翟穎妍,張 鋒,楊藝煒,王天舒,洪 波

(1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所,西安 710043;2.西安市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心,西安 710000)

昆蟲利用嗅覺器官識(shí)別環(huán)境中的氣體分子,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行覓食、求偶、交配、產(chǎn)卵、躲避天敵等復(fù)雜生命活動(dòng)[1-2]。氣味受體(odorant receptors,ORs)和非典型氣味受體(odorant receptor co-receptor,Orco)是兩類在昆蟲嗅覺神經(jīng)元(olfactory receptor neuron,ORN)上表達(dá)的氣味受體蛋白,非典型氣味受體Orco又稱氣味共同受體[3]。兩類氣味受體在昆蟲嗅覺識(shí)別過程中發(fā)揮的功能不同,OR負(fù)責(zé)感受氣味分子,Orco則通過異源二聚化與OR結(jié)合形成復(fù)合體,構(gòu)成配體門控離子通道,激活信號(hào)傳導(dǎo)過程[4-5]。Orco不具有氣味識(shí)別功能,但能促進(jìn)OR的合成、運(yùn)輸、定位及構(gòu)象穩(wěn)定,提高氣體分子與OR的結(jié)合效率,在昆蟲嗅覺識(shí)別過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。在敲除了Orco基因的果蠅中,出現(xiàn)嗅覺受體定位缺失及嗅覺功能嚴(yán)重?fù)p傷的情況[8],對(duì)赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)進(jìn)行類似試驗(yàn)也得到相似結(jié)果[9],敲除煙草天蛾(Manducasexta)的Orco基因后發(fā)現(xiàn)其對(duì)寄主植物氣味的響應(yīng)大幅減弱[10]。Orco在幾乎所有嗅覺神經(jīng)元中表達(dá),且不同昆蟲的Orco序列高度保守[11]。

大灰象甲(Sympiezomiasvelatus)俗稱尖嘴猴、灰老道,屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)雜食性害蟲[12],能夠危害多種農(nóng)作物及林木[13-14]。該蟲在國內(nèi)分布較廣,主要分布在東北、華北、華中及西北地區(qū)。2021年大灰象甲在陜西和山西兩省交界處黃河沿岸一帶的冬棗種植區(qū)發(fā)生嚴(yán)重危害,其成蟲喜食棗樹新芽,常將棗芽完全吃禿,造成棗樹二次發(fā)芽,開花坐果推遲,導(dǎo)致產(chǎn)量大幅下降甚至絕產(chǎn),給當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,對(duì)于大灰象甲多使用聯(lián)苯菊酯、定蟲隆、辛硫磷或毒死蜱等化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治[15],由于該蟲成蟲體型較大(體長8～10 mm)且抗逆性較強(qiáng),傳統(tǒng)農(nóng)藥對(duì)其防治效果不佳,若提高施藥劑量及次數(shù),不僅會(huì)造成成本增加,還會(huì)對(duì)環(huán)境及人類健康帶來威脅。因此,亟需探索一種高效環(huán)保的大灰象甲綠色防治新技術(shù)。

Orco基因已在多種鞘翅目昆蟲中被鑒定出來,包括華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、華山松大小蠹(Dendroctonusarmandi)、紅棕象甲(Rhynchophorusferrugineus)、廣聚螢葉甲(Ophraellacommuna)、云杉八齒小蠹(Ipstypographus)等[16-20]。而有關(guān)大灰象甲Orco基因及其組織特異性表達(dá)的研究報(bào)道較少,基于大灰象甲成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),采用反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)克隆出Orco基因,對(duì)Orco蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析,同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)測(cè)定并分析大灰象甲成蟲不同性別及不同組織中Orco基因的表達(dá)譜,以期為進(jìn)一步研究大灰象甲氣味受體功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

大灰象甲初羽化成蟲于2021年4月采集自山西省永濟(jì)市冬棗園(110.60°E,34.95°N),將雌雄成蟲分開后在人工氣候箱內(nèi)(溫度25 ℃± 1 ℃,相對(duì)濕度60%±5%,光周期16L∶8D)以新鮮棗芽飼養(yǎng)直至試驗(yàn)使用。棗芽采集自陜西省科學(xué)院大荔生物農(nóng)業(yè)研究示范基地,品種為‘冬棗’。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

