楊美盼 , 王 珊 , 何樹梅 , 郭 迅 , 謝婉冰

(西藏民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 高原相關(guān)疾病分子遺傳機(jī)制與干預(yù)研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 環(huán)境與疾病相關(guān)基因研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 , 陜西 咸陽 712082)

20世紀(jì)60年代末期,冠醚化合物和陰離子的配位作用預(yù)示著人類正式步入超分子化學(xué)的大門。熒光探針、超分子結(jié)合劑、化學(xué)傳感器的設(shè)計(jì)都可能引起傳感和醫(yī)學(xué)診斷的革命。熒光探針的熒光發(fā)色團(tuán)在與受體特異性反應(yīng)或結(jié)合時,隨著結(jié)構(gòu)的變化,誘導(dǎo)熒光發(fā)射出現(xiàn)了明顯改變,以光信號表達(dá)識別過程。

氧雜蒽結(jié)構(gòu)是一類重要的熒光發(fā)色團(tuán),主要包含羅丹明、熒光素、羅丹熒三類。基本的識別機(jī)制源于環(huán)的開關(guān),實(shí)現(xiàn)熒光信號的有無。如對于羅丹明衍生物結(jié)構(gòu)中存在閉合的五元內(nèi)酰胺環(huán),探針本身無熒光。當(dāng)受到目標(biāo)體的誘導(dǎo)五元環(huán)被打開,呈現(xiàn)出顯著的熒光信號。此類探針由于其優(yōu)異的光學(xué)性能,已成為構(gòu)建熒光探針的平臺,被很多研究者熟知。從最初的離子識別到生物小分子識別、醫(yī)學(xué)診療等方面,都取得了很大的進(jìn)展。

1 氧雜蒽類熒光探針

1.1 金屬離子識別

金屬離子在許多生物體內(nèi)參與各種生理代謝過程,離子的過量、缺失都可能會引起各種功能障礙或者相關(guān)疾病[1]。

XIANG等[2]將兩個羅丹明母體結(jié)構(gòu)通過二亞乙基三胺連接,合成得到一種新型的熒光探針1(見圖1),對Fe3+有較高的選擇性。加入Fe3+后,五元內(nèi)酰胺環(huán)打開,溶液顏色發(fā)生變化,同時在500～600 nm內(nèi)觀察到熒光信號顯著增強(qiáng)。該探針還可用于Fe3+的裸眼檢測。

圖1 探針1識別Fe3+機(jī)制

YANG等[3]設(shè)計(jì)將2-氨基咪唑結(jié)構(gòu)引入羅丹明母體中,構(gòu)建了羅丹明六元螺環(huán)探針2,見圖2。相比于傳統(tǒng)的五元螺環(huán)結(jié)構(gòu),該探針設(shè)計(jì)為六元環(huán),為設(shè)計(jì)更多新型羅丹明探針提供了新的思路。研究發(fā)現(xiàn),探針對超低濃度金屬離子的檢測性能優(yōu)于傳統(tǒng)五元內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)。通過Cu2+誘導(dǎo)催化水解引起C—C和C—N鍵的裂解,實(shí)現(xiàn)對Cu2+的超敏檢測。探針檢測的LOD 為35 pmol/L,靈敏度為80 nmol/L。生物成像研究表明,探針具有良好的細(xì)胞膜通透性,可以監(jiān)測活細(xì)胞中Cu2+。這種獨(dú)特的C—C鍵和C—N鍵的裂解方式,為超敏熒光探針的設(shè)計(jì)開辟了新的途徑。

圖2 探針2識別Cu2+機(jī)制

LIU等[4]開發(fā)了一種靈敏度和選擇性都優(yōu)良的NIR turn-on型探針3,用于Cu2+的體內(nèi)外傳感和成像。如圖3所示,Cu2+誘導(dǎo)螺酰胺環(huán)打開,進(jìn)一步水解,釋放探針在近紅外區(qū)段的熒光。Cu2+在水溶液的檢測極限3.2×10-9,低于美國環(huán)保局制定的飲用水Cu2+最高水平(1.30×10-6)。該探針的應(yīng)用不僅為Cu2+相關(guān)疾病的臨床監(jiān)測及治療提供了重要途徑,而且在診斷方面有廣闊的應(yīng)用前景。

