李懷偉，朱偉堃，王素香，畢天琛，張 朋

（山東省菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東菏澤 274000）

魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb. 的新鮮全草或干燥地上部分，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋功效，廣泛分布于我國(guó)南方各省，是一種藥食兩用植物［1-2］。研究表明，魚腥草含有黃酮類、酚類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、生物堿類等多種化合物，具有抗菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)咳、利尿、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等藥理學(xué)作用，臨床應(yīng)用價(jià)值較高［2-11］。為全面了解山東省內(nèi)流通和使用環(huán)節(jié)魚腥草飲片的質(zhì)量，保障臨床用藥安全，本研究中按2015年版和2020年版《中國(guó)藥典（一部）》魚腥草項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定，評(píng)價(jià)了25個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的33批次魚腥草飲片的質(zhì)量；并進(jìn)行了探索性研究，測(cè)定了其中重金屬及有害元素、黃酮類成分（金絲桃苷、槲皮苷）和有機(jī)酸類成分（新綠原酸）的含量；采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析測(cè)定結(jié)果，探討其相關(guān)性和樣品質(zhì)量的差異性，為魚腥草飲片的日常監(jiān)管和質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XS105 DualRange 型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬(wàn)分之一）；Agilent1260 型高效液相色譜儀，7700 Series 型電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）儀，均購(gòu)自美國(guó)Agilent 公司；ETHOS UP 型微波消解儀（意大利Milestonesrl公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；G-080S型超聲清洗機(jī)（深圳市歌能清洗設(shè)備有限公司，功率為480 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

乙腈、甲醇（色譜純），硝酸（優(yōu)級(jí)純），均購(gòu)自德國(guó)Merck 公司；磷酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水；甲基正壬酮對(duì)照品（批號(hào)為110834-202104，含量為99.7%），槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)為111538-202007，含量為93.5%），金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)為111521 - 201809，含量為94.9%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；新綠原酸對(duì)照品（成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)為DSTDX001503，含量為98.0%）；金標(biāo)準(zhǔn)溶液（國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，批號(hào)為203018-1，質(zhì)量濃度為1 000μg/mL）；多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為51-042CRY2，質(zhì)量濃度為10μg/mL），汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為12-20HGY2，質(zhì)量濃度為10μg/mL），內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為54-080CRY2，質(zhì)量濃度為100μg/mL），均購(gòu)自美國(guó)Agilent 公司；魚腥草飲片（33 批次，編號(hào)為Y1-Y33，樣品信息見(jiàn)表1）樣品標(biāo)示生產(chǎn)企業(yè)25家，其中河北11家，安徽8家，山東5家，湖北1家。

表1 魚腥草飲片樣品信息Tab.1 Information of Houttuyniae Herba decoction pieces

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

本品為不規(guī)則的段。莖呈扁圓柱形，表面為淡紅棕色至黃棕色，有縱棱。葉片多破碎，黃棕色至暗棕色。穗狀花序黃棕色。搓碎具魚腥氣，味澀。經(jīng)檢驗(yàn)，33 批次樣品均符合規(guī)定。不同批次的魚腥草飲片葉片和穗狀花序數(shù)量不同，可能與魚腥草生長(zhǎng)環(huán)境和采收季節(jié)有關(guān)；搓碎后氣味濃郁程度也不同，可能與魚腥草飲片存放環(huán)境和時(shí)間不同而導(dǎo)致其揮發(fā)性成分含量發(fā)生變化相關(guān)。

2.2 鑒別

顯微鑒別：33 批次魚腥草飲片均符合規(guī)定。樣品粉末中油細(xì)胞、非腺毛、腺毛、葉表皮細(xì)胞、氣孔、草酸鈣簇晶等在顯微鏡下均清晰可見(jiàn)。

化學(xué)反應(yīng)鑒別：取魚腥草飲片粉末適量，置小試管中，用玻璃棒壓緊，滴加品紅亞硫酸試液少量至上層粉末濕潤(rùn)，放置片刻，自側(cè)壁觀察，濕粉末應(yīng)顯粉紅色或紅紫色。結(jié)果33批次魚腥草飲片均符合規(guī)定，自側(cè)壁觀察，樣品濕粉末顯紅紫色。

薄層色譜鑒別：33 批次魚腥草飲片均符合規(guī)定，供試品溶液薄層色譜圖中，在與甲基正壬酮對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置均顯相同的黃色斑點(diǎn)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 魚腥草飲片薄層色譜圖1-7，9-16.Samples 8.Methylnonylketone referenceFig.1 TLC chromatogram of Houttuyniae Herba decoction pieces

2.3 檢查

水分：33 批次魚腥草飲片水分檢查結(jié)果為7.9%～12.7%，均符合規(guī)定（≤15.0%）。29 批次（87.88%）樣品的水分介于8.0%～12.0%范圍內(nèi)；4 批次（12.12%）超出范圍樣品的水分分別為7.9%，12.1%，12.6%，12.7%。可見(jiàn)，魚腥草飲片水分控制較好，含量分布較集中。詳見(jiàn)圖2 A。