選取羽化后3日齡大灰象甲雌雄成蟲各200頭解剖,分別收集觸角、頭(去除觸角)、胸、腹、足、翅不同組織于1.5 mL離心管內(nèi),立即置于液氮中冷凍。采用Trizol法利用總RNA提取試劑RNAiso Plus(TaKaRa,北京)提取不同組織的總RNA,使用微量分光光度計(jì)(杭州奧盛儀器有限公司)檢測(cè),確保OD260/OD280值為1.8～2.0,RNA樣品濃度>100 ng/μL,并記錄各樣本RNA濃度。使用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,北京)按合成方法去除基因組DNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈,使用微量分光光度計(jì)檢測(cè)并記錄cDNA濃度,-20 ℃保存,備用。

1.3 PCR產(chǎn)物的回收、克隆及測(cè)序

根據(jù)前期獲得的大灰象甲雌雄成蟲轉(zhuǎn)錄組unigene序列構(gòu)建核苷酸本地BLAST數(shù)據(jù)庫。參考洪波等[21]的方法,使用近源種棗食芽象甲(Pachyrhinusyasumatsui)的Orco氨基酸序列(Genbank登錄號(hào):UUW42911),通過tBlastn檢索獲得大灰象甲候選Orco的mRNA全長unigene序列,根據(jù)該序列使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)Orco基因的特異性引物SvelOrco-F/SvelOrco-R(表1)。所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

以“1.2”節(jié)合成的cDNA為模板,SvelOrco-F/SvelOrco-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)體系(20 μL):2×TaqMasterMix(康為世紀(jì)生物科技股份有限公司) 10 μL、上下游引物各 1 μL、ddH2O 7 μL、cDNA模板1 μL。RT-PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,經(jīng)過切膠純化來回收大小相符的目的DNA條帶,將回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體(TaKaRa,北京)后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技(北京)有限公司)內(nèi),搖菌1 h后將菌液涂在LB平板上, 37 ℃過夜培養(yǎng)12 h以上,挑取白色單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè),選擇陽性克隆搖菌4～5 h,送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 大灰象甲Orco基因的生物信息學(xué)分析

對(duì)“1.3”節(jié)中獲得的大灰象甲Orco基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析:用ORFfinder在線工具查找大灰象甲Orco基因開放閱讀框(Opening Reading Frame,ORF)并預(yù)測(cè)翻譯的氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder);用expasy在線軟件預(yù)測(cè)Orco蛋白質(zhì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)(https://web.expasy.org/protparam/);用Signal P在線軟件預(yù)測(cè)Orco蛋白是否存在信號(hào)肽(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0);用TMHMM在線軟件預(yù)測(cè)Orco蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0);用NetPhos在線軟件分析其磷酸化位點(diǎn)(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1);用SOPMA在線軟件分析Orco蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html);用Swiss-Model在線軟件預(yù)測(cè)并分析其三級(jí)結(jié)構(gòu)(https://swissmodel.expasy.org)。

使用NCBI在線工具BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) 對(duì)大灰象甲Orco核苷酸序列進(jìn)行同源比對(duì);利用DNAMAN 8.0 軟件對(duì)大灰象甲Orco基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源分析。為明確大灰象甲Orco與其他昆蟲Orco氨基酸序列之間的親緣關(guān)系,使用Mrbayes 3.2.6軟件采用貝葉斯推理法[22-23]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,運(yùn)用GTR模型,運(yùn)算至分裂頻率分支頻率的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.01,舍去250個(gè)老化樣本進(jìn)行分析,對(duì)得到的系統(tǒng)發(fā)育樹在FigTree 1.4.3軟件中進(jìn)行編輯。

1.5 大灰象甲Orco基因的表達(dá)譜分析

同理,根據(jù)棗食芽象甲內(nèi)參基因EF1α氨基酸序列(Genbank登錄號(hào):UUW42912),在本地BLAST數(shù)據(jù)庫中檢索出同源unigene序列并設(shè)計(jì)引物SvelEF1α-F/SvelEF1α-R,經(jīng)過PCR擴(kuò)增后得到大灰象甲EF1α基因全長序列(GenBank登錄號(hào):OM417063)。選取大灰象甲EF1α和β-actin(GenBank登錄號(hào):MH717233)作為雙內(nèi)參基因[14],利用qPCR測(cè)定并分析大灰象甲成蟲不同性別和不同組織中Orco基因的表達(dá)量差異,qPCR所用的特異性引物見表1。qPCR反應(yīng)體系(20 μL):TB Green Premix ExTaqⅡ(TaKaRa,北京)10 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、 ddH2O 7 μL、 cDNA模板1 μL。qPCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火 30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)及3次技術(shù)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