圖3 探針3識別Cu2+機(jī)制

1.2 活性氧識別

YANG等[6]設(shè)計(jì)了一種高選擇性、高靈敏度的熒光化學(xué)傳感器,用于檢測水溶液中的HOCl。探針4的識別是基于羥肟酸結(jié)構(gòu)發(fā)生次氯酸氧化水解反應(yīng),C—N鍵斷開,將螺環(huán)非熒光形式轉(zhuǎn)化為開環(huán)熒光形式。室溫下,HOCl誘導(dǎo)反應(yīng)迅速進(jìn)行,得到探針開環(huán)形式,且不可逆。探針在水溶液中的檢測限為25 nmol/L。A549細(xì)胞和斑馬魚內(nèi)的熒光成像表明,探針可以用于檢測活細(xì)胞和生物體中的HOCl。

ZHANG等[7]將羅丹明結(jié)合四苯基乙烯,報道了一種基于AIE效應(yīng)的比率熒光探針5,可用于檢測外源性和內(nèi)源性次氯酸水平,鑒別癌細(xì)胞和正常細(xì)胞。該探針是基于AIE和DTBET效應(yīng)的比率熒光特性,具有良好的靈敏度和識別特異性。此外,探針具有優(yōu)良的光譜和生物性能,如低毒性、比色和熒光雙通道反應(yīng)、識別穩(wěn)定和持久,可為疾病相關(guān)的HClO檢測提供途徑。

GONG等[8]合成了一種基于氧雜蒽-半花菁結(jié)構(gòu)的新型NIR線粒體靶向熒光探針6。探針的Stokes位移為130 nm,大于傳統(tǒng)的羅丹明染料和很多已報道的氧雜蒽類次氯酸探針。基于ICT效應(yīng),探針在654 nm處表現(xiàn)出明顯的熒光發(fā)射,快速響應(yīng)(30 s),可用于特異性檢測次氯酸,具有較高的選擇性和靈敏度。同時,探針能夠滲透細(xì)胞膜并在線粒體中積累,用于監(jiān)測活細(xì)胞線粒體中次氯酸濃度的變化。CHEN等[9]基于依達(dá)拉奉對羥基自由基的清除機(jī)制,設(shè)計(jì)合成了·OH的turn-on響應(yīng)型熒光探針7。基于TICT效應(yīng),探針在水溶液中幾乎無熒光。如圖4所示,在·OH作用下,依達(dá)拉奉酮亞基轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的氧化產(chǎn)物,導(dǎo)致579 nm處熒光顯著增強(qiáng)。探針可用于不同條件下活細(xì)胞和斑馬魚內(nèi)源性·OH的成像,具有較高的選擇性和敏感性,不受其他ROS的干擾。同時,探針可根據(jù)·OH的水平來區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞,是監(jiān)測活體內(nèi)·OH的有力工具。

圖4 探針7對·OH的可能識別機(jī)制

于思為等[10]報道了一例氧雜蒽類ClO—熒光探針8。該探針以連續(xù)的碳碳雙鍵連接氧雜蒽結(jié)構(gòu)和苯并噻唑基團(tuán),巧妙地設(shè)計(jì)了既有推拉電子結(jié)構(gòu),又有長共軛體系和潛在的次氯酸反應(yīng)位點(diǎn)。探針在人肺腺癌(A549)細(xì)胞內(nèi)可以檢測次氯酸根,并產(chǎn)生明顯的紅色熒光,在生理學(xué)和病理學(xué)研究方面具有潛在的應(yīng)用價值。YAO等[11]報道了一種基于FRET機(jī)制下,脫硫環(huán)化的次氯酸雙光子比率熒光探針9。探針利用苯基間隔層連接羅丹明-氨基硫脲和吡啶-萘酰亞胺,可用于HClO裸眼檢測。探針在HClO的作用下,出現(xiàn)開關(guān)信號響應(yīng),600 nm處觀察到明顯的熒光發(fā)射峰,同時顏色由綠色變成粉紅色。通過證實(shí),識別過程是基于HClO誘導(dǎo)羅丹明內(nèi)酰胺環(huán)打開,羅丹明-氨基硫脲轉(zhuǎn)化為羅丹明-1,3,4-口惡二唑。該探針具有較高靈敏度(檢測限<9.6×10-8mol/L),較寬的pH值響應(yīng)范圍(4～11),響應(yīng)時間快,抗干擾能力強(qiáng),選擇性好。WANG等[12]首次報道了一種具有大的斯托克斯位移(158 nm)的NIR熒光探針10,用于檢測潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中的過氧化氫。

