胡 幸，沈丹丹，匡鑫玉，陳丹丹，張 偉△

（1. 重慶市食品藥品檢驗檢測研究院·國家藥品監(jiān)督管理局麻醉精神藥品質量監(jiān)測重點實驗室，重慶 401121；2. 重慶大學生物工程學院，重慶 400044）

咪達唑侖注射劑屬第二類精神藥品，具有催眠、抗焦慮和鎮(zhèn)靜作用，臨床應用廣泛［1］。目前，國內咪達唑侖注射液有3 個生產廠家（共6 個規(guī)格），其中2 個生產廠家（共5個規(guī)格）通過一致性評價。咪達唑侖原料藥合成工藝中使用了錳（Mn）、鈦（Ti）、鎳（Ni）等元素［2］，咪達唑侖注射液生產過程中也易通過原料藥、輔料、包裝材料、注射用水、生產設備等引入元素雜質［3-4］，造成元素雜質超過允許日暴露量（PDE）。電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）法檢測靈敏度高、準確度好、動態(tài)線性范圍寬、分析速度快，可同時測量多種元素［5-6］，在痕量金屬元素測定中應用廣泛［7-9］。為保障用藥安全，參照《化學藥品注射劑與藥用玻璃包裝容器相容性研究技術指導原則（試行）》、人用藥品技術要求國際協(xié)調理事會（ICH）Q3D 元素雜質指南（以下簡稱ICH Q3D）和2022年版《美國藥典》233 Elemental Impurities：Procedures，本研究中建立了測定咪達唑侖注射液中18種元素雜質殘留量的ICP - MS 法，為評估元素雜質殘留風險提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

NexION 2000 型ICP - MS 儀（美國PerBinElmer 公司）；Milli-Q 型超純水儀（美國Millipore 公司）。

1.2 試藥

汞（Hg）單元素標準溶液（編號為GSB 04 - 1729 -2004，質量濃度為1 000 μg/mL），多元素標準溶液［含Mn，Ti，Ni 及鎂（Mg）、鋁（Al）、釩（V）、鉻（Cr）、鐵（Fe）、鈷（Co）、銅（Cu）、鋅（Zn）、砷（As）、鍶（Sr）、鎘（Cd）、銻（Sb）、鋇（Ba）、鉛（Pb），編號為GSB 04-1767-2004，質量濃度為100 μg/mL］，錸（Re）、銠（Rh）混合標準溶液（內標，編號為GNM - M022949 - 2013，質量濃度為1 000 μg/ mL），均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；鈧（Sc）、銦（In）混合標準溶液（內標，珀金埃爾默公司，編號為N9303832，質量濃度為10 μg/mL）；68%硝酸溶液（UPS級，批號為220615263），37%鹽酸溶液（UPS 級，批號為220308126），均購自蘇州晶瑞化學股份有限公司；咪達唑侖注射液（A廠家，規(guī)格為每支2 mL∶10 mg，批號分別為M201011，M201205，M201208）。

2 方法與結果

2.1 ICP-MS 試驗條件

等離子體射頻功率：1500W；等離子體氣流速：15L/min；輔助氣流速：1.2 L/ min；霧化氣流速：0.86 L/ min；霧化室溫度：20 ℃；碰撞氣：氦氣；碰撞氣流速：3.8 mL/min；掃描次數：20次；采集次數：3次。測定時24Mg，27Al，48Ti，51V，52Cr，55Mn，56Fe，59Co 以45Sc 作為內標，60Ni，63Cu，66Zn，75As，88Sr，111Cd，121Sb，137Ba 以115In 作為內標，202Hg和208Pb以187Re作為內標。

2.2 溶液制備

稀釋劑：取68%硝酸溶液60 mL、37%鹽酸溶液5 mL，置2 000 mL 塑料容量瓶中，用超純水稀釋并定容，搖勻，即得。

混合內標溶液（45Sc，115In，187Re）：精密量取Re 和Rh混合標準溶液（質量濃度為1 000μg/mL）0.5 mL，置50 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋成質量濃度為10μg/mL的溶液；再精密量取In和Sc混合標準溶液（質量濃度為10μg/mL）及Re和Rh混合標準溶液（質量濃度為10μg/mL）各適量，用稀釋劑分別稀釋成質量濃度為5 ng/ mL 和10 ng/mL的溶液。