以大灰象甲雌蟲腹部Orco基因的表達(dá)量為基準(zhǔn)[24],采用2-△△Ct方法[25]計(jì)算各組織中Orco基因的相對(duì)表達(dá)量,使用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independentt-test)檢測(cè)同一組織不同性別間的表達(dá)量差異,利用單因素方差分析法(one-way ANOVA)檢驗(yàn)同一性別不同組織間的表達(dá)量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大灰象甲Orco基因的序列分析

通過克隆測(cè)序獲得大灰象甲Orco基因序列,將該基因命名為SvelOrco(GenBank登錄號(hào):OM417062)。其cDNA序列全長為2 027 bp,其中開放閱讀框?yàn)? 449 bp,5′端和3′端非翻譯區(qū)(Untranslated region,UTR)分別為169 bp和409 bp。SvelOrco基因編碼482個(gè)氨基酸,其中亮氨酸(Leu)含量最高,達(dá)12.4%。預(yù)測(cè)SvelOrco基因編碼蛋白的分子質(zhì)量為53.49 ku,等電點(diǎn)為5.66,不穩(wěn)定指數(shù)為30.04,親水性平均值為 0.329,為穩(wěn)定的疏水性蛋白。

氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),SvelOrco蛋白無信號(hào)肽,7個(gè)跨膜區(qū)分別位于第38～60位、第75～97位、第136～158位、第196～218位、第343～365位、第385～407位和第456～478位氨基酸處, N端在膜內(nèi),C端在膜外。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)共有47個(gè)氨基酸為潛在的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn),包括5個(gè)酪氨酸(Tyr)、12個(gè)蘇氨酸(Thr)和30個(gè)絲氨酸(Ser)。根據(jù)SOPMA分析結(jié)果,SvelOrco蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占比54.98%,無規(guī)則卷曲占比26.76%,延伸鏈占比14.73%,β-轉(zhuǎn)角占比3.53%,α-螺旋是SvelOrco蛋白的主要結(jié)構(gòu)形式(圖1)。利用Swiss-Model在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫中對(duì)SvelOrco序列進(jìn)行同源性搜索,選取同源性最高(sequence identity=64.86%)的寄生性榕小蜂(Apocryptabakeri)的Orco(PDB ID:6c70.1.A)作為模板進(jìn)行同源建模[26],預(yù)測(cè)出的SvelOrco蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)相符,主要由7個(gè) α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成(圖2)。

藍(lán)色、紅色、綠色和紫色分別表示α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲

N和C分別表示SvelOrco蛋白的N端和C端,α1～α7表示7個(gè)α-螺旋

使用NCBI的BLAST工具進(jìn)行核苷酸序列比較,比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大灰象甲SvelOrco與鞘翅目昆蟲的Orco基因序列同源性很高,和亞棕象甲(Rhynchophorusvulneratus)基因序列相似性達(dá)76.32%,和米象(Sitophilusoryzae)基因序列相似性達(dá)76.27%。在DNAman里將SvelOrco氨基酸序列與鞘翅目2種昆蟲及其他目的6種昆蟲Orco氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明SvelOrco與紅棕象甲R(shí)ferOrco序列一致度為80.72%,和云杉八齒小蠹(Ipstypographus)的Orco序列一致度為79.12%,和黃地老虎(Agrotissegetum)、煙蚜繭蜂(Aphidiusgifuensis)、綠盲蝽(Apolyguslucorum)、亞洲小車蝗(Oedaleusasiaticus)、棲北散白蟻(Reticulitermessperatus)、桔小實(shí)蠅(Bactroceradorsalis)的Orco氨基酸序列一致度分別為57.03%、58.84%、55.42%、55.62%、 55.02%、58.43%。其中高度保守的區(qū)域集中在序列的后半部分(C端),位于第6至第7跨膜區(qū)之間(圖3)。

2.2 大灰象甲SvelOrco蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4),對(duì)包括大灰象甲SvelOrco在內(nèi)的共7個(gè)目89種昆蟲的Orco氨基酸序列進(jìn)行同源性比較,可以看出,同一目昆蟲的Orco聚為一類,不同目之間具有同源性但存在一定差異,鞘翅目、雙翅目和鱗翅目聚為一簇,親緣關(guān)系最近,半翅目、直翅目和蜚蠊目聚為一簇,膜翅目單獨(dú)為一簇。大灰象甲SvelOrco位于鞘翅目分支中,與云杉八齒小蠹ItypOrco親緣關(guān)系最近,其次為中歐山松大小蠹(Dendroctonusponderosae)的DponOrco。

