李 琴,周靜茹,張旭華,倪 萍,任海燕,陳鄔錦

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)又稱綠膿桿菌,是一種條件致病菌,常定居于正常人體的皮膚、呼吸道、消化道和黏膜等部位。因其具有遷移、定植、免疫逃逸、釋放毒素及對抗生素抵抗等能力,因此該菌常引起肺、皮膚及軟組織等部位的感染[1-2]。特別是病情重、病程長、免疫力低下的患者,例如燒傷、外傷、新生兒及老年患者易受其感染[3]。銅綠假單胞菌感染相關的疾病中,肺部感染引起的疾病死亡率在25%～39%,菌血癥引起的死亡率在18%～61%,而多重耐藥銅綠假單胞菌感染引起死亡率甚至可高達40%～70%,由此可見,銅綠假單胞菌感染不僅僅是臨床感染問題,更是值得全社會關注、急需解決的公共衛(wèi)生問題。

銅綠假單胞菌可分泌多糖類胞外聚合物使菌體相互纏繞、盤結生成的生物膜(bacterial biofilm,BF),導致機體無法及時清除病灶從而增強感染進程[4]。銅綠假單胞菌鞭毛的合成較為復雜,牽涉到40多個基因表達。此外,其所需的結構蛋白和其他蛋白通過鞭毛介導的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system,T3SS)分泌,該系統(tǒng)主要由6種跨膜蛋白(FlhA、FlhB、FliO、FliP、FliQ、FliR)以及細胞質溶膠蛋白(FliH、FliI、FliJ)構成[5]。其中FliI蛋白是鞭毛特異性輸出的蛋白轉位酶的催化亞基,屬于ATP酶的一種,與FliJ和FliH的二聚體相互作用,在向T3SS提供能量方面發(fā)揮著重要作用[6]。但FliI對銅綠假單胞菌鞭毛功能和生物膜形成的影響未見報道。因此,本研究構建fliI基因缺失株,通過對比基因敲除前后菌株運動能力、生物膜形成能力及鞭毛的形成等方面進一步探討,分析fliI對銅綠假單胞菌鞭毛相關功能的影響,為銅綠假單胞菌致病機制的研究及其所致疾病的治療奠定基礎和提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 載體和感受態(tài) 銅綠假單胞菌標準菌株(菌號:ATCC9027)為本實驗室保存;大腸桿菌基因編輯型自殺質粒pEX18TC購于淼靈生物;大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞購于武漢技術有限公司。

1.1.2 主要試劑 LB液體、LB固體培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司;DNA Ladder、瓊脂糖均購自北京全式金生物技術有限公司;I-5TM2×High-Fidelity Master Mix購自北京擎科新業(yè)生物技術有限公司;EcoR I和Hind III限制性內切酶購自New England Biolabs公司;ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;Tet四環(huán)素抗生素購自北京索萊寶科技有限公司;質粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 目的片段的合成及擴增引物的設計 通過NCBI查找序列,fliI基因編碼蛋白ID為NP_249795.1,合成包含片段1:606 bp 5′端側翼序列+fliI(1～399 bp);片段2:fliI(1 081～1 356 bp)+568 bp 5′端側翼序列,該片段由武漢淼靈生物技術有限責任公司合成。根據(jù)合成的片段1和片段2序列設計擴增引物;GM抗性盒擴增引物(以現(xiàn)有質粒P2322/pUCGM為模板);鑒定引物(F4位于pEX18TC自殺載體上,R4位于目的片段上),見表1。

表1 構建fliI基因缺陷特異性質粒

1.2 方 法

1.2.1 同源重組構建pEX18TC-ΔfliI含同源臂片段1、GM抗性盒、片段2及線性pEX18TC載體的純化產(chǎn)物最終濃度分別為40 ng/μL、45 ng/μL、24 ng/μL及60 ng/μL。按照多片段同源重組酶的計算公式,重組反應所需DNA量=0.02×片段堿基數(shù)/濃度,最終按1∶1∶2∶4的比例分別添加含同源臂片段1、GM抗性盒、片段2及線性載體的DNA產(chǎn)物,50 ℃、15 min進行連接。連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞,菌落PCR鑒定陽性轉化子,質粒提取送測序,命名為pEX18Tc-△fliI。