標準貯備液：分別精密量取Hg單元素標準溶液（質量濃度為1 000 μg/mL）0.25 mL、多元素標準溶液（質量濃度為100 μg/mL）2.5 mL，置同一50 mL 塑料容量瓶中，用稀釋劑稀釋成質量濃度為5 μg/mL 的標準貯備液A；取1 mL 標準貯備液A，置50 mL 容量瓶中，用稀釋劑稀釋成質量濃度為100 ng/mL的標準貯備液B。

標準曲線溶液：精密量取標準貯備液B 適量，用稀釋劑稀釋成含Ti，V，Co，As，Cd，Hg，Pb 質量濃度分別為0.1，0.5，2，4，6，10，25 ng/ mL 的系列溶液；精密量取標準貯備液A 適量，用稀釋劑稀釋成含Mg，Al，Cr，Mn，Fe，Ni，Cu，Zn，Sr，Sb，Ba 質量濃度分別為0.1，0.5，6，25，50，75，100，150，200 ng/mL 的系列溶液。

100%加標供試品溶液：取樣品5 mL與標準貯備液B 2 mL，置同一50 mL 容量瓶中，用稀釋劑定容，作為Ti，V，Co，As，Cd，Hg，Pb 100%加標供試品溶液B；另取樣品5 mL 與標準貯備液A 0.5 mL，置同一50 mL 容量瓶中，用稀釋劑定容，作為Mg，Al，Cr，Mn，Fe，Ni，Cu，Zn，Sr，Sb，Ba 100%加標供試品溶液A。

加速試驗100%加標供試品溶液：取樣品適量，分別置溫度為（40±2）℃、相對濕度為（75±5）%的條件下1個月、3個月，即得加速試驗樣品，按100%加標供試品溶液制備方法制備加速試驗100%加標供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察：取2.2 項下系列標準曲線溶液，按2.1項下ICP-MS 試驗條件進樣測定，以內標溶液進行在線校正，以待測元素的質量濃度（X，ng/ mL）為橫坐標、待測元素與所選內標元素響應信號值的比值（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 方法學考察結果Tab.1 Results of the methodelogical investigation

檢測限與定量限確定：取線性關系考察項下溶液，按2.1 項下ICP - MS 試驗條件進樣測定，按公式計算檢測限（LOD）和定量限（LOQ），LOD= 3SD/k，LOQ=10SD/k。式中，SD為連續(xù)測定11 次空白溶液吸光度的標準差，k為標準曲線的斜率。結果見表1。

精密度試驗：精密吸取2.2 項下100%加標供試品溶液A 和B 各適量，按2.1 項下ICP-MS 工作條件連續(xù)進樣測定6次。結果見表1，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密量取樣品（批號為M201011）適量，按2.2 項下方法制備100%加標供試品溶液A 和B，分別于室溫放置0，2，4，8 h時按2.1項下ICP-MS試驗條件進樣測定。結果見表1，表明供試品溶液在室溫放置8 h內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取2.2 項下100%加標供試品溶液A和B各6份，按2.1項下ICP-MS試驗條件進樣測定。結果見表1，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取樣品5 mL，置50 mL 容量瓶中，平行9 份，分別加入標準貯備液B 1，2，3 mL，各3 份，用稀釋劑定容，搖勻，分別作為50%，100%，150%3 個濃度水平的加標供試品溶液B（Ti，V，Co，As，Cd，Hg，Pb）；另精密量取樣品5 mL，置50 mL 容量瓶中，平行9份，分別加入標準貯備液A 0.25，0.50，0.75 mL，各3 份，用稀釋劑定容，搖勻，分別作為50%，100%，150%3 個濃度水平的加標供試品溶液A（Mg，Al，Cr，Mn，Fe，Ni，Cu，Zn，Sr，Sb，Ba）。精密吸取50%，100%，150%加標供試品溶液A 和B 各適量，按2.1 項下ICP-MS 試驗條件進樣測定，結果見表1。

