良砧木之一。枳雀做柑桔砧木,具有很強的抗性,如:抗旱性[2]、抗鹽堿性[3]以及抗凍性[5]等,并且在堿性土壤條件下枳雀砧柑桔植株表現(xiàn)出極強的抗缺鐵黃化性狀[6]。據(jù)《中國藥典》記載,枳雀青果切片制干藥用在治療咳嗽、炎癥、多痰等癥狀中有重要作用[7]。

柑桔具有童期長、雜合度高、多胚性等特點,這使得柑桔的定向改良育種與遺傳親本分析變得異常困難[8-9]。隨著分子生物學和植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟,利用生物技術(shù)進行植物育種已經(jīng)成為了可能。Hidaka等[10]在1990年首次利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了一株華盛頓臍橙轉(zhuǎn)基因植株。當直接利用柑桔實生苗作為遺傳轉(zhuǎn)化的起始材料時,大多數(shù)柑桔實生苗仍處于童期,經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植物必須經(jīng)過漫長的生長周期才能進行形態(tài)學觀測和轉(zhuǎn)基因植株基因性狀表達等研究。以成熟柑桔莖段、頂芽和側(cè)芽等外植體材料作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體,能極大程度地縮短柑桔育種周期,但卻存在再生率低等特點。柑桔組織培養(yǎng)相較于葡萄[11]、沙梨[12]等其他水果作物更加困難,這進一步增加了柑桔遺傳轉(zhuǎn)化的難度。因此,對于柑桔轉(zhuǎn)基因研究而言,建立柑桔類植物高效穩(wěn)定的快繁體系尤為重要。

柑桔組織培養(yǎng)已有50多年的歷史。黃純真等[13](1978年)利用成年金桔嫩枝側(cè)芽為外植體,成功建立了金桔體外再生體系;Kobayashi等[14](2003年)以甜橙成熟莖段為外植體,通過微芽嫁接方法成功獲得甜橙完整植株;陳國華等[15](2016年)研究了兩個柑桔品種(紅江橙、沙糖桔)的頂芽、側(cè)芽、莖段對芽增殖的影響,建立了一種新型的柑桔脫毒苗快繁體系。柑桔組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)日趨成熟。迄今為止,關(guān)于枳雀再生體系建立相關(guān)的研究仍未見報道。本研究以枳雀實生幼苗莖段為外植體進行組織培養(yǎng)快速繁育,旨在于建立一種高效穩(wěn)定的枳雀快繁體系,為后續(xù)枳雀的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

枳雀實生苗種植于陜西理工大學植物逆境與細胞工程課題組培養(yǎng)室,待其生長到4個月大時取莖段為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 莖段表面消毒和接種 挑選長勢良好的枳雀上部幼嫩莖段,自來水沖洗1～2 h,沖洗干凈后剪切成2～5 cm長,轉(zhuǎn)移至超凈工作臺,用75%乙醇溶液浸泡30 s,蒸餾水沖洗3次,0.1%升汞溶液浸泡6 min,蒸餾水沖洗3～5次,于無菌濾紙上吸干表面多余水分,再剪切成0.7～1 cm長,接種到MT培養(yǎng)基[14]中,在培養(yǎng)室進行培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃,光/暗周期12 h/12 h,光照強度為2 000 lx,相對濕度為50%～60%。

腋芽分化條件篩選:選用MT基本培養(yǎng)基(pH值5.8),內(nèi)含8 g/L瓊脂和50 g/L蔗糖,分別添加0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的KT和6-BA,以MT培養(yǎng)基為對照。每個處理設置3組重復,每個重復接種5瓶,每瓶接種3個外植體。培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計膨大率,培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計腋芽誘導率和分化系數(shù)。膨大率=(膨大外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%,腋芽誘導率=(出芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%,腋芽分化系數(shù)=腋芽總數(shù)/接入外植體總數(shù)。