圖5 探針10對H2O2識別的可能機(jī)制

如圖5所示,由于ICT效應(yīng)被硼酸酯基團(tuán)阻斷,探針本身無熒光,加入過氧化氫后,除去硼酸酯結(jié)構(gòu),羥基暴露,出現(xiàn)ICT誘導(dǎo)的強(qiáng)熒光。探針遇H2O2后出現(xiàn)明顯的熒光增強(qiáng),檢測中展示出良好的選擇性。線性范圍為0.1～100 μmol/L,檢測限為0.033 μmol/L。探針被用于HepG2細(xì)胞和HCT116細(xì)胞中的過氧化氫熒光成像。此外,探針已成功應(yīng)用于實(shí)時監(jiān)測UC小鼠體內(nèi)過氧化氫的變化,將為UC的臨床研究提供有效分析途徑。

有研究表明,過氧亞硝酸鹽(ONOO—)與中毒性肝炎的發(fā)生有關(guān)。TIAN等[13]報道了一系列具有長發(fā)射波長和大Stokes位移的新型NIR熒光探針11,能監(jiān)測外源性和內(nèi)源性O(shè)NOO—。探針具有較好的靈敏度,檢測限為3.3 nmol/L。此外,可通過熒光成像、3D定量分析、流式細(xì)胞術(shù)檢測CCl4誘導(dǎo)的細(xì)胞中毒性肝炎的ONOO—,評價三種保肝藥物(N-乙酰半胱氨酸、水飛薊素、聯(lián)苯雙酯)的治療效果,為中毒性肝炎的臨床應(yīng)用(如診斷、治療)提供了有用的工具。

XIE等[14]團(tuán)隊(duì)利用α-酮酰胺和過氧化氫的特異性反應(yīng),結(jié)合ICT機(jī)制,開發(fā)了一種新型過氧化氫專用NIR探針12。探針具有高特異性、高靈敏度、快速反應(yīng)等優(yōu)勢,并且在線粒體定位方面具有良好的特性,能跟蹤活細(xì)胞和動物產(chǎn)生的內(nèi)源性過氧化氫,在缺血灌注損傷模型中實(shí)現(xiàn)了過量過氧化氫的可視化檢測,提出了過氧化氫與缺血灌注損傷有密切關(guān)系的直接證據(jù)。該設(shè)計(jì)思路可應(yīng)用于各類過氧化氫傳感器的研究中,在過氧化氫高效監(jiān)測中具有巨大的應(yīng)用潛力,以期用于更多的生物分析和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中。

WU等[15]等報道了一類雙通道熒光探針13,由兩部分響應(yīng)單元組成。如圖6所示,通過不同的激發(fā)波長,探針可分別檢測過氧亞硝酸鹽(ONOO—)和三磷酸腺苷(ATP)。ONOO—選擇性氧化硼酸酯,得到熒光4-羥基-1,8-萘酰亞胺,λex= 450 nm,λem=562 nm。單獨(dú)加入ATP,羅丹明開環(huán),λex=520 nm,λem=587 nm。研究發(fā)現(xiàn),通過使用兩種不同的通道,可同時監(jiān)測APAP誘導(dǎo)的肝毒性損傷中ONOO—的增加和ATP的消耗。由于ONOO—的增加和ATP的消耗被認(rèn)為是導(dǎo)致肝壞死的原因,這一監(jiān)測為APAP誘導(dǎo)毒性的信號通路提供了一定支持。

圖6 Turn-on型探針13的識別機(jī)制

1.3 小分子生物硫醇識別

生物體中小分子硫醇包含半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、同型半胱氨酸(Hcy)。在生命過程中起著不可或缺的作用,如蛋白質(zhì)的合成、調(diào)節(jié)氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)、解毒和代謝以及免疫力增強(qiáng)等。小分子硫醇的檢測對于疾病的診治特別關(guān)鍵,該類熒光探針的研究也引起了廣泛的關(guān)注。