圖2 樣品中水分、酸不溶性灰分、浸出物測(cè)定結(jié)果直方圖A.Water B.Acid-insoluble ash C.ExtractFig 2 Histogram of determination results of water，acid-insoluble ash and extract in samples

酸不溶性灰分：33 批次魚腥草飲片酸不溶性灰分檢查結(jié)果為0.9%～2.2%，均符合規(guī)定（≤2.5%）。30 批次（90.91%）樣品的酸不溶性灰分介于1.0%～2.0%范圍內(nèi)；3 批次（9.09%）接近標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限度值，可能與采割干燥地上部分時(shí)未清理干凈雜質(zhì)有關(guān)。詳見(jiàn)圖2 B。

2.4 浸出物

33 批次魚腥草飲片浸出物檢查結(jié)果為13.8%～23.4%，均符合規(guī)定（≥10.0%）。30 批次（90.91%）樣品的浸出物介于14.0%～20.0%范圍內(nèi)；3 批次（9.09%）超出范圍樣品的浸出物分別為13.8%，21.7%，23.4%。可見(jiàn)，魚腥草飲片浸出物項(xiàng)目檢查情況較好。詳見(jiàn)圖2 C。

2.5 探索性研究

2.5.1 重金屬及有害元素

重金屬及有害元素對(duì)人體新陳代謝有明顯傷害作用，易累積并引發(fā)各種疾病，故考察魚腥草中重金屬及有害元素的含量能為魚腥草的科學(xué)應(yīng)用提供依據(jù)。魚腥草執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中，檢查項(xiàng)未規(guī)定重金屬及有害元素檢查，參考2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》中對(duì)黃芪、甘草、金銀花等中藥材重金屬及有害元素限度的規(guī)定，采用ICP - MS 法測(cè)定鉛（Pb）、鎘（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、銅（Cu）的含量，其中Pb，Cd，As，Hg，Cu 分別不得超過(guò)5，1，2，0.2，20 mg/kg。結(jié)果顯示，33 批次魚腥草飲片中，Pb 含量為0.50～3.55 mg/ kg，平均1.80 mg/ kg；Cd 含量為0.19～0.72 mg/ kg，平均0.47 mg/ kg；As 含量為0.11～0.83 mg/ kg，平均0.31 mg/ kg；Hg 含量為0.03～0.21 mg/kg，平均0.06 mg/kg，其中1 批次含量為0.21 mg/ kg，略微超出限度值；Cu 含量為0.55～8.48 mg/kg，平均6.29 mg/kg。重金屬及有害元素含量是中藥材質(zhì)量的重要體現(xiàn)［12-14］，中藥材種植環(huán)境及生產(chǎn)過(guò)程中的采收、加工、儲(chǔ)存、包裝、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)均存在重金屬污染風(fēng)險(xiǎn)。只有對(duì)上述因素進(jìn)行嚴(yán)格把控，才能生產(chǎn)出符合規(guī)定的中藥材。

2.5.2 高效液相色譜法測(cè)定黃酮類和有機(jī)酸類成分含量

1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Zorbax SB - C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 時(shí)7%A，10～35 min 時(shí)7%A →27%A，35～36 min 時(shí)27%A →7%A，36～60 min 時(shí)7%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm（新綠原酸），254 nm（金絲桃苷、槲皮苷）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。供試品溶液色譜中，各成分分離度良好，在與混合對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 高效液相色譜圖1.Neochlorogenic acid 2.Hypericin 3.Quercetin A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.3 HPLC chromatograms

2）溶液制備

取新綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷對(duì)照品各適量，精密稱定，加85%甲醇溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.208 2，0.411 9，0.476 2 mg/ mL 的對(duì)照品貯備液。分別精密量取對(duì)照品貯備液1.00 mL，置20 mL容量瓶中，加85%甲醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為10.41，20.60，23.81μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

取樣品粉末（過(guò)3 號(hào)篩）1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入85%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放至室溫，再稱定質(zhì)量，加85%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

3）方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取上述對(duì)照品貯備液0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00 mL，置20 mL 容量瓶中，加85%甲醇定容，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)成分峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表2，表明3種成分質(zhì)量濃度在各自范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation test（n=6）

精密度試驗(yàn)：取上述混合對(duì)照品溶液適量，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷峰面積的RSD分別為1.01%，0.52%，0.66%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（編號(hào)為Y1）樣品6 份，分別按上述供試品溶液制備方法處理，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果新綠原酸、金絲桃苷和槲皮苷含量的RSD分別為0.38%，1.05%，1.18%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，12，16，24 h 時(shí)按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果新綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷峰面積的RSD分別為0.96%，0.83%，1.49%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品0.5 g，精密稱定，共6份，分別加入混合對(duì)照品溶液，依法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

