江 燕，張先華，徐興利，王祖煥，葉世春

（重慶健能醫(yī)藥開發(fā)有限公司，重慶 401121）

糜爛性胃炎和消化性潰瘍與膽汁反流及胃液中膽汁酸濃度有關(guān)［1］，膽汁中的膽酸可溶解胃液中的黏液（黏液有保護(hù)胃黏膜作用）和破壞黏膜表層細(xì)胞，從而破壞胃黏膜的屏障作用。膽汁酸包括游離型和結(jié)合型兩類，結(jié)合型膽汁酸是膽汁反流中對胃黏膜造成損害的主要物質(zhì)。鋁碳酸鎂是一種具有層狀網(wǎng)絡(luò)晶格的藥物，能阻斷損傷因子，有效保護(hù)胃黏膜［2-3］。有研究報道，鋁碳酸鎂等抗酸劑對膽汁酸具有較強(qiáng)的吸附能力，能有效清除反流入胃的膽汁酸［4-5］。分析膽汁酸常用的方法有薄層色譜法［6-7］、氣相色譜法［8］和高效液相色譜（HPLC）法［9-10］。本研究中建立了膽汁酸的體外吸附方法及含量測定的HPLC 法，對鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附各膽汁酸的能力進(jìn)行了考察，為臨床合理用藥提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Ⅱ型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；MS205DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；PHS - 3C pH 計(jì)（上海雷磁儀器有限公司）；TDL - 80 - 2B 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器公司）；HH-ZK4型水浴鍋（鞏義市予華儀器公司）。

1.2 試藥

牛磺膽酸鈉對照品（Sinco 公司，批號為19 - 03 -0110，含量為95.25%）；甘氨膽酸鈉對照品（批號為1-CYJ- 39 - 1，含量為98%），?；蛆Z脫氧膽酸鈉對照品（批號為9-MMS- 9-1，含量為97%），牛磺脫氧膽酸鈉對照品（批號為1-NYL-90-1，含量為95%），甘氨鵝脫氧膽酸鈉對照品（批號為5 - YFD - 138 - 1，含量為95%），均購于TRC 公司；鋁碳酸鎂咀嚼片（四川健能制藥有限公司，批號分別為20200801，20201001，20201002，20201003，規(guī)格為每片0.5 g）；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 體外吸附膽汁酸

參考文獻(xiàn)［4-5］并結(jié)合前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇鋁碳酸鎂咀嚼片細(xì)粉為吸附形態(tài)，以0.1 mol/L 的鹽酸溶液（pH 1.0）為介質(zhì)。取濃度為0.5 mmol/L（質(zhì)量濃度為0.25 mg/ mL）膽汁酸鹽溶液5 mL，加入鋁碳酸鎂咀嚼片細(xì)粉中，于（37±5）℃水浴中孵育1 h，離心分離。

按公式計(jì)算鋁碳酸鎂咀嚼片對5 種膽汁酸的吸附率，吸附率(%) =(1-A樣品/A對照)× 100%。其中，A樣品為供試品溶液峰面積，A對照為對照品溶液峰面積。

2.2 膽汁酸含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（40∶40∶50，V/V/V，用磷酸調(diào)pH 至3.0）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：200 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。結(jié)果系統(tǒng)適用性溶液中，各膽汁酸鹽對照品色譜峰的理論板數(shù)不大于2 000，拖尾因子不大于2.0，分離度不低于1.5。詳見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Sodium taurocholate 2.Sodium glycocholate hydrate 3.Sodium taurochenodeoxycholate 4.Sodium taurodeoxycholate hydrate 5.Sodium glycochenodeoxycholateFig.1 HPLC chromatogram of the system suitability test

2.2.2 溶液制備

系統(tǒng)適用性溶液：分別取甘氨膽酸鈉對照品、?；悄懰徕c對照品、甘氨鵝脫氧膽酸鈉對照品、牛磺鵝脫氧膽酸鈉對照品、?；敲撗跄懰徕c對照品各25 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加0.1 mol/L 鹽酸溶解并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

對照品貯備液：取5 種膽汁酸對照品各25 mg，精密稱定，分別置100 mL 容量瓶中，加0.1 mol/L 鹽酸溶液制成濃度為0.5 mmol/L（質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL）的對照品貯備液。

對照品溶液：取上述對照品貯備液各5 mL，分別置離心管中，于（37 ± 0.5）℃水浴中孵育1 h，每隔10 min振搖混勻，離心（轉(zhuǎn)速為2 000 r/ min）15 min，取上清液，即得。

供試品溶液：取鋁碳酸鎂咀嚼片細(xì)粉適量（相當(dāng)于鋁碳酸鎂25 mg），精密稱定，分別置離心管中，加入上述對照品貯備液各5 mL，于（37±0. 5）℃水浴中孵育1 h，每隔10 min 振搖混勻，離心（轉(zhuǎn)速為2 000 r/min）15 min，取上清液，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

定量限確定：取2.2.2項(xiàng)下單個對照品溶液逐級稀釋，以信噪比（S/N）為10∶1 時的質(zhì)量濃度為定量限濃度，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、?；蛆Z脫氧膽酸鈉、?；敲撗跄懰徕c、甘氨鵝脫氧膽酸鈉的定量限分別為1.257，1.252，2.452，2.396，2.395μg/mL。采用定量限濃度的對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，結(jié)果5 種膽汁酸保留時間的RSD分別為0.16%，0.10%，0.14%，0.11%，0.21%（n= 6）；峰面積的RSD分別為2.52%，5.14%，4.55%，6.18%，8.04%（n=6）。結(jié)果均低于10.0%，符合要求。

