王一丹,魏立娟,楊成德

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院,甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室,蘭州 730070)

大白菜(Brassicapekinensis)屬于十字花科蕓薹屬兩年生草本植物,又稱結(jié)球白菜和黃芽菜,味道鮮美可口,營養(yǎng)豐富,含有豐富的粗纖維,食用方法多種多樣,并且具有益胃生津,清熱除煩的功能。大白菜原產(chǎn)于中國北方地區(qū),是農(nóng)民秋季收入的重要來源,其種植面積和消費量在國內(nèi)居各類蔬菜之首,19世紀傳入日本、東南亞和歐洲各國[1]。近年來,由于人們對大白菜需求的不斷增長,常連作種植,導(dǎo)致多種病害加重發(fā)生。目前報道的大白菜病害有立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的大白菜褐腐病(莖基腐病)[2],鏈格孢屬真菌(Alternariaspp)引起的大白菜黑斑病,野油菜黃單胞菌(Xanthomonasecampestris)引起的大白菜黑腐病,大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的大白菜黃萎病[3],丁香假單孢菌(Pseudomonassyringae)引起的大白菜細菌性角斑病等[4]。這些病害的發(fā)生嚴重影響了大白菜的產(chǎn)量和品質(zhì),阻礙了大白菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

油菜黑脛病菌是一種真菌性病害,被分為高毒力強侵染型的Leptosphaeriamaculans和低毒力弱侵染型的Leptosphaeriabiglobosa[5]。研究表明,這兩個復(fù)合體是獨立的Leptosphaeria種[6-7],其中L.maculans致病力強,主要分布于西歐,北美洲,南美洲和澳大利亞,在亞洲和俄羅斯還未發(fā)現(xiàn)[5,8]。因此,為了防止由L.maculans引起的油菜莖基潰瘍病傳入中國,將其列為檢疫性病害[9]。相對于L.maculans而言,L.biglobosa的致病力較弱,最先于歐洲,北美等地發(fā)現(xiàn),危害范圍非常廣泛,在世界各地均有分布,在一定條件下會造成產(chǎn)量和經(jīng)濟損失[5, 10-11],其主要侵染十字花科蕓薹屬,豆科菜豆屬、?？迫劜輰俸妄埬懣柒啦说萚12]。Cai等[13]的研究表明,在中國L.biglobosa只侵染十字花科植物,如蘿卜、紅菜薹、甘藍和油菜等,其中油菜是被侵染最嚴重的植物[14]。由L.biglobosa引起的油菜黑脛病在中國的油菜產(chǎn)區(qū)分布非常廣泛,造成其產(chǎn)量下降[15-16],如榮松柏等[17]報道L.biglobosa導(dǎo)致油菜籽產(chǎn)量下降10%～50%。但目前還沒有關(guān)于L.biglobosa引起大白菜病害的報道。因此,對采自甘肅省隴南市武都區(qū)的葉斑病標本進行病原菌的分離、致病性測定和鑒定,并測定生物學特性,以期明確武都區(qū)大白菜葉斑病的病原種類及生物學特性,為該病害的診斷和綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試樣本 于2018年10月在甘肅省隴南市武都區(qū)采集的具有明顯葉斑癥狀的大白菜葉片。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、SA培養(yǎng)基、SDA培養(yǎng)基和RBA培養(yǎng)基,參考文獻[18]配置。

自行設(shè)計的培養(yǎng)基包括:PDA和白菜葉汁液混合培養(yǎng)基(葡萄糖15 g,土豆200 g,瓊脂15 g,白菜葉汁液,加水至1 000 mL)及PSA和大白菜葉汁液混合培養(yǎng)基(蔗糖15 g,土豆200 g,瓊脂15 g,大白菜葉汁液,加水至1 000 mL)。