1.2.2 銅綠假單胞菌感受態(tài)細胞制備及轉化 銅綠假單胞菌感受態(tài)細胞制備,菌種在LB培養(yǎng)基平板劃線活化,挑單菌落接入10 mL液體LB中,30 ℃、180 r/min培養(yǎng)14 h,按1∶100的接種量接入新鮮的液體LB中,30 ℃、180 r/min培養(yǎng)2～4 h至OD600為0.5左右,將菌液轉移到50 mL離心管中,冰浴20 min,4 ℃、7 000×g 離心10 min 收集菌體,無菌蒸餾水洗滌菌體3次,再用75 mmol/L CaCl2溶液洗滌1次,冰浴預冷的CaCl2溶液處理菌體1 h,加入0.7 mL CaCl2和 0.3 mL 50% 甘油,重懸菌體按每管100 mL分裝。轉化條件:75 mmol/L CaCl2,熱激 4.5 min,復蘇0.5 h。均勻涂布于含Tet四環(huán)素抗生素(10 μg/mL)的LB平板上,經(jīng)鑒定引物(F4位于pEX18TC自殺載體上,R4位于目的片段上)檢測轉化情況,經(jīng)EcoR I和Hind Ⅲ雙酶切檢測載體與目標條帶大小,構建PA YFY22的fliI的基因缺陷株。

1.2.3 菌落形態(tài)的測定 將PA-ΔfliI與對照組PA的單菌在LB瓊脂平板上劃線,37 ℃下分別在12 h和24 h觀察菌落形態(tài)。

1.2.4 掃描電鏡觀察 將PA-ΔfliI與對照組PA對數(shù)生長期的新鮮菌液制備成106CFU/mL的菌液100 μL,接種至放有24 mm×24 mm無菌蓋玻片及10 mL LB肉湯的平皿中培養(yǎng)24～48 h。取出培養(yǎng)皿中的蓋玻片,使用無菌PBS沖洗2～3遍,將其置于2.5%戊二醛中4 ℃固定12 h。1/15 mol/L PBS(pH為7.2～7.4)漂洗3次,15 min/次;分別在50%、70%、80%、90%及100%叔丁醇梯度脫水;在樣品盒中加入沒過樣品的100%叔丁醇,置4 ℃,待叔丁醇結冰時,置JEOL JFD-320冷凍干燥儀中干燥;將樣品進行粘臺:將樣品置JFC-1600離子濺射鍍膜儀中鍍膜,上機觀察。

1.2.5 運動性的測定 分別將PA-ΔfliI與對照組PA對數(shù)生長期的細菌穿刺接種于LB半固體培養(yǎng)基中,在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)36 h觀察觀察菌株的運動性。

1.2.6 生物膜形成能力測定 取PA-ΔfliI與對照組PA對數(shù)生長期(OD600≈0.5)的菌液100 μL加入96孔板,分別于2、6、10、12 h時棄去培養(yǎng)板,培養(yǎng)液結晶紫染色15 min后再用無菌PBS洗滌3次,自然風干,隨后于33%冰乙酸中作用30 min,590 nm條件下用酶標儀測定培養(yǎng)孔中溶液的吸光度值(A值),平行3個重復,計算其平均值。以未接種菌的培養(yǎng)液作為陰性對照,A值反映生物膜與接觸表面黏附的牢固程度。

2 結 果

2.1 pEX18TC-ΔfliI載體構建fliI基因融合片段連接pEX18Tc載體,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示,fliI片段1、GM抗性盒、fliI片段2條帶與預期位置相符,基因產(chǎn)物大小分別為1 045 bp、791 bp、884 bp,如圖1所示。

A:M.DL5000 DNA marker;1.FliI-target product1;2.FliI-target product2。B:M.DL5000 DNA marker;1.GM抗性盒target product。

2.2 同源重組構建PA-ΔfliI將pEX18Tc-ΔfliI熱轉入PA YFY22感受態(tài)細胞中,經(jīng)鑒定引物F4、R4(重組后產(chǎn)物445 bp)檢測和測序后得到陽性轉化子(圖2A);經(jīng)載體酶切結果,根據(jù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示,酶切條帶與預期位置相符,載體雙酶切后大小為6 321 bp(圖2B)。成功構建fliI突變株并命名為PA-ΔfliI。

2.3 PA-ΔfliI菌落形態(tài)的檢測 對照組PA菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h、48 h后,呈現(xiàn)直徑1.5～2 mm、圓形、粗糙、半透明、邊緣不整齊、具有遷徙性的菌落(圖3A、3C);PA-ΔfliI菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h、48 h后,呈現(xiàn)直徑約1 mm、圓形、光滑、半透明、邊緣整齊的菌落(圖3B、3D)。

A、C:PA at 24 h,48 h; B、D:PA-ΔfliI at 24 h,48 h

2.4 PA-ΔfliI運動性的測定 在半固體培養(yǎng)基30 ℃靜置培養(yǎng)后,對照組PA延穿刺線擴散生長(圖4A);PA-ΔfliI延穿刺線生長(圖4B)。PA-ΔfliI的運動能力下降明顯,敲除fliI基因后銅綠假單胞菌鞭毛的運動能力明顯減弱。

A:PA;B:PA-ΔfliI

2.5 PA-ΔfliI掃描電鏡觀察 經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),對照組PA相比,PA-ΔfliI菌體表面鞭無明顯減少(圖5),敲除fliI基因對銅綠假單胞菌鞭毛的形成沒有影響。

