賈微微，程 杰，吳小英，衛(wèi)星紅，謝子立

（安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽合肥 230051）

復(fù)方克霉唑乳膏是由尿素、克霉唑與基質(zhì)組成的消炎抗菌的外用復(fù)合制劑。尿素具有抗菌、增加皮膚角質(zhì)層蛋白質(zhì)的水合作用，可促進(jìn)其他藥物的經(jīng)皮吸收［1-2］。國(guó)外藥典均未收載該品種，其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于2020 年版《中國(guó)藥典（二部）》［3］966，尿素含量測(cè)定方法與其收載的尿素乳膏及尿素軟膏相同，均采用顯色后紫外- 可見(jiàn)分光光度法。尿素分子中伯氨基在酸性條件下與對(duì)二甲氨基苯甲醛發(fā)生縮合反應(yīng)，生成黃色的對(duì)二甲氨基苯縮脲衍生物。根據(jù)埃利希（Ehrlich）反應(yīng)，對(duì)二甲氨基苯甲醛與各種含氮有機(jī)化合物作用均會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)［4-5］，但方法專屬性差。2020 年版《中國(guó)藥典（二部）》［3］652、《歐洲藥典》［6］中尿素原料藥含量測(cè)定均采用凱氏定氮法，《美國(guó)藥典》中采用液相色譜法［7］，其他檢測(cè)方法還有比色法、折光率法、分光光度法、色譜法［8-11］等。復(fù)方克霉唑乳膏基質(zhì)多、輔料多、尿素極性強(qiáng)，導(dǎo)致色譜法分離難度加大，目前未見(jiàn)采用色譜方法測(cè)定復(fù)方克霉唑乳膏中尿素含量的相關(guān)報(bào)道。為此，本研究中采用親水相互作用色譜（HILIC）Amide 色譜柱，結(jié)合紫外檢測(cè)器，建立測(cè)定復(fù)方克霉唑乳膏中的尿素及其縮二脲含量的高效液相色譜（HPLC）法，同時(shí)采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）法指認(rèn)尿素的有關(guān)物質(zhì)縮二脲?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Q Exactive Focus型四極桿- 高分辨軌道阱液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；UV - 2700 型紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)，LC - 40 AT 型高效液相色譜儀，均購(gòu)自日本Shimadzu 公司；XS 105DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬(wàn)分之一）；PURA 22 型水浴鍋（德國(guó)Julabo 公司）；FD 240-UL 型電熱干燥箱（德國(guó)Binder公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜級(jí)/質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；甲酸（色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）；水為超純水；尿素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100288-201903，含量為99.8%）；縮二脲對(duì)照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)為C2011021，含量為99%）；復(fù)方克霉唑乳膏（A 廠家，共27 批次，其中批號(hào)為201003 用于方法學(xué)；B 廠家，共27 批次；C 廠家，共3 批次；D 廠家，共2 批次）；尿素原料藥（A 廠家，批號(hào)為 200806；B 廠家，批號(hào)為C01120 201007；C 廠家，批號(hào)為004120200902）；空白輔料由各廠家提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate HILIC Amide 柱（250 mm ×4.6 mm，5.0μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸溶液（95∶5，V/V）；流速：0.8 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：195 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：高頻火花誘導(dǎo)斷裂電離（HESI）源；檢測(cè)模式：正離子；鞘氣壓力：206.8 kPa；輔助氣體流量：10 mL/ min；噴霧電壓：3.80 kV；離子傳輸管溫度：300 ℃；輔助氣溫度：320 ℃；掃描模式：一級(jí)全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描（Full MS/dd-MS2）模式；分辨率：Full MS為70 000，dd - MS2為17 500；掃描范圍：55.000 00～825.000 00 質(zhì)荷比（m/z）；隔離窗口：3.0m/z；二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）模式碰撞能量：30/40/50 eV。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取尿素對(duì)照品與縮二脲對(duì)照品各適量，精密稱定，加乙醇溶解并稀釋成每1 mL含尿素0.5 mg、縮二脲2.5μg的溶液，即得。

供試品溶液：取樣品適量，精密稱定（約相當(dāng)于尿素50 mg），置100 mL容量瓶中，加乙醇50 mL，水浴加熱使尿素溶解，放冷，用乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，放至室溫，即得。

陰性對(duì)照品溶液：取A 廠家的空白輔料0.33 g，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，精密加入克霉唑原料5 mg，加乙醇50 mL，熱浴加熱15 min，放冷，加乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，放至室溫，即得。

2.3 縮二脲的質(zhì)譜確認(rèn)