以羅丹明衍生物作為熒光發(fā)色團(tuán)母體,合成了一類反應(yīng)型近紅外熒光探針14。探針本身無熒光,通過醛基部分與谷胱甘肽( GSH)的巰基發(fā)生加成反應(yīng),觸發(fā)螺環(huán)的開關(guān)來實(shí)現(xiàn)熒光信號的改變,熒光產(chǎn)物具有760 nm 的近紅外發(fā)射波長。此外,該探針實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中GSH的成像研究。

XIE等[16]報道了一種具有螺環(huán)內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的高熒光量子產(chǎn)率NIR熒光探針15,用于識別谷胱甘肽(GSH)。加入GSH后,探針熒光增強(qiáng)75倍,同時表現(xiàn)出較高的熒光量子產(chǎn)率(Φ= 0.43)。此外,該探針具有較好的選擇性,不易受到其他生物硫醇(Cys、Hcy)或氨基酸的干擾。NIR探針在活細(xì)胞和組織等生物樣本中表現(xiàn)出對GSH的選擇性檢測?；?H NMR、13C NMR 和MS的測定結(jié)果,提出了探針的識別機(jī)制。NIR熒光探針有望通過改變識別位點(diǎn),廣泛應(yīng)用于生物分析物的檢測。

YU等[17]設(shè)計(jì)并合成了一種新型的喹啉基-羅丹明染料16,通過擴(kuò)大π共軛體系來實(shí)現(xiàn)近紅外熒光發(fā)射,檢測線粒體中半胱氨酸和同型半胱氨酸。利用羅丹明平臺的酰胺環(huán)開關(guān)狀態(tài)構(gòu)建了比率熒光探針。在近紅外和可見光發(fā)射之間,探針對Cys/Hcy表現(xiàn)出顯著的雙通道熒光響應(yīng),具有較高的選擇性和敏感性,對Cys和Hcy的檢出限分別為0.12 μmol/L和0.25 μmol/L。此外,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成像表明,探針具有良好的線粒體靶向能力,較低的細(xì)胞毒性和比率響應(yīng),可用于細(xì)胞中Cys/Hcy定量分析。

1.4 生物酶識別

生物酶在許多生理功能和疾病中發(fā)揮重要作用,如催化細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)底物特定肽鍵的裂解。酶活性的改變被認(rèn)為與腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥有關(guān)。因此,靈敏和準(zhǔn)確地檢測活體中的酶活性對生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究至關(guān)重要。

LIU等[18]開發(fā)了一種新型線粒體靶向近紅外熒光探針17,檢測活細(xì)胞中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性。如圖7所示,由于酰胺鍵的形成破壞了氨基的供電子能力,破壞了推拉結(jié)構(gòu),熒光探針本身無熒光發(fā)射。將谷氨酸偶聯(lián)到氧雜蒽結(jié)構(gòu)上,GGT介導(dǎo)的酰胺鍵的裂解,釋放出具有GGT活性依賴的初始熒光團(tuán),ICT效應(yīng)導(dǎo)致熒光顯著增強(qiáng),可用于GGT檢測和成像研究。該探針可被GGT特異性激活,LOD為0.40 UL-1。該探針在生理?xiàng)l件下具有良好的選擇性和穩(wěn)定性。此外,探針還被成功地用于線粒體內(nèi)GGT活性成像,具有快速響應(yīng)和良好的識別特異性。由于其近紅外激發(fā)和發(fā)射,分析性能良好,在檢測活細(xì)胞、小動物模型中的線粒體GGT活性,闡明與GGT相關(guān)疾病的生理和病理作用等方面具有巨大的潛力。