誘導生根條件篩選:挑選生長狀態(tài)良好的芽,轉(zhuǎn)接到添加有0(對照)、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL IBA的1/2 MT(內(nèi)含8 g/L瓊脂和50 g/L蔗糖)與1/2 MSN[16](內(nèi)含7 g/L瓊脂和30 g/L蔗糖)生根培養(yǎng)基中。每個處理設置3組重復,每個重復接種10瓶,每瓶接種2個外植體。培養(yǎng)45 d后對再生苗生長狀況進行觀察,并統(tǒng)計生根率和生根系數(shù),培養(yǎng)90 d后觀察根系生長狀況。生根率=(生根芽數(shù)/接種芽總數(shù))×100%,生根系數(shù)=生根條數(shù)/生根芽總數(shù)。

1.2.3 移栽和馴化 將根系發(fā)育良好的再生苗從培養(yǎng)基中移出,用無菌蒸餾水將培養(yǎng)基徹底沖洗干凈,隨后轉(zhuǎn)移到含有滅菌營養(yǎng)土(泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1)的花盆中,封口膜封口進行馴化處理。1個月后由培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到室外培養(yǎng)并統(tǒng)計成活率。成活率=(成活苗數(shù)/移栽苗總數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖段腋芽分化誘導培養(yǎng)

將消毒后的莖段接種于不同配方植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng),均能誘導腋芽分化。外植體培養(yǎng)第7天可觀察到明顯的膨大現(xiàn)象(見圖1A),第10天時外植體上已經(jīng)萌發(fā)出幼嫩腋芽(見圖1B),第15天時腋芽已經(jīng)逐漸舒展開且又有新腋芽長出(見圖1C)。隨著時間延長,腋芽進一步分化形成出新的莖和葉片。培養(yǎng)30 d時,新生的莖明顯伸長且分化出3～5片葉片,與添加6-BA相比,未添加植物生長調(diào)節(jié)劑和添加KT的新生莖短而葉片寬厚(見圖1D、E和F)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),當培養(yǎng)基中添加0.5 mg/mL 6-BA和1.0 mg/mL 6-BA時,均可取得較好的培養(yǎng)效果。其中,添加1.0 mg/mL 6-BA時,外植體膨大率(88.89%)、腋芽誘導率(88.89%)和腋芽分化系數(shù)(1.56)均最大,培養(yǎng)效果最佳(見表1)。可見,添加1.0 mg/mL 6-BA的MT培養(yǎng)基是誘導枳雀莖段腋芽分化的最佳培養(yǎng)基。

表1 不同濃度KT和6-BA對枳雀莖段腋芽分化的影響

注:A:外植體膨大(培養(yǎng)7 d);B:腋芽萌發(fā)(培養(yǎng)10 d);C:發(fā)育階段的腋芽,箭頭所示為新萌發(fā)的腋芽(培養(yǎng)15 d);D:附加6-BA形成的腋芽(培養(yǎng)30 d);E:MT培養(yǎng)基萌發(fā)的腋芽(不含任何激素,培養(yǎng)30 d);F:附加KT形成的腋芽(培養(yǎng)30 d)。

2.2 生根培養(yǎng)

將枳雀莖段誘導出的幼芽,在添加不同濃度IBA的1/2 MT和1/2 MSN培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。1/2MT培養(yǎng)基最早出根時間為9 d,1/2MSN培養(yǎng)基最早出根時間為18 d。培養(yǎng)45 d時,1/2MT培養(yǎng)基誘導出的根細長,而1/2MSN培養(yǎng)基誘導出的根則比較粗短(見圖2A、B和C);在組培瓶中培養(yǎng)90 d時,根均進一步伸長且長出側(cè)根,在1/2MT培養(yǎng)基中莖段生長迅速、側(cè)根較少,在1/2MSN培養(yǎng)基莖段發(fā)育緩慢、側(cè)根更多(見圖2D、E和F)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)45 d,添加2.0 mg/mL IBA的1/2MT培養(yǎng)基的生根率(86.67%)最大,平均根長(7.75 cm)和生根系數(shù)(1.15)較大,總體生根效果最佳(見表2)。

表2 不同培養(yǎng)基和不同濃度IBA對枳雀幼芽生根的影響

注:A:1/2MT培養(yǎng)基,培養(yǎng)45 d;B:1/2MSN培養(yǎng)基,培養(yǎng)45 d;C:左為1/2MT培養(yǎng)基,右為1/2MSN培養(yǎng)基,培養(yǎng)45 d;D:1/2MT培養(yǎng)基,培養(yǎng)90 d;E:1/2MSN培養(yǎng)基,培養(yǎng)90 d;F:左為1/2MT培養(yǎng)基,右為1/2MSN培養(yǎng)基,培養(yǎng)90 d。