取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下質(zhì)譜條件測(cè)定，確認(rèn)縮二脲的結(jié)構(gòu)?？s二脲的準(zhǔn)分子離子峰為m/z104.045 97［M + H］+，該加氫的準(zhǔn)分子離子信號(hào)與縮二脲（精確分子量103.038 18）的分子式C2H5N3O2相匹配（質(zhì)量偏差為0.6×10-6）。由圖1可知，二級(jí)質(zhì)譜圖中m/z87.019 94 為母離子氨基加氫合物經(jīng)脫氨氣（NH3）后得到，母離子羰基加氫合物經(jīng)斷裂酰胺鍵后得到m/z61.040 50碎片。

圖1 縮二脲的二級(jí)質(zhì)譜分析圖Fig.1 Secondary mass spectrometry of biuret

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，溶劑無(wú)響應(yīng)，陰性對(duì)照品溶液不干擾尿素及縮二脲的測(cè)定；尿素與縮二脲的色譜峰能實(shí)現(xiàn)完全分離，兩者間的分離度大于8。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Biuret 2.UreaA.Negative reference solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.2 HPLC chromatogram of the specificity test

破壞性試驗(yàn)：1）酸破壞。取乳膏內(nèi)容物，精密稱定（約相當(dāng)于尿素50 mg），置100 mL 容量瓶中，精密加入2.0 mol/L 鹽酸1.0 mL，60 ℃放置2 h，放冷，精密加入2.0 mol/L NaOH 溶液1.0 mL，加乙醇50 mL，水浴加熱使尿素溶解，放冷，加乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液放至室溫。2）堿破壞。取乳膏內(nèi)容物，精密稱定（約相當(dāng)于尿素50 mg），置100 mL 容量瓶中，精密加入2.0 mol/L NaOH 溶液1.0 mL，60 ℃放置2 h，放冷，精密加入2.0 mol/ L 鹽酸1.0 mL，加乙醇50 mL，水浴加熱使尿素溶解，放冷，加乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，放至室溫。3）氧化破壞。取乳膏內(nèi)容物，精密稱定（約相當(dāng)于尿素50 mg），置100 mL 容量瓶中，精密加入30%過(guò)氧化氫溶液1.0 mL，60 ℃放置2 h，放冷，加乙醇50 mL，水浴加熱使尿素溶解，放冷，加乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，放至室溫。4）光照破壞。直接取未破壞的乳膏供試品溶液，于3 500 lx照射3 d，即得。5）高溫破壞。取乳膏內(nèi)容物2 g，置頂空瓶密封后，105 ℃放置3 h，放冷，精密稱定（約相當(dāng)于尿素50 mg），置100 mL容量瓶中，加乙醇50 mL，水浴加熱使尿素溶解，放冷，加乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，放至室溫。分別取上述破壞性試驗(yàn)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果尿素及縮二脲在酸、堿、氧化、光破壞條件下均較穩(wěn)定，在高溫破壞條件下縮二脲含量明顯增加。色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Biuret 2.Ureaa.Destroyed by high temperature b.Destroyed by acid c.Destroyed by alkali d.Destroyed by light e.Destroyed by oxidationFig.3 HPLC chromatogram of the destructive test

線性關(guān)系考察：取尿素對(duì)照品254.9 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，作為尿素貯備液，并定量稀釋成尿素質(zhì)量濃度分別0.050 9，10.101 8，0.254 4，0.508 8，1.017 6 mg/mL的系列線性溶液；取縮二脲對(duì)照品11.57 mg，精密稱定，置500 mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，作為縮二脲貯備液，并定量稀釋成縮二脲質(zhì)量濃度分別為0.114 5，0.458 2，1.145 4，2.290 9，4.581 7 μg/ mL 的系列線性溶液。精密量取線性溶液各10μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)、待測(cè)組分峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=5）Tab.1 Results of the linear relation test（n=5）

檢測(cè)限與定量限確定：取2.1 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣測(cè)定，以色譜圖中信噪比（S/ N）分別為3∶1和10∶1的質(zhì)量濃度確定檢測(cè)限和定量限。結(jié)果尿素的檢測(cè)限和定量限分別為0.25，0.65 μg/ mL；縮二脲的檢測(cè)限和定量限分別為0.05，0.12μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次。結(jié)果尿素、縮二脲色譜峰峰面積的RSD分別為0.10%和0.46%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為201003），按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果尿素和縮二脲的平均含量分別為100.60%和0.59%，RSD分別為0.32%和0.68%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液，分別于0，2，6，12，18，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果尿素、縮二脲色譜峰峰面積的RSD分別為0.19% 和0.25%（n=6），表明供試品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為201003）9份，精密稱定（每份約相當(dāng)于尿素25 mg），尿素和縮二脲含量分別為100.60%和0.59%，分別置100 mL 容量瓶中，精密加入線性關(guān)系考察項(xiàng)下尿素及縮二脲貯備液各4，5，6 mL，平行3份，加乙醇50 mL，水浴加熱使溶解，放冷，加乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，放至室溫，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.5 樣品含量測(cè)定

