楊 晨，武正華，石文清，吳江平，范國榮△

（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230012； 2. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海 200940；3. 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院，上海 200434）

預(yù)知子Akebiae Fructus為木通科植物木通Akebia quinata（Thunb.）Dence、三葉木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz. 或白木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koide.var.austrlis（Diels）Rehd. 的干燥近成熟果實(shí)，又稱“八月瓜”“八月炸”，廣泛分布于江蘇、浙江、安徽等地。預(yù)知子氣微香，味苦，性寒，歸膽、肝、胃、膀胱經(jīng)，具有疏肝理氣、活血止痛、散結(jié)、利尿等功效［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其主要含有三萜皂苷、綠原酸、黃酮等成分［2-3］，其中三萜皂苷作為預(yù)知子的主要成分，具有抗炎［4-5］、抗菌［6-7］、抗抑郁［8-9］、抗癌［10-12］等活性。另外，預(yù)知子中富含多種人體生長所需的營養(yǎng)成分，成熟后味甜。四川、云南等地將其作為水果食用，因其含有較多種子，部分地區(qū)也用其種子榨油，具有很好的開發(fā)前景［13］。隨著三葉木通人工種植技術(shù)的不斷成熟，以三葉木通為原料的產(chǎn)品開始進(jìn)入大眾視野，但其加工的產(chǎn)品還不能滿足市場需求［14］。大孔樹脂作為一類由有機(jī)高分子聚合物形成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的圓形吸附材料，具有成本低、無污染、提取效率高、可再生等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品等行業(yè)［15］。越來越多證據(jù)表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)與人類多種疾病關(guān)系密切，故通過補(bǔ)充天然的抗氧化劑來平衡生物系統(tǒng)中的活性氧（ROS）水平具有重要意義［16］。而目前對預(yù)知子總皂苷抗氧化活性的研究較少，故本研究中使用大孔樹脂對預(yù)知子提取物中三萜皂苷進(jìn)行分離純化，并研究其總皂苷的抗氧化活性，以期為預(yù)知子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及產(chǎn)品的深度開發(fā)提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

50 Conc型紫外分光光度計(jì)（美國Varian公司）；TS-1型搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；AUW220D型電子天平（日本Shimadzu 公司，精度為十萬分之一）；RS-FS-1411型粉碎機(jī)（合肥榮事達(dá)電子電器集團(tuán)有限公司）；R5005K2D 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）。

1.2 試藥

預(yù)知子（上海萬仕誠國藥制品有限公司，批號為20210728-2）；齊墩果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110709 - 202109，含量以95.8 %計(jì)）；D101，AB-8，D1300，HPD300，HPD400，HPD500，ADS-7，ADS - 8，S - 8，D4020 型大孔樹脂（鄭州和成新材料科技有限公司，批號為HC220619）；2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH，北京華邁科生物技術(shù)有限公司，批號為D310202，含量不低于97%）；2，2 - 聯(lián)氮- 二（3 - 乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，上海源葉生物科技有限公司，批號為A02GS143434，含量不低于98%）；總抗氧化能力檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號為BC1310）；過硫酸鉀、香草醛、高氯酸、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 預(yù)知子提取物溶液制備

取預(yù)知子，粉碎，過2號篩，按比例1∶20（m/V）加入85%乙醇，浸泡60 min，85 ℃回流提取3 次，每次1.5 h，濾過，取上清液，減壓濃縮去乙醇，即得預(yù)知子提取物。加入適量水，配制質(zhì)量濃度為100～800 mg/mL 的預(yù)知子提取物溶液，備用。

2.2 總皂苷含量測定［17］

取齊墩果酸對照品5.10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得對照品溶液；以甲醇為空白對照。精密量取上述對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，揮盡甲醇，精密加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL和高氯酸0.4 mL，充分搖勻，60 ℃水浴加熱15 min，取出，冷卻至室溫，精密加入冰乙酸5 mL，搖勻，于540 nm 波長處測定吸光度。以對照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.008X-0.010 6（R2=0.999 5，n= 6）。結(jié)果表明，總皂苷（以齊墩果酸計(jì)）質(zhì)量濃度在9.11～54.64μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3 大孔樹脂預(yù)處理

分別稱取一定量的D101，AB-8，D1300，HPD300，HPD400，HPD500，ADS - 7，ADS - 8，S - 8，D4020 型大孔樹脂，在無水乙醇中浸泡24 h 后用純水洗至無醇味，依次用5 倍體積4%鹽酸溶液、純水、4%氫氧化鈉溶液淋洗，用純水洗至中性，晾干，得各型號干樹脂備用。