1.2 病原菌的分離

采用組織分離法[18]。將具有典型葉斑病癥狀的大白菜葉片于病健交界處切成1 cm×1 cm的小方塊,在75%乙醇中消毒1 min后,用無菌蒸餾水沖洗3次,再用無菌濾紙吸干水分后,置于PDA培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)36～72 h,挑取病組織周圍的菌絲進行純化,獲得純培養(yǎng)的分離物,將其命名并轉(zhuǎn)接于PDA斜面上置于4 ℃冰箱中保存,備用。

1.3 致病性測定

將所得分離物接種于PDA培養(yǎng)基,25 ℃培養(yǎng)7 d后用無菌蒸餾水配制孢子懸浮液,孢子濃度達5×106mL-1。用無菌水清洗大白菜葉片并用無菌針頭在大白菜葉片表面造成微傷口,將孢子懸浮液噴灑于傷口處,以無菌水為對照[19], 3次重復(fù),置于25 ℃、濕度大于80%的人工氣候室中培養(yǎng)48 h后,置于室內(nèi)觀察發(fā)病情況。待大白菜出現(xiàn)明顯葉斑癥狀時,重新分離病原菌。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學鑒定 將所獲得的致病菌株轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上,25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后,觀察菌落顏色和形態(tài),在光學顯微鏡(Axio Lab.A1, Carl Zeiss, Germany)下觀察菌絲、分生孢子和分生孢子器的形態(tài)特征并測量分生孢子和分生孢子器大小(n=50)。

1.4.2 特異性基因序列鑒定 基因組DNA的提取:將致病菌株轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基,25 ℃黑暗培養(yǎng),當菌落生長到接近培養(yǎng)皿邊緣時,從菌落表面刮取菌絲體,并在加有液氮的無菌研缽中快速冷凍和研磨,后按照OMEGA BIO-TEX DNA試劑盒的說明提取基因組DNA, -20 ℃保存,備用。

PCR擴增:使用通用引物ITS(序列為:ITS15′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG-3′,ITS45′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)[20],特異性引物Actin(序列為:ActinF5′-GAG CAG GAG ATC CAG ACT GC-3′,ActinR5′-TTC GAG ATC CAC ATC TGC TG-3′)和β-tubulin(序列為:β-tubulinF5′-GTC GAG AAC TCC GAC GAG AC-3′,β-tubulinR5′-ATC TGG TCC TCG ACC TCC TT-3′)[21]進行PCR擴增(引物合成由西安擎科生物有限公司 完成)。

PCR反應(yīng)體系如下:ITS的反應(yīng)體系為:Mix(2×)10 μL,ITS1和ITS4(10 μmol/L)各 0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 8 μL。PCR擴增程序為:預(yù)變性95 ℃ 5 min;變性95 ℃ 30 s,退火54 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 1 min,30個循環(huán);再延伸72 ℃ 7 min,4 ℃保存。特異性引物Actin的反應(yīng)體系為:Mix(2×)10 μL,ActinF和ActinR(10 μmol/L)各0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 8 μL。PCR擴增程序為:預(yù)變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s,退火55 ℃ 30 s,延伸 72 ℃ 1 min,35個循環(huán);再延伸72 ℃ 10 min, 4 ℃保存。β-tubulin的反應(yīng)體系為:Mix(2×) 10 μL,β-tubulinF和β-tubulinR(10 μmol/L)各 0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 8 μL。PCR擴增程序為:預(yù)變性 94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s,退火 55 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 1 min,35個循環(huán);再延伸72 ℃ 10 min,4 ℃保存。

擴增后取6 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,將產(chǎn)生特異性條帶的PCR產(chǎn)物送往西安擎科生物有限公司進行測序。將所得序列提交至NCBI的GenBank中進行Blast比較,篩選出與病原菌高度相似的基因序列,用Mega(7.0)軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定病原菌的分類地位。