2.4 元素雜質限度計算

咪達唑侖每日最大用量為338.5 mg，規(guī)格為5 mg/mL，制劑日最大用量為67.7 mL。參照ICH Q3D，日最大劑量低于2 L時由PDE計算允許濃度。允許濃度（μg/g）=PDE/每日劑量。以最大允許濃度限度的30%為控制閾值。Fe 和Zn 元素的PDE 參考《化學藥品注射劑與藥用玻璃包裝容器相容性研究技術指導原則（試行）》中列出的值；Mn 元素的PDE 參考歐洲藥品管理局（EMA）發(fā)布的《金屬催化劑或金屬試劑殘留量限度規(guī)定的指導文件》；Al，Mg，Ti，Sr 元素在ICH Q3D 及其他原則中無推薦的PDE，由于其毒性較低，本研究中按ICH Q3D 中限值最高的PDE 1 500μg/d 進行風險初步評估；其余元素按ICH Q3D 注射途徑規(guī)定的PDE 值計算。結果見表2。

表2 咪達唑侖注射液中元素雜質的允許日暴露量與允許濃度Tab.2 Permissible daily exposure and permissible concentrations of heavy metals and harmful elements in Midazolam Injection

2.5 樣品含量測定

取2.2 項下100%加標供試品溶液和加速試驗100%加標供試品溶液，按2.1 項下ICP - MS 試驗條件進樣測定，結果見表3?？梢姡? 批樣品中18 種元素雜質均符合限值要求。其中Al 和Ba 的含量較高，可能存在元素遷移情況，其余元素雜質含量遠低于限度的30%，表明咪達唑侖注射液在生產過程中引入的元素雜質殘留基本可控。此外，加速試驗條件下，由于注射劑與玻璃包裝容器相互作用，Al，Mn，Sr，Ba元素雜質可能存在遷移情況，但影響藥品安全性的風險較低。

表3 樣品中元素雜質含量測定結果（μg/g）Tab.3 Results of content determination of elemental impurities in samples（μg/g）

3 討論

3.1 基質干擾

ICP-MS 分析會出現同位素、多原子離子、雙電荷離子等光譜干擾及基質效應、記憶效應等非光譜干擾［10-11］。咪達唑侖注射液處方中均使用了氯化鈉（9 mg/ mL 和5 mg/ mL）作為滲透壓調節(jié)劑，故元素雜質測定易受高鈉含量的基質干擾。本研究中通過合理的稀釋方式，降低了高鈉含量的基質干擾，并采用氦氣碰撞反應池技術減少多原子光譜的干擾。

3.2 樣品制備

樣品制備是元素雜質分析的關鍵步驟，應注意防止待測元素的損失及二次污染。相比于間接溶解法，直接溶解法簡化了操作步驟［12］，在一定程度上減少了目標元素的損失，適用于快速篩查和常規(guī)監(jiān)測元素雜質。在選擇合適的溶劑溶解樣品時，除考慮樣品的化學穩(wěn)定性與揮發(fā)性外，還應考慮樣品中目標元素的穩(wěn)定性。咪達唑侖注射液易溶于稀硝酸溶液，擬在室溫下直接將適量咪達唑侖注射液溶于3%硝酸溶液；此外，由于Hg 元素的揮發(fā)性較強，需添加穩(wěn)定劑以避免回收率過低［13］；鹽酸可以絡合Hg2+，確保離子在溶液中穩(wěn)定，避免延遲效應和記憶效應［14-15］。故本研究中最終采用含0.25%鹽酸溶液的3%硝酸溶液來溶解樣品。

3.3 方法評價

本研究中建立了定量測定咪達唑侖注射液中18種元素雜質含量的ICP - MS 法，該方法具有多元素同時分析、各元素線性范圍寬、靈敏度和精密度高等優(yōu)點，可用于咪達唑侖注射液中元素雜質的含量測定與風險評估。