2.4 大孔樹脂型號篩選

靜態(tài)吸附試驗(yàn)：稱取D101，AB-8，D1300，HPD300，HPD400，HPD500，ADS - 7，ADS - 8，S - 8，D4020 型干樹脂各1.0 g，加入20 mL 質(zhì)量濃度為400 mg/mL 的預(yù)知子提取物溶液，置100 mL 具塞錐形瓶中，密封，置搖床上（轉(zhuǎn)速為150 r/min）振蕩24 h，充分吸附，濾過，取一定體積吸附后的液體，按2.2項(xiàng)下方法測定濾液中總皂苷的含量，并計(jì)算不同型號大孔樹脂對預(yù)知子總皂苷的吸附率，吸附率（%）=［（C0-C1）V1/W］× 100%。式中，C0為初始總皂苷質(zhì)量濃度，C1為吸附后上清液中總皂苷質(zhì)量濃度，V1為上樣體積，W為樹脂質(zhì)量（干重）。詳見表1。

表1 不同型號大孔樹脂對預(yù)知子總皂苷的靜態(tài)吸附和靜態(tài)解析試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Static adsorption and analytical comparison of total saponins of Akebiae Fructus by different macroporous resins

靜態(tài)解析試驗(yàn)：將上述靜態(tài)吸附后的10 種樹脂水洗后晾干，分別置100 mL 具塞錐形瓶中，分別加入80%乙醇溶液20 mL，密封，置搖床（轉(zhuǎn)速為150 r/min）振蕩12 h，使其充分解析，取一定量吸附后液體，按2.2 項(xiàng)下方法測定總皂苷吸光度，并計(jì)算不同型號大孔樹脂對預(yù)知子總皂苷的解吸附率與解吸附效果，解吸附率（%）=C2CV/W×100%，解吸附效果（%）=解吸附率/吸附率×100%。式中，C2為解析濃度，CV為解析體積。詳見表1?？梢姡琒-8 型大孔樹脂對預(yù)知子總皂苷的吸附率、解吸附率與解吸附效果均較其他樹脂高，故選擇S-8型樹脂用于后續(xù)預(yù)知子總皂苷的分離與純化。

2.5 上樣條件考察

上樣液pH：精密量取8 份5 mL 預(yù)處理過的S-8 型大孔樹脂，加入pH 分別為2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5 的預(yù)知子提取物溶液15 mL，置搖床（轉(zhuǎn)速為150 r/min）振蕩12 h，測定吸附前后溶液中總皂苷的含量。由圖1 可知，pH 為2.5 時吸附率最高（52.72%），故最佳上樣液pH 為2.5。這可能是因?yàn)樵碥疹惢衔镏泻恤然?，在酸性條件下較穩(wěn)定。由于三萜皂苷中有連接糖鏈，pH 過低會導(dǎo)致其水解成苷元，故上樣液pH 最終選擇2.5。

圖1 上樣液pH對總皂苷吸附效果的影響Fig.1 Effect of pH of the sample solution on the adsorption effect of total saponins

吸附等溫線：精密量取8 份預(yù)處理過的S - 8 型大孔樹脂5 mL，置100 mL具塞錐形瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為100～800 mg/mL 的預(yù)知子提取物溶液，于0，25，50 ℃水浴搖床恒溫振蕩12 h，測定吸附前后溶液中總皂苷的含量，并計(jì)算平衡吸附量（Qe），Qe=（C0-Ce）V/W。式中，C0為初始總皂苷質(zhì)量濃度，Ce為吸附平衡后預(yù)知子總皂苷濃度，V為溶液體積。由圖2 可知，樹脂平衡吸附量隨提取物濃度的增大而增加，隨溫度的升高而降低，表明低溫有助于樹脂的吸附，故S-8型樹脂對預(yù)知子的吸附屬放熱過程。

圖2 S-8型大孔樹脂對預(yù)知子提取物的吸附等溫線Fig.2 Adsorption isotherm of S-8 macroporous resin on the Akebiae Fructus extract

吸附等壓線：精密量取預(yù)處理過的S-8 型大孔樹脂5 mL，分別置100 mL具塞錐形瓶中，加入質(zhì)量濃度為200 mg/mL預(yù)知子提取物溶液15 mL，25 ℃下水浴搖床（轉(zhuǎn)速為150 r/min）恒溫振蕩，每10 min 取出1 個錐形瓶，至濃度基本不變時停止，測定總皂苷含量，并計(jì)算瞬時吸附量（Qt），Qt=（C0-Ct）V/W。式中，Ct為t時刻總皂苷濃度。由圖3可知，0～40 min內(nèi)吸附量隨時間的增加而快速上升，40～120 min內(nèi)吸附率逐漸減緩，120 min后逐漸趨于平衡，為避免浪費(fèi)提取液，故選擇靜態(tài)吸附2.5 h后進(jìn)行洗脫。