圖7 探針17對GGT的響應(yīng)機(jī)制

SAKABE等[19]報道了一系列羥甲基羅丹明衍生物18。研究中發(fā)現(xiàn)了一個有趣的分子內(nèi)螺環(huán)化現(xiàn)象。羥甲基羅丹明綠本身是打開的非螺環(huán)結(jié)構(gòu),具有強(qiáng)熒光。而生理pH值范圍內(nèi),探針羥甲基羅丹明綠的乙?；苌镌谒芤褐幸蚤]合的螺環(huán)結(jié)構(gòu)存在,無色、無熒光。羥甲基羅丹明綠可以作為構(gòu)造支架,在生理pH值下的一步酶促反應(yīng)產(chǎn)生顯著的動態(tài)熒光變化?；谠撛O(shè)計(jì)策略,開發(fā)出通過用目標(biāo)酶的底物取代探針的乙?；?來獲得蛋白酶和糖苷酶的高靈敏度熒光探針。靶酶對熒光探針中底物部分進(jìn)行特異性切割,產(chǎn)生明顯的熒光信號。研究組設(shè)計(jì)并合成了能特異性識別三種酶的探針,包括亮氨酸氨基肽酶(Leu-HMRG)、成纖維細(xì)胞活化蛋白(Ac-GlyPro-HMRG)和β-半乳糖苷酶(βGal-HMRG)。由于螺環(huán)結(jié)構(gòu)的存在,探針幾乎無熒光,但可被靶酶有效地轉(zhuǎn)化為高熒光的羥甲基羅丹明綠,還可用于活細(xì)胞。探針保留了羅丹明優(yōu)異的光學(xué)特性,如亮度和光穩(wěn)定性,并具有明顯的識別優(yōu)勢,包括高靈敏度、快速響應(yīng)和抗光漂白性,有望用于生物學(xué)和病理研究中。

WANG等[20]首次報道了一種水溶性NIR熒光探針19,可在糖尿病診斷和治療過程中監(jiān)測堿性磷酸酶(ALP)活性。該探針基于喹啉-氧雜蒽結(jié)構(gòu),由于分子內(nèi)ICT效應(yīng)被磷酸基團(tuán)阻斷,探針本身無熒光,與ALP反應(yīng)后,磷酸基團(tuán)水解,羥基被釋放,ICT過程恢復(fù),在770 nm處出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光信號。與經(jīng)典的半花菁染料相比,探針具有較長的吸收和發(fā)射波長,而且原料易得、合成步驟簡單。探針表現(xiàn)出較好的靈敏度和選擇性,還用于觀察不同細(xì)胞中ALP的活性。研究證實(shí),糖尿病小鼠體內(nèi)的ALP水平高于正常小鼠。在使用降糖藥物(二甲雙胍)治療后,糖尿病小鼠體內(nèi)ALP的產(chǎn)生顯著減少。因此,該探針可能成為研究ALP在糖尿病診斷和治療中具有臨床意義的有力工具。

WU等[21]合成了一種新型高靈敏度和高選擇性的熒光探針20,可檢測細(xì)胞內(nèi)源性酪氨酸酶活性。設(shè)計(jì)將3-羥基苯基識別部位引入間苯二酚結(jié)構(gòu)中,探針可靈敏檢測微量酪氨酸酶,檢測限為0.04 U mL-1。共聚焦熒光成像檢測B16、HepG2和MCF-7等不同細(xì)胞中酪氨酸酶的相對水平,結(jié)果顯示,B16細(xì)胞的酪氨酸酶表達(dá)量最高。探針的優(yōu)良性能使其能在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中有選擇的、靈敏地檢測酪氨酸酶。此外,m-羥基苯基的高特異性可以應(yīng)用于合成其他熒光團(tuán)的酪氨酸酶熒光探針,也為設(shè)計(jì)酪氨酸酶抑制劑提供了新的策略。

HE等[22]報道了一例氧雜蒽類近紅外熒光探針21,對藥物誘導(dǎo)的肝損傷模型和肝癌中亮氨酸氨基肽酶(LAP)活性的成像研究,靈敏度較高。研究發(fā)現(xiàn),對乙酰氨基酚誘導(dǎo)LAP在兩種肝模型小鼠肝區(qū)均表達(dá)上調(diào),揭示了LAP在肝功能中的重要性及其在肝病診斷和治療中的潛在價值。由于其NIR特性,探針有望為研究LAP相關(guān)疾病提供有效途徑。

2 結(jié)語

氧雜蒽類熒光探針因其優(yōu)異的光譜性能和生物相容性,受到研究者的廣泛關(guān)注。近幾年,熒光探針的發(fā)展一直在向生物應(yīng)用、醫(yī)學(xué)診療深入,以期未來能在疾病的診斷與治療方面有更大的進(jìn)展和突破。