1.5 生物學特性的測定

1.5.1 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 選用PDA+大白菜葉汁液、PSA+大白菜葉汁液、PDA、PSA、Czapek、NA、SA、SDA和RBA培養(yǎng)基,將致病菌株接種于培養(yǎng)基中央,每種培養(yǎng)基重復(fù)3次,在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng) 7 d,采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.5.2 溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響 將病原菌接種于PDA培養(yǎng)基中央,在不同溫度 (5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、 40 ℃)下培養(yǎng),每個溫度重復(fù)3次。25 ℃黑暗培養(yǎng) 7 d后,采用十字交叉法測量菌落直徑,使用懸滴法計算孢子萌發(fā)率,每2 h記錄1次,直到孢子萌發(fā)率達到90%[18]。

1.5.3 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響 將致病菌株接種于不同pH(4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0和10.0)的PDA平板上,重復(fù)3次,并在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d。其余方法同“1.5.2”。

1.5.4 碳源對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響 將Czapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別用蔗糖、D-果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、L-鼠李糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和棉子糖替換基礎(chǔ)碳源,重復(fù)3次,并在25 ℃下培養(yǎng)7 d。其余方法同“1.5.2”。

1.5.5 氮源對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響 Czapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別將硝酸鉀、硝酸鈉、蛋白胨、酵母膏、甘氨酸、脯氨酸、氯化銨、磷酸氫二銨、組氨酸、尿素、硝酸銨、酵母浸粉和亞硝酸鈉作為替換氮源,重復(fù)3次,并在25 ℃下培養(yǎng)7 d。其余方法同“1.5.2”。

1.5.6 數(shù)據(jù)分析 IBM SPSS Statistics 25,采用最小顯著性差異(LSD)法檢驗差異的顯著性 (P<0.05);Microsoft Office Excel 2019用于數(shù)據(jù)的圖形表示;MEGA 7.0用于建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜葉斑病的癥狀

大白菜葉斑病主要危害白菜的葉片,在葉片表面形成圓形和不規(guī)則的病斑,邊緣明顯。病斑為灰色或灰白色,且密布黑色小點(分生孢子器)(圖1)。

圖1 大白菜葉斑病的田間癥狀Fig.1 Field symptoms of leaf spot on Brassica pekinensis

2.2 病原菌的分離和致病性測定

采用組織分離法得到8株分離物,分別編號為BCA、BCB、BCC、BCD、BCE、BCF、BCG和BCH。經(jīng)致病性測定,只有編號為BCG的分離物可以引起與田間病害相似的癥狀,接種7 d后開始發(fā)病,葉片上出現(xiàn)褐色小斑點,14 d后褐色小點逐漸擴展為不規(guī)則病斑,邊緣明顯呈黑褐色,中央為灰白色,30 d后,病斑擴大至整個葉面,邊緣明顯且病斑中央有黑色小點,與田間發(fā)病癥狀基本一致,且再次分離得到與分離物BCG形態(tài)特征一致的分離物,但對照未發(fā)病,說明分離物BCG為大白菜葉斑病的病原菌(圖2)。

a.接種7 d的發(fā)病癥狀;b.接種14 d的發(fā)病癥狀;c.接種30 d的發(fā)病癥狀;d.CK(無菌水處理)

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征觀察 病原菌BCG菌落呈圓形,中央扁平,呈褐色,邊緣白色絨毛狀,氣生菌絲發(fā)達;菌落底部產(chǎn)生黃褐色色素并從中心向四周擴散(圖3-a)。當培養(yǎng)一段時間后,氣生菌絲上會產(chǎn)生大小不一致的黃色或紅棕色液珠(圖3-c)。在PDA培養(yǎng)基上大量產(chǎn)生分生孢子,單細胞,壁光滑,透明,梭形或圓柱形,具油球且分生孢子兩端逐漸變細(圖3-d),大小為(1.56～ 2.77)μm×(3.23～6.10)μm,分生孢子器扁平,深褐色(圖3-e),大小為204.20 μm×140.88 μm。其形態(tài)特征均與L.biglobosa[20]相似。

a.BCG菌落背面;b.BCG菌落正面;c.BCG菌絲上的黃色和紅棕色的液珠;d.BCG分生孢子形態(tài);e.BCG分生孢子器形態(tài)