上樣量：取預(yù)處理后的S-8 型樹脂40 mL，濕法緩慢裝入吸附柱中，以一定質(zhì)量濃度的預(yù)知子提取物溶液上樣，保持流速為1.0 mL/min，每20 mL 收集1份流出液，測定總皂苷質(zhì)量濃度，繪制泄露曲線。當(dāng)流出液中該成分質(zhì)量濃度為上樣液的1/10 時，認(rèn)為達(dá)到泄露點(diǎn)。由圖4可知，第5份流出液中總皂苷質(zhì)量濃度急劇上升，并超過上樣液的1/10，故確定最大上樣量為80 mL，即上樣量與樹脂體積比為2∶1（V/V）。

圖4 S-8型大孔樹脂對預(yù)知子提取物的泄露曲線Fig.4 Leakage curve of S-8 macroporous resin on the Akebiae Fructus extract

2.6 洗脫條件考察

洗脫液體積分?jǐn)?shù)：取預(yù)處理好的S-8 型大孔樹脂20 mL，濕法裝柱，取40 mL pH 為2.5 的預(yù)知子提取物溶液（質(zhì)量濃度為200 mg/mL），以1 mL/min 的流速上樣，動態(tài)吸附2.5 h 后用6 BV 體積蒸餾水除雜，依次用3 BV 10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇溶液梯度洗脫，收集洗脫液，于540 nm 波長處測定吸光度，計(jì)算總皂苷洗脫量。由圖5 可知，3 BV 50%乙醇可洗脫大部分皂苷。綜合考慮對預(yù)知子總皂苷的最大富集效果及節(jié)約溶劑，分別選用6，9，12 BV 體積的40%，50%，60%乙醇溶液進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，選擇最佳洗脫工藝。

圖5 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)洗脫劑下總皂苷的洗脫量Fig.5 Elution amount of total saponins under different volume fractions of ethanol as eluents

Box - Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)考察洗脫工藝：影響洗脫工藝的因素主要包括洗脫劑體積（因素A）、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)（因素B）、洗脫流速（因素C）。由于洗脫流速越大，洗脫劑與樹脂作用時間越短，則需要更多的洗脫劑將物質(zhì)洗脫下來，綜合洗脫效果與生產(chǎn)效率，選擇0.5，1.0，1.5 mL/min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。采用三因素三水平響應(yīng)面法，取40 mL pH為2.5、生藥質(zhì)量濃度為200 mg/mL的預(yù)知子提取物溶液，以1.0 mL/ min 的流速上樣，按2.2 項(xiàng)下方法測定總皂苷吸光度。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。采用Design Expert 10.0.1 軟件分析，以洗脫劑體積、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速為響應(yīng)變量，總皂苷回收率為響應(yīng)值，進(jìn)行回歸擬合分析，得模型Y= 10.276 35A+6.845 28B+37.237 37C-0.103 21AB-0.820 19AC-0.059156BC-0.18725A2-0.049331B2-12.29081C2-191.552 93。由表4 可知，其中A，B，B2的影響極顯著（P＜0.01），AB，C2的影響顯著（P＜0.05）；由F值可知，各因素對總皂苷回收率的影響程度由大至小為洗脫劑體積分?jǐn)?shù)＞洗脫劑體積＞洗脫流速。繪制各影響因素相互作用對預(yù)知子總皂苷回收率影響的三維響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖6。可知，響應(yīng)面優(yōu)化條件為，洗脫劑體積9.00 BV，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)59.80%、洗脫流速1.12 mL/min。考慮到試驗(yàn)的可操作性，決定采用9 BV 60%乙醇溶液為洗脫劑，洗脫流速為1.0 mL/min，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Tab.2 Factors and levels of the Box-Behnken test

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of the Box-Behnken test

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of the analysis of variance

圖6 各因素相互作用對預(yù)知子總皂苷回收率影響的三維響應(yīng)面圖A.Volume of eluent-Volume fraction of eluent B.Volume of eluent-Flow rate of elutionC.Volume fraction of eluent-Flow rate of elutionFig.6 Three dimensional response surface plot of the influence of the interaction of various factors on the recovery rate of total saponins from Akebiae Fructus

驗(yàn)證試驗(yàn)：精密量取S-8 型大孔樹脂20 mL，加入pH 為2.5 的預(yù)知子提取物溶液40 mL，以1.0 mL/ min的流速上樣，9 BV 60%乙醇洗脫（流速為1.0 mL/min），平行3 份。結(jié)果預(yù)知子總皂苷轉(zhuǎn)移率分別為76.09%，76.64%，76.59%，平均為76.44%（RSD為0.40%），與預(yù)測值77.21%相差-0.77%，表明該工藝穩(wěn)定、可靠。