尿素含量：按2.1項(xiàng)下擬訂方法測(cè)定4個(gè)廠家59批次復(fù)方克霉唑乳膏中尿素的含量，與現(xiàn)行方法（2020 年版《中國(guó)藥典（二部）》）測(cè)得含量進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)圖4。采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析2 種方法的檢驗(yàn)結(jié)果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.265，P=0.000 001）。

圖4 不同方法測(cè)得尿素含量比較Fig.4 Comparison of the urea content determined by different methods

縮二脲含量：按2.1 項(xiàng)下擬訂方法測(cè)定4 個(gè)廠家59 批次復(fù)方克霉唑乳膏及3 個(gè)廠家3 批尿素原料藥中縮二脲的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 復(fù)方克霉唑乳膏與尿素原料藥中縮二脲含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.3 Results of content determination of biuret in Compound Clotrimazole Cream and raw material of urea（%）

3 討論

3.1 色譜柱、檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

尿素和縮二脲在反相柱上保留弱，雖有文獻(xiàn)報(bào)道了使用氨基柱測(cè)定尿素［11］，但氨基柱柱效下降嚴(yán)重、使用壽命短、耐用性較差。HILIC 柱因其包含了親水、疏水、分子間作用（如靜電、偶極- 偶極、氫鍵）等在內(nèi)的復(fù)合型原理，在大極性分子的分離、識(shí)別、改善峰形等方面優(yōu)勢(shì)顯著［12-13］。試驗(yàn)考察了HILIC 柱與鍵合酰胺基作為固定相的HILIC Amide 柱對(duì)尿素與縮二脲出峰和分離效果的影響。發(fā)現(xiàn)前者雖能滿足專屬性要求，但基線噪音大，影響了方法的靈敏度，而HILIC Amide 柱滿足專屬性和靈敏度要求，最終選擇HILIC Amide 柱。以流動(dòng)相作為溶劑，于190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定了尿素與縮二脲對(duì)照品的紫外光譜圖，尿素和縮二脲均末端吸收最大，本研究中參考《美國(guó)藥典》尿素原料藥標(biāo)準(zhǔn)，選擇195 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 擬訂方法與現(xiàn)行方法測(cè)定結(jié)果分析

擬訂方法較現(xiàn)行方法測(cè)定結(jié)果偏低的原因是按現(xiàn)行方法檢驗(yàn)過(guò)程中，克霉唑原料藥、克霉唑和尿素的有關(guān)物質(zhì)等各種含氮有機(jī)化合物也會(huì)與對(duì)二甲氨基苯甲醛發(fā)生Ehrlich 反應(yīng)。而2 種方法含量相差4%以上的產(chǎn)品均來(lái)自B廠家，可能原因?yàn)閮H該廠家使用了含氮的輔料依地酸二鈉，依地酸二鈉中的叔胺基與對(duì)二甲氨基苯甲醛發(fā)生了顯色反應(yīng)?？梢?jiàn)，現(xiàn)行方法不能準(zhǔn)確反映藥品的實(shí)際質(zhì)量，修訂后的尿素含量測(cè)定方法更科學(xué)、有效和可控。

3.3 縮二脲的形成機(jī)制

尿素對(duì)熱不穩(wěn)定，100 ℃以上可生成副產(chǎn)物縮二脲［14］，這也與高溫強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果相吻合，同時(shí)縮二脲的生成與溫度和停留時(shí)間成正比［15］。而復(fù)方克霉唑乳膏生產(chǎn)中均使用了高溫（85～90 ℃）、長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（2～3 h）的油水乳化工藝，故生產(chǎn)工藝中若溫度控制不嚴(yán)格也有可能產(chǎn)生工藝雜質(zhì)縮二脲。

3.4 縮二脲結(jié)果分析

B 廠家提供的1 批尿素原料藥中縮二脲含量為0.01%，該廠家乳膏中的縮二脲含量在0.01%～0.58%，離散程度大，可能原因?yàn)樵搹S家尿素原料藥中的副產(chǎn)物縮二脲含量差異大或乳膏生產(chǎn)過(guò)程中溫度控制不嚴(yán)格生成了工藝雜質(zhì)縮二脲。A廠家乳膏中縮二脲含量均較高，與其提供的原料藥中縮二脲含量較高相吻合。C 廠家提供的1 批尿素原料藥中縮二脲含量為0.10%，而其乳膏中縮二脲含量均低于0.10%?？梢?jiàn)，縮二脲含量低的尿素原料藥和穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝可使乳膏中的縮二脲控制在較低水平。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于復(fù)方克霉唑乳膏中尿素及其縮二脲的質(zhì)量控制，同時(shí)也為尿素原料藥和以尿素為原料藥的制劑的質(zhì)量控制提供了參考。