A:PA;B:PA-ΔfliI

2.6 PA-ΔfliI生物膜形成能力的形態(tài)觀察 通過96孔板培養(yǎng)并用結晶紫染色發(fā)現(xiàn),PA鞭毛相關基因fliI敲除前生物膜形成較為致密,著色較深(圖6A);敲除后生物膜形成不穩(wěn)定,易脫落且著色較淺(圖6B)。檢測吸光度值(A值)發(fā)現(xiàn)fliI基因敲除后生物膜形成能力在4 h、6 h、24 h時明顯降低(t4 h=8.253,P=0.014;t6 h=4.554,P=0.009;t24 h=7.602,P=0.017),說明fliI基因敲除后銅綠假單胞菌生物膜形成受到影響(圖7)。

A:PA;B:PA-ΔfliI

*:P<0.05;**:P<0.01

3 討 論

研究表明,細菌可以分泌多糖類物質在體內生成生物膜等方式致病[7-9]。越來越多的研究表明鞭毛除了運動性以外,致病型菌株可以通過鞭毛的運動性增加細菌與宿主細胞之間的接觸而黏附于宿主細胞,同時通過鞭毛蛋白特異性與被感染細胞的鞭毛受體結合完成細菌的黏附和侵襲[10-11]。綿羊腦炎單核細胞增生李斯特菌flaA基因的缺失,運動性降低了63.77%,對宿主的致病性顯著降低[12]。缺失鞭毛的大腸桿菌對細胞的黏附能力下降,說明鞭毛對宿主細胞的黏附起重要的作用[13],銅綠假單胞菌的鞭毛相關基因f1hF缺失后,導致泳動和爬行能力缺陷。銅綠假單胞菌的鞭毛合成和調控牽涉到40多個基因參與,fliI是Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system,T3SS)鞭毛相關基因[14-15],為鞭毛蛋白的轉運提供能量,促進細菌鞭毛蛋白的輸出[16],是輸出系統(tǒng)中唯一的ATP酶,但其作用機制尚不清楚[6]。本研究通過Red同源重組技術構建銅綠假單胞菌鞭毛相關基因fliI的缺失株。通過菌落形態(tài)觀察、動力試驗以及掃描電鏡觀察等,顯示銅綠假單胞菌fliI基因缺失未影響鞭毛的形成,但相較原始株,其菌落遷徙能力減弱,運動能力顯著下降,由此可判斷該菌對環(huán)境的適應能力和生存能力都受到影響,提示當PA-ΔfliI進入機體后運動能力降低,則有可能被機體的免疫系統(tǒng)清除。

此外,鞭毛除了與細菌運動性相關,還可通過纏繞及釋放粘性物質與靜態(tài)及者動態(tài)的菌體發(fā)生聚集,這種運動性能在生物膜的形成中起到非常重要的作用[17]。研究表明,fliC、flaA鞭毛基因缺失分別使大腸桿菌及綿羊腦炎單核細胞增生李斯特菌體外形成生物膜的能力下降[18-19]。既往研究表明,銅綠假單胞菌能形成完整且致密的生物膜[20],該種生物膜形成后有以下作用:1) 阻滯抗生素的滲透; 2) 吸附抗生素滅活酶; 3) 使膜內包裹的細菌處于休眠狀態(tài),使其對抗生素敏感性降低; 4) 阻止機體免疫系統(tǒng)對該菌的清除,使其免疫逃逸和感染持續(xù)等[21-22],因此鞭毛的運動和黏附作用能夠促進生物膜的形成,促進細菌致病[23]。本研究構建fliI基因缺陷株,雖然缺陷株并未完全失去生物膜形成能力,但生物膜形成不穩(wěn)定,結構松散、致密性降低、易脫落,表明fliI基因缺陷菌株形成生物膜能力明顯下降,生物膜明顯減少可能是由于fliI缺失造成鞭毛輸出能量不足,鞭毛運動能力下降,減少了細菌初始表面附著,生物膜生成受抑。

本研究結果表明,fliI基因在銅綠假單胞菌鞭毛形成、運動和生物膜形成中起著重要作用,直接或者間接影響了PA鞭毛的功能和生物膜的形成。在fliI敲除情況下,細菌運動功能基本喪失,導致銅綠假單胞菌生物膜生成顯著減少。鑒于鞭毛和生物被膜在銅綠假單胞菌致病性中的重要作用,我們將通過體內試驗來進一步闡明fliI的致病作用。

利益沖突：無

引用本文格式：李琴,周靜茹,張旭華,等.銅綠假單胞菌鞭毛基因fliI的敲除對其鞭毛形成及生物膜生成的影響[J].中國人獸共患病學報,2023,39(9):837-842.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.099