4）樣品含量測(cè)定

取33批次樣品各適量，依法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果33 批次樣品中新綠原酸含量為0.009 5%～0.177 2%，金絲桃苷含量為0.013 7%～0.092 9%，槲皮苷含量為0.009 8%～0.283 0%，新綠原酸和金絲桃苷含量分布相對(duì)集中，槲皮苷含量分布較離散，不同批次樣品含量差異較大。詳見(jiàn)圖4。

圖4 樣品含量測(cè)定結(jié)果箱式圖Note：○refers to the mild outliers，and * refers to the extreme outliers.Fig.4 Box plot of content determination of the three components in samples

2.6 綜合分析

系統(tǒng)聚類分析：采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，以3 種成分的含量為變量，對(duì)33 批次魚腥草飲片進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，評(píng)價(jià)不同批次樣品的質(zhì)量。結(jié)果33批次樣品聚為兩大類，樣品Y10（產(chǎn)地河北）聚為Ⅰ類，3種成分的含量均最高，質(zhì)量最好；其余樣品聚為Ⅱ類。Ⅱ類樣品又可聚為2 個(gè)亞類，其中Y2，Y3，Y4，Y11，Y12，Y14，Y15，Y19，Y26，Y28，Y29，Y31 聚為1 個(gè)亞類，3 種成分的總量較低；其余樣品聚為1個(gè)亞類，3種成分的總量相對(duì)較高，質(zhì)量相對(duì)較好。詳見(jiàn)圖5。

圖5 33批次樣品的聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of 37 batches of samples

相關(guān)性分析：酸不溶性灰分與浸出物呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），水分與浸出物及新綠原酸、金絲桃苷的含量均呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明水分和酸不溶性灰分的含量影響魚腥草飲片有效成分的含量。浸出物與新綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷的含量均呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），且3種成分含量?jī)蓛砷g呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明新綠原酸、金絲桃苷和槲皮苷是浸出物的重要組成部分，質(zhì)量好的中藥材和飲片的有效成分含量整體較高，而不是單一成分含量較高。As與新綠原酸和槲皮苷的含量均呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），推測(cè)As 影響這2種成分的代謝，或與2 種成分形成了配位化合物。酸不溶性灰分與As 的含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明魚腥草飲片中重金屬及有害元素污染來(lái)源可能與其種植土壤有關(guān)。Pb 與As，Cd，Hg，Cu 的含量均呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），As 與Pb，Cu，Hg 的含量均呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明魚腥草飲片在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)幾種元素均有富集特點(diǎn)，只有從種植環(huán)境（土壤、空氣、水）等影響藥材質(zhì)量的根源抓起，才能從根本上保證種植藥材的安全性。相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 相關(guān)性分析結(jié)果（n=33）Tab.4 Results of the correlation analysis（n=33）

3 討論

山東省市售魚腥草飲片質(zhì)量整體較好，抽驗(yàn)樣品合格率為100.00%。探索性研究結(jié)果顯示，不合格樣品1 批次，不合格原因?yàn)镠g 含量超出規(guī)定限度。檢驗(yàn)結(jié)果反映了魚腥草飲片還存在一定質(zhì)量問(wèn)題，建議中藥材種植和采收環(huán)節(jié)注意防范重金屬及有害元素污染，從源頭把控好質(zhì)量，同時(shí)生產(chǎn)和銷售企業(yè)還應(yīng)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程、運(yùn)輸、貯存等環(huán)節(jié)做好管控。中藥材的質(zhì)量與品種、種植環(huán)境、采收季節(jié)等密切相關(guān)［15-16］。相關(guān)性分析結(jié)果表明，魚腥草飲片的有效成分含量具有整體相關(guān)性，不同批次間質(zhì)量差異較大，要選取適宜種植管理措施和采收季節(jié)以保證其質(zhì)量。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)較簡(jiǎn)單，檢查項(xiàng)未規(guī)定重金屬及有害元素的檢查，也無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，無(wú)法全面反映魚腥草的質(zhì)量。查閱文獻(xiàn)［2 - 9］，魚腥草中含有黃酮類、酚類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、生物堿等多種化合物，可作為衡量其質(zhì)量的指標(biāo)性成分。同時(shí)，本次探索性研究發(fā)現(xiàn)，部分批次樣品中重金屬及有害元素含量雖未超標(biāo)，但測(cè)定值較高，表明存在重金屬及有害元素污染的風(fēng)險(xiǎn)；不同批次樣品有效成分的含量差異大，建議標(biāo)準(zhǔn)中增加重金屬及有害元素的檢查和含量測(cè)定，以全面控制魚腥草的質(zhì)量，規(guī)范中藥材種植和飲片的加工與炮制，保證用藥安全。