2.3.2 特異性基因序列分析 以菌株BCG的總DNA為模板,使用通用引物ITS、特異性引物Actin和β-tubulin基因序列進行擴增和測序,分別得到大小為578 bp、446 bp和471 bp的基因片段(登錄號:MW357737,MW524113和MW524114),將所得序列提交至GenBank中進行比對并構(gòu)建多位點系統(tǒng)發(fā)育樹(表1)。結(jié)果表明,菌株BCG與L.biglobosabrassicae(Lb1129)聚在一起,其bookstrap值為99(圖4),結(jié)合形態(tài)特征將菌株BCG鑒定為油菜黑脛病菌(L.biglobosa)。

表1 油菜黑脛病菌的多位點系統(tǒng)發(fā)育分析登錄號Table 1 L.biglobosa used in multilocus phylogenetic analysis and their GenBank accession numbers

圖4 基于ITS、Actin和β-tubulin的多位點系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS,Actin and β-tubulin multilocus phylogenetic analysis sequences

2.4 生物學特性測定

2.4.1 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 病原菌BCG在9種供試培養(yǎng)基上均能生長,且在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長最好,菌落直徑最大,達6.17 cm,顯著高于其他培養(yǎng)基(P<0.05);供試培養(yǎng)基為SDA時,菌絲生長稀疏、緩慢,菌落直徑最小,僅為3.30 cm,顯著低于其他培養(yǎng)基(P<0.05),說明菌株BCG生長最適培養(yǎng)基為PDA(圖5)。

標不同小寫字母者表示樣本間顯著差異(P<0.05),下同。1.馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基+大白菜葉汁液;2.馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基;3.馬鈴薯蔗糖瓊脂 培養(yǎng)基+大白菜葉汁液;4.馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基;5.察氏培養(yǎng)基;6.牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基; 7.淀粉瓊脂培養(yǎng)基;8.薩布培養(yǎng)基;9.虎紅瓊脂培養(yǎng)基

2.4.2 溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響 在10～35 ℃的溫度范圍內(nèi)均能生長,5 ℃和40 ℃時不生長,在25 ℃時菌落直徑最大,為4.53 cm,顯著高于其他處理(P<0.05)(圖6-A),表明菌絲生長的最適溫度為25 ℃。在20 ℃時孢子的萌發(fā)率達98%(圖6-B),顯著高于其他溫度(P< 0.05),說明孢子萌發(fā)的最佳溫度為20 ℃。

圖6 溫度對菌株BCG生長和孢子萌發(fā)的影響Fig.6 Effect of temperature colony size and spore germination rate of strain BCG

2.4.3 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響 病原菌BCG在pH為5.0～10.0的條件下,其菌絲和孢子均能正常生長和萌發(fā)。在pH為6.0時,菌落直徑最大,達4.75 cm,在pH為10.0時,菌落直徑最小,僅為3.30 cm,差異顯著(P< 0.05),當pH為5.0～8.0時差異不顯著(P< 0.05)(圖7-A),但當pH為6.0時,孢子萌發(fā)率最高,達80%(圖7-B),說明菌絲生長和孢子萌發(fā)最適宜的pH為6.0。

圖7 pH對菌株BCG生長和孢子萌發(fā)的影響Fig.7 Effect of pH on colony size and spore germination rate of strain BCG

2.4.4 碳源對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響 以L-阿拉伯糖、L-鼠李糖和木糖作為碳源時,菌株BCG生長最快,菌落直徑達4.7 cm,顯著高于其他碳源(P<0.05)(圖8-A)。以甘露醇為碳源時孢子萌發(fā)率達90%,顯著高于其他處理(P< 0.05)(圖8-B),表明菌株BCG生長的最適碳源為L-阿拉伯糖、L-鼠李糖和木糖,孢子萌發(fā)的最適碳源為甘露醇。