2.3 再生苗移栽和馴化

生根培養(yǎng)90 d、已經(jīng)生根的再生苗,去除組培瓶封口膜,在培養(yǎng)室中敞口3 d。用鑷子將根系發(fā)育良好的再生苗從培養(yǎng)基中輕輕夾出,注意不要損傷根系,隨后移栽到滅菌基質(zhì)上(見圖3)。移栽好后,在培養(yǎng)室內(nèi)采用封口膜封口(見圖3)和定期敞口的辦法進行馴化處理,即每3 d進行一次敞口,敞口時間隨敞口次數(shù)的增加而延長,分別為1、2、4、8、12 h,最后完全敞口,1個月后轉(zhuǎn)移至室外進行培養(yǎng)。移栽后完成馴化的幼苗,葉片鮮綠,莖段相比于移栽前進一步發(fā)育(見圖3)。試驗共移栽枳雀組培苗100株,成活率高達96%。

圖3 枳雀組培苗的移栽和馴化

3 討論

建立高效的植物再生體系是轉(zhuǎn)基因研究的基礎。目前關(guān)于柑桔組織培養(yǎng)的報道已有很多,但不同柑桔種類之間的再生仍存在一定差異。洪磊等[17]以化州桔紅成年態(tài)半木質(zhì)化新梢莖段為外植體的腋芽誘導率為60%以上。Ramha等[18]在關(guān)于“Maltese halfblood”的報道中,芽萌發(fā)率僅有40%左右。本研究中以枳雀實生幼苗莖段為外植體,腋芽誘導率高達88.89%。本試驗結(jié)果與前人研究存在差異的主要原因可能是試驗所取外植體及培養(yǎng)條件不同。

植物生長調(diào)節(jié)劑對植物離體再生發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中,細胞分裂素在植物芽再生過程中作用顯著,大多數(shù)植物材料以6-BA最為有效,但不同材料最適6-BA濃度卻存在較大差異[19]。文露清等[20]在研究金柑時發(fā)現(xiàn),2.0 mg/mL 6-BA最適合進行幼芽分化。鄒金美等[21]在研究文旦柚和下河蜜柚成年樹幼嫩莖段外植體不定芽分化時僅添加0.5 mg/mL 6-BA便可取得較好的再生效果。本試驗發(fā)現(xiàn),最適合枳雀實生幼苗莖段外植體腋芽分化的6-BA濃度為1.0 mg/mL。以上結(jié)果證實6-BA在誘導芽分化過程中起著關(guān)鍵作用,最適6-BA濃度可能與柑桔種類等有關(guān)。

生長素在植物離體再生過程中對根系誘導有著顯著的作用,其中以IBA的促根效果最好,且根的進一步生長較為正常。楊莉等[22]在誘導金柑生根時發(fā)現(xiàn),添加3.0 mg/mL IBA的1/2 MS培養(yǎng)基更適于金柑幼芽生根,生根率為86.7%。Tongbram等[16]發(fā)現(xiàn),在1/2 MSN培養(yǎng)基中添加1.0 mg/mL IAA更有助于粗檸檬(CitrusjambhiriLush.)幼芽生根,生根率為80%。本試驗中,誘導枳雀幼芽生根的最佳培養(yǎng)條件為附加2.0 mg/mL IBA的1/2MT培養(yǎng)基,生根率為86.67%。

4 結(jié)論

枳雀幼嫩莖段外植體,以MT+1.0 mg/mL 6-BA培養(yǎng)基最適合腋芽分化,腋芽誘導率為88.89%,分化系數(shù)為1.56;最佳生根培養(yǎng)基為1/2MT+2.0 mg/mL IBA,平均根長為7.75 cm,生根率為86.67%,生根系數(shù)為1.15。本研究首次建立了柑桔品系枳雀的快速繁育體系,為后續(xù)的枳雀快繁體系優(yōu)化及遺傳轉(zhuǎn)化工作奠定了基礎。