此系統(tǒng)發(fā)育樹中顯示了不同物種的Orco名稱及其GenBank登錄號(hào)。星號(hào)代表SvelOrco所在位置

2.3 大灰象甲SvelOrco基因的表達(dá)譜分析

根據(jù)qPCR的檢測(cè)結(jié)果(圖5),SvelOrco在大灰象甲雌、雄成蟲觸角中的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于其他組織中的表達(dá)量,分別為雌蟲腹部表達(dá)量的513倍和624倍。SvelOrco在雄蟲觸角的表達(dá)量顯著高于雌蟲,是雌蟲觸角表達(dá)量的1.22倍。SvelOrco在雌、雄成蟲翅部組織中也有少量表達(dá),表達(dá)量分別為雌蟲腹部表達(dá)量的43.23倍和17.64倍,SvelOrco在雌蟲翅部的表達(dá)量顯著高于雄蟲,是雄蟲翅部表達(dá)量的2.45倍。SvelOrco在雌、雄成蟲的頭、胸、腹和足部組織僅微量表達(dá),且差異不顯著。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;柱上不同大寫和小寫字母分別表示大灰象甲雌成蟲和雄成蟲在不同組織中SvelOrco基因的相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性(P<0.05,Tukey法);柱上**、ns分別表示SvelOrco基因相對(duì)表達(dá)量在大灰象甲同一組織不同性別之間差異顯著(P<0.05)和差異不顯著(P>0.05)(t測(cè)驗(yàn)法)

3 結(jié)論與討論

本研究首次克隆大灰象甲SvelOrco基因,分析了SvelOrco的理化性質(zhì)、序列同源性及與其他昆蟲Orco的親緣關(guān)系,明確了SvelOrco基因在大灰象甲不同性別、不同組織中的表達(dá)譜模式。大灰象甲SvelOrco基因編碼482個(gè)氨基酸,這與紅棕象甲Orco基因編碼482個(gè)氨基酸、松樹蜂(Sirexnoctilio)的SnocOrco基因編碼481個(gè)氨基酸、云杉八齒小蠹Orco基因編碼480個(gè)氨基酸[18,20,27]數(shù)量類似。SvelOrco蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成,有7個(gè)跨膜α-螺旋,N端在膜內(nèi),C端在膜外,是穩(wěn)定的疏水性蛋白,符合昆蟲非典型氣味受體特征。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),SvelOrco除與同為鞘翅目的紅棕象甲和云杉八齒小蠹的序列相似性很高(分別為80.72%和79.12%)外,與其他目昆蟲Orco的相似性都在50%以上,表明盡管昆蟲經(jīng)過漫長進(jìn)化,不同目之間的Orco序列仍保持很高的保守性,且不同目昆蟲Orco的后半部分氨基酸序列更是高度保守,表明該高度保守的區(qū)域可能是在Orco和OR互作中不可或缺的功能區(qū)[28]。

Rfer.紅棕象甲R(shí)hynchophorus ferrugineus(AOO35283.1);Svel.大灰象甲Sympiezomias velatus(UVZ35314);Ityp.云杉八齒小蠹Ips typographus(QOI12086.1);Aseg.黃地老虎Agrotis segetum(AGS41440.1);Agif.煙蚜繭蜂Aphidius gifuensis(AZQ24921.1);Aluc.綠盲蝽Apolygus lucorum(AHC72290.1);Oasi.亞洲小車蝗Oedaleus asiaticus(QAB43939.1);Rspe.棲北散白蟻Reticulitermes speratus(BAU20240.1);Bdor.桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis(XP_011203778.1)

從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出,鞘翅目、雙翅目和鱗翅目聚為一簇,親緣關(guān)系最近,這與棗食芽象甲[21]系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,大灰象甲SvelOrco與同屬鞘翅目象甲科的云杉八齒小蠹的同源性最高,親緣關(guān)系最近,其次是中歐山松大小蠹。Li 等[29]基于二代測(cè)序的大灰象甲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),采用最大似然法得到的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果認(rèn)為大灰象甲Orco和中歐山松大小蠹的親緣關(guān)系最近,其次是紅棕象甲,與本研究結(jié)果有所區(qū)別。推測(cè)原因一方面可能由于該研究參與比對(duì)的Orco序列較少,除大灰象甲Orco序列之外僅用了其他4種鞘翅目昆蟲的Orco[中歐山松大小蠹、紅棕象甲、赤擬谷盜和厚墊黃帶蜂天牛(Megacyllenecaryae)]進(jìn)行分析;另一方面可能與樣本采集地和寄主植物有關(guān),Li等[29]研究所用大灰象甲采集自吉林省扶余市花生,而本研究所用蟲源為山西省永濟(jì)市冬棗上采得,兩者之間大灰象甲Orco氨基酸序列經(jīng)比對(duì),同源性僅為87.16%,表明不同地區(qū)的氣候環(huán)境及寄主差異可能導(dǎo)致SvelOrco基因發(fā)生變異。另外Li 等[29]僅根據(jù)FPKM值(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)對(duì)比了Orco在大灰象甲雌、雄成蟲觸角上的表達(dá)情況,未對(duì)Orco在大灰象甲成蟲不同組織的表達(dá)譜進(jìn)行具體分析。