A:1.可溶性淀粉;2.蔗糖;3.葡糖糖;4.乳糖;5.麥芽糖;6.甘露醇;7.L-阿拉伯糖;8.L-鼠李糖;9.D-果糖;10.木糖

2.4.5 氮源對菌絲生長和孢子萌發(fā)率的影響 以酵母浸粉為氮源時,菌株BCG生長最快,菌落直徑達4.75 cm;以硝酸鉀為氮源時,菌絲生長最慢,菌落直徑僅為1.27 cm,顯著低于其他氮源(P<0.05)(圖9-A)。以尿素為氮源時萌發(fā)率最高,達73%(圖9-B),顯著高于其他處理(P< 0.05),表明菌株BCG菌絲生長的最適氮源為酵母浸粉,孢子萌發(fā)的最適氮源為尿素。

A:1.硝酸鉀;2.酵母膏;3.甘氨酸;4.蛋白胨;5.組氨酸;6.脯氨酸;7.尿素;8.磷酸氫二銨;9.氯化銨;10.硝酸銨;11.酵母浸粉

3 討 論

油菜黑脛病(L.biglobosa)是危害十字花科的重要病害之一,主要侵染寄主植物的葉片和莖稈。在甘肅省隴南市發(fā)現(xiàn)的大白菜標本上,其病斑癥狀與楊龍等[22]所報道的由L.biglobosa引起油菜葉片上的病斑癥狀相似,均產(chǎn)生了具有明顯邊界的枯死斑且病斑上有小黑點,但是病斑顏色稍有區(qū)別,油菜葉片病斑呈黃褐色,而大白菜葉片病斑呈灰白色,這可能是由于寄主植物、發(fā)病程度和環(huán)境的不同所導(dǎo)致。本試驗中,分離物BCG在致病性測試中其發(fā)病癥狀與田間采集癥狀基本一致,并再次分離得到接種物,其菌落特征與Deng等[23]所報道的基本一致,分生孢子器和分生孢子形態(tài)與宋培玲等[24]所報道一致, 因此將菌株BCG初步鑒定為L.biglobosa。一般研究者僅依靠形態(tài)學特征很難將病原菌準確鑒定到種,隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,為了更準確鑒定病原菌,通常將PCR技術(shù)和多基因鑒定方法用于復(fù)雜物種的鑒定,可以根據(jù)其親緣關(guān)系快速鑒定物種[25-27]。本試驗采用通用引物ITS,特異性引物Actin和β-tubulin進行測序,將所得序列進行多基因比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)合形態(tài)特征將菌株BCG鑒定為油菜黑脛病菌(L.biglobosa)。

生物學測定結(jié)果表明,菌株BCG于供試的9種培養(yǎng)基上均能正常生長,表明供試培養(yǎng)基類型不影響其生長。此外,菌株BCG在10～35 ℃均可生長,其最適溫度為25 ℃,與郝麗芬等[28]的報道一致;菌株BCG在pH 5.0～10.0均可生長,且在pH為5.0～8.0時差異不顯著(P<0.05),說明菌株BCG具有較強的pH適應(yīng)性,在弱酸至中性再至弱堿環(huán)境中均可正常生長。另外,菌株BCG的最適pH、最適碳源和最適氮源與郝麗芬等[28]的報道有所差異,可能由于地理位置、寄主和自然環(huán)境的不同,導(dǎo)致菌株的適應(yīng)性不同,使得其生物學特性存在差異。

本試驗通過分離與鑒定,確定了引起甘肅省大白菜葉斑病的病原菌為油菜黑脛病菌(L.biglobosa),為國內(nèi)首次證實由L.biglobosa引起大白菜葉斑病,并對該病原菌進行了生物學特性測定,為該病害的診斷和綜合防治提供了依據(jù)。