線性關(guān)系考察：精密量取2.2.2項(xiàng)下對照品貯備液適量，分別稀釋成濃度為定量限濃度，以及0.05，0.10，0.125，0.15，0.20 mg/ mL 的系列溶液，取系列溶液及對照品貯備液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以溶液質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test

重復(fù)性試驗(yàn)：按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液，平行6 份，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件由同一試驗(yàn)人員進(jìn)樣測定。結(jié)果鋁碳酸鎂咀嚼片對5種膽汁酸的吸附率為35.59%～97.25%，RSD為0.28%～3.83%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

中間精密度試驗(yàn)：按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液，由另一試驗(yàn)人員在不同日期平行配備6份，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定；同時，取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下6次試驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)果2位試驗(yàn)人員測定的12份供試品溶液中，鋁碳酸鎂咀嚼片對5 種膽汁酸的吸附率為35.59%～97.88%，RSD為0.41%～2.26%（n= 12），表明中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下對照品溶液和供試品溶液各適量，分別于室溫下放置0，6，12，18，24，30，36，48，60，72 h 時按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果各膽汁酸峰面積的RSD為0.18%～1.80%（n= 10），保留時間的RSD為0.20%～0.80%（n= 10），表明對照品溶液和供試品溶液在室溫放置72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

回收試驗(yàn)：取各膽汁酸對照品貯備液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.20，0.125，0.05 mg/ mL 溶液，作為高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備質(zhì)控樣品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，每個濃度平行測定3 次，并計(jì)算方法的絕對回收率。結(jié)果見表2，表明吸附過程對膽汁酸濃度測定無干擾，HPLC 法的準(zhǔn)確性符合測定要求。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.3 樣品中膽汁酸吸附率測定

取樣品（批號分別為20200801，20201001，20201002，20201003），依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算鋁碳酸鎂咀嚼片對膽汁酸的吸附率。結(jié)果見表3。

表3 4批樣品中膽汁酸吸附率測定結(jié)果（%）Tab.3 Results of adsorption rate of bile acid in the four batches of samples（%）

3 討論

以膽汁酸為主的十二指腸內(nèi)容物從胃幽門反流入胃，損傷胃黏膜并引起相關(guān)疾病，膽汁酸反流與腸上皮化生及不典型增生的發(fā)生密切相關(guān)［11］。鋁碳酸鎂能吸附和結(jié)合膽汁酸，從而減弱黏膜損傷因子的攻擊，改善局部黏膜的血流量，通過調(diào)節(jié)pH 值改變黏膜表面的酸堿環(huán)境等參與黏膜的保護(hù)作用。鋁碳酸鎂在臨床上用于保護(hù)膽汁酸引起的胃黏膜損傷和治療膽汁反流性胃炎［12-13］。

目前，尚無國家標(biāo)準(zhǔn)收載鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸的方法。本研究中，鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸的方法是根據(jù)鋁碳酸鎂獨(dú)特的層狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及其組成（氫氧化鋁、氫氧化鎂及碳酸鹽）進(jìn)行設(shè)計(jì)。通過模擬胃部pH值及患者的胃酸量，以及鋁碳酸鎂咀嚼片的用法用量對膽汁酸的吸附能力，確定介質(zhì)為0.1 mol/L的鹽酸溶液，鋁碳酸鎂咀嚼片的吸附形態(tài)為細(xì)粉，膽汁酸鹽溶液的濃度為0.5 mmol/L（質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL），吸附時加入膽汁酸鹽溶液5 mL，于（37 ± 0.5）℃水浴孵育1 h，吸附完成后離心分離（轉(zhuǎn)速為2 000 r / min）15 min。通過改變孵育時間、離心轉(zhuǎn)速和離心時間、孵育過程中間隔振搖時間等試驗(yàn)吸附方法進(jìn)行了耐用性考察，結(jié)果表明，在孵育時間變化± 10 min、離心轉(zhuǎn)速變化±500 r/min、離心時間變化±2 min和振搖間隔時間變化± 10 min 時，5 種結(jié)合型膽汁酸吸附率的RSD為0.96%～3.95%，耐用性良好。

國家標(biāo)準(zhǔn)中尚未收載膽汁酸的檢測方法，參考文獻(xiàn)［14 - 16］，本研究中采用HPLC 法對膽汁酸進(jìn)行分析，但各膽汁酸的峰形及分離度均較差。優(yōu)化了流動相的組成，選擇甲醇、乙腈和緩沖鹽流動相體系，并對流動相的pH 值和緩沖鹽的濃度，以及對不同的色譜柱進(jìn)行篩選，各膽汁酸分離更好；通過改變柱溫、流速、流動相pH 值、緩沖鹽濃度等試驗(yàn)對色譜條件進(jìn)行了耐用性考察，結(jié)果表明，柱溫變化±5 ℃、流速變化±0.1 mL/min、流動相中有機(jī)相比例變化±3%、流動相pH值變化±0.2、流動相中磷酸鹽濃度變化±0.005 mol/L 時，5 種結(jié)合型膽汁酸吸附率的RSD為0.46%～3.11%，色譜條件耐用性好。

綜上所述，所建立的鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸方法及膽汁酸含量測定方法準(zhǔn)確、有效、靈敏、快速，可用于鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸的檢測。