本研究qPCR結(jié)果表明,SvelOrco在大灰象甲成蟲觸角中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織,這與對(duì)二點(diǎn)委夜蛾(Athetislepigone)、茶翅蝽(Halyomorphahalys)[24,30]等的研究結(jié)果一致,表明Orco主要在昆蟲觸角中表達(dá)。大灰象甲雄蟲觸角SvelOrco的表達(dá)量高于雌蟲,是雌蟲觸角的1.22倍,與桃蛀螟(Conogethespunctiferalis)雄蟲觸角CpunOrco的表達(dá)量是雌蟲觸角的 1.32倍[31],雙委夜蛾(Athetisdissimilis)雄蛾觸角AdisOrco的表達(dá)量是雌蛾觸角的4.2倍[32]等結(jié)果一致;而大猿葉甲(Colaphellusbowringi)、柑橘大實(shí)蠅(Bactroceraminax)的Orco在雌蟲觸角的表達(dá)量卻高于雄成蟲[33-34];棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、麥蛾(Sitotrogacerealella)則是雌雄成蟲Orco在觸角上的表達(dá)差異不顯著[35-36]。Orco在觸角上的表達(dá)出現(xiàn)性別差異可能與雌、雄成蟲觸角上嗅覺感受器的數(shù)量、種類、感受不同信息物質(zhì)和功能有關(guān)[37]。SvelOrco除了在觸角大量表達(dá)外,在大灰象甲的翅部組織中也有少量表達(dá),且雌蟲翅部的表達(dá)量顯著高于雄蟲,在頭、胸、腹和足部表達(dá)極低。棗食芽象甲PyasOrco在翅部也有少量表達(dá),且雌蟲翅部表達(dá)量也顯著高于雄蟲,不過PyasOrco在足部還有少量表達(dá)[21]。申建梅等[38]研究表明瓜實(shí)蠅(Bactroceracucurbita)的Orco除了在翅部有少量表達(dá)外,在頭和前足還有少量表達(dá)。還有研究發(fā)現(xiàn)Orco在味覺器官如岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)及東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)[39-40]的喙中表達(dá)。Orco除了在嗅覺感受器豐富的觸角上高表達(dá)之外,在其他器官也有表達(dá),推測(cè)是由于Orco蛋白可能參與了氣味感受之外的其他生理生化反應(yīng),具有氣味感受外的其他功能[41]。

Orco的高度保守特性和普遍表達(dá)特點(diǎn)使其在昆蟲嗅覺識(shí)別過程中起著重要作用,能夠作為切斷嗅覺通訊的作用靶標(biāo)來開發(fā)新型廣譜高效藥劑。如利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)向華山松大小蠹體內(nèi)注射Orco基因的外源雙鏈RNA(Double-stranded RNA,dsRNA),Orco基因的表達(dá)量與對(duì)照相比顯著降低,同時(shí)華山松大小蠹對(duì)寄主揮發(fā)物的感受能力下降[17,42]。Jones等發(fā)現(xiàn)Orco的興奮劑VUAAI能夠激活Orco從而激活嗅覺神經(jīng)元,使昆蟲喪失對(duì)不同化學(xué)感受的區(qū)分,影響昆蟲相關(guān)行為[43]。后續(xù)研究將以SvelOrco為靶標(biāo)利用RNA干擾技術(shù)降低大灰象甲體內(nèi)Orco的表達(dá),或開發(fā)Orco的興奮劑及抑制劑,干擾其嗅覺相關(guān)行為,減輕對(duì)寄主的危害程度。本研究不僅為SvelOrco蛋白功能及大灰象甲嗅覺分子識(shí)別機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ),還為以O(shè)rco為靶標(biāo)的大灰象甲綠色防控提供了參考。