2.7 預(yù)知子總皂苷體外抗氧化活性測定

DPPH 自由基清除能力測定：參考文獻(xiàn)［18］，用95%乙醇溶液配制0.1 mmol/ L 的DPPH 溶液（臨用現(xiàn)配）。吸取0.4 mL乙醇與0.2 mL DPPH 溶液，混勻，作為空白對照組（A0）；吸取0.4 mL 不同濃度總皂苷樣品溶液與0.2 mL 無水乙醇，混勻，作為樣品對照組（A1）；吸取0.4 mL不同濃度總皂苷樣品溶液與0.2 mL DPPH 溶液，混勻，作為試驗(yàn)組（A2）。37 ℃避光孵育30 min，于517 nm 波長處測定吸光度。DPPH 自由基清除率（%）=［1-（A2-A1）/A0］×100%。結(jié)果表明，總皂苷樣品溶液的質(zhì)量濃度在0.03～1.67 mg/mL 范圍內(nèi)與DPPH 自由基清除率量效關(guān)系良好。得擬合方程Y= 0.003 5X-0.009 1（R2=0.994 6），半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.15 mg/mL。

ABTS 自由基清除能力測定：參考文獻(xiàn)［19］，吸取7mmol/LABTS溶液與4.9mmol/L 過硫酸鉀溶液，按1∶1（V/V）混合，室溫避光反應(yīng)12～16 h，使用前用去離子水稀釋，于734 nm波長處測定吸光度為0.70±0.02。吸取0.5 mL ABTS 溶液，加0.1 mL 去離子水，混勻，作為空白對照組（A0）；吸取0.5 mL ABTS 溶液與過硫酸鉀溶液，混勻，加0.1 mL 不同濃度總皂苷溶液，作為試驗(yàn)組（A1）。室溫避光反應(yīng)20 min，于734 nm 波長處測定吸光度。ABTS 自由基清除率（%）=［（A0-A1）/A0］×100%。得擬合方程Y=0.318 5X+0.027 3（R2=0.998 8），IC50為1.54 mg/mL，表明總皂苷樣品溶液質(zhì)量濃度在0.33～2.67 mg/ mL 范圍內(nèi)與ABTS 自由基清除率量效關(guān)系良好。

總抗氧化能力檢測：按總抗氧化能力檢測試劑盒說明書操作，將硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋為不同梯度濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=4.421 8X+0.001 1（R2=0.999 3），表明硫酸亞鐵濃度在0.001 56～0.05μmol/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按7∶1∶1的比例將試劑1、試劑2、試劑3混合成混合液，吸取混合液0.9 mL，加0.12 mL 蒸餾水作為A空白，加0.3 mL 樣品與0.12 mL蒸餾水作為A測定。按公式ΔA測定=A測定-A空白計(jì)算ΔA測定，由回歸方程可知預(yù)知子提取物濃度，計(jì)算總抗氧化能力?？偪寡趸芰Γé蘭ol/mL）=XV反總/V樣。式中，X為樣本濃度，V反總為反應(yīng)總體積，V樣為反應(yīng)中樣本體積。按藥材量計(jì)算質(zhì)量濃度為80 mg/mL 的預(yù)知子總皂苷的總抗氧化能力為4.86μmol/mL。

3 討論

三萜皂苷為預(yù)知子中的主要成分，藥理活性廣泛。本研究中首次利用大孔樹脂分離純化預(yù)知子中的總皂苷，并通過考察10 種不同極性的大孔樹脂對預(yù)知子總皂苷的吸附率及解吸附率，篩選出S-8 型大孔樹脂用于分離純化預(yù)知子總皂苷；通過單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)確定了上樣及洗脫工藝，確定了以上樣液質(zhì)量濃度為200 mg/ mL，上樣液體積與樹脂體積比為2∶1（V/V），pH 為2.5，以9 BV 60%乙醇溶液洗脫，流速為1.0 mL/ min 為條件進(jìn)行分離純化，且預(yù)測值和驗(yàn)證結(jié)果相符，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

預(yù)知子作為一種藥食同源的中藥，由于目前對其生物活性及藥理作用機(jī)制尚不明確，導(dǎo)致其應(yīng)用并不廣泛。而DPPH 和ABTS 自由基清除及總抗氧化能力由于方法簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、可靠，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物抗氧化活性的評價中［20］。本研究結(jié)果表明，預(yù)知子總皂苷具有一定抗氧化能力，可為功能性食品開發(fā)及后續(xù)有關(guān)預(yù)知子中三萜皂苷的研究提供參考。