晁 嘉,簡思杰,2,孫 薇,3,陳 銳,4,丁 銳,4,陳 琛,3,5,劉 祥,2

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院 中德天然產(chǎn)物研究所,陜西漢中 723001;2.阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽阜陽 236037;3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西漢中 723001;4.陜西理工大學(xué),秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點實驗室(培育),陜西漢中 723001;5.陜西省資源生物重點實驗室,陜西漢中 723001)

隨經(jīng)濟建設(shè)繁榮發(fā)展,人們的生活水平不斷提高,魚類消費也在逐年增加,《2021中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》顯示,2020年中國水產(chǎn)品總量達到 6 549.02萬t,漁業(yè)災(zāi)情造成的經(jīng)濟損失達 1 525 996.46萬元[1],其中病原菌感染是影響漁業(yè)發(fā)展的重要問題[1-2]。熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)是魚類感染的主要病原菌[3-4],可感染鯽魚、草魚、鯉魚等常見養(yǎng)殖魚類[5-6],主要的感染癥狀為魚體發(fā)炎,鱗片脫落,鰭條充血糜爛,呈現(xiàn)赤皮病。熒光假單胞菌的防治主要為抗生素,但抗生素濫用易出現(xiàn)耐藥性菌株,且存在殘留以及污染壞境等問題[7];中草藥治療的機制暫不明確且效果不明顯;滅活疫苗處于研究初期,在安全性和批量生產(chǎn)上存在不足,水產(chǎn)應(yīng)用較少,有必要開發(fā)新型疫苗。重組亞單位疫苗,是利用基因工程或化學(xué)方法生產(chǎn)的可使人或動物激活體內(nèi)免疫反應(yīng)的免疫活性片段,具有安全、高效等優(yōu)點,是目前疫苗研究的熱點領(lǐng)域[8-9]。

外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜上的一類蛋白,負(fù)責(zé)胞外信息的接受以及胞內(nèi)通路的激活,還具有物質(zhì)運輸、結(jié)構(gòu)支撐等多種特性,尤其是免疫原性較強[10],在重組疫苗上備受關(guān)注。目前已經(jīng)有一系列基于外膜蛋白免疫原性的魚類疫苗研究,Tang等[11]將魚腸弧菌的5個外膜蛋白進行原核表達,發(fā)現(xiàn)rOmpT具有良好的保護性,保護率可達到79.6%;毛然然等[12]將嗜水氣單胞菌外膜蛋白OprM原核表達并進行免疫保護作用評價,發(fā)現(xiàn)外膜蛋白OprM的保護率可達89.47%;榮娜等[13-14]構(gòu)建重組菌株并獲取嗜水氣單胞菌外膜蛋白P5、TolC,發(fā)現(xiàn)外膜蛋白P5對嗜水氣單胞菌的魚類保護率為69%,TolC則在抗血清滴度1∶6 400時仍具有與嗜水氣單胞菌相互結(jié)合的能力。外膜蛋白中脂蛋白定位系統(tǒng)(Localization of lipoprotein system,Lol)負(fù)責(zé)脂蛋白的轉(zhuǎn)運與定位,其與生物致病力及耐藥性密切相關(guān)[15]。Lol系統(tǒng)由LolA-E 5 個蛋白構(gòu)成,其中脂蛋白定位系統(tǒng)因子B(Localization of lipoprotein B,LolB)在脂蛋白轉(zhuǎn)運過程中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運的最后一步,將脂蛋白插入到外膜,是一種重要的外膜蛋白[16]。目前外膜蛋白LolB對魚類的保護性研究缺乏,本文選取LolB蛋白進行探究,期望為后續(xù)魚類疫苗研發(fā)提供可行性參考。

熒光假單胞菌是革蘭氏陰性菌,其表面分布的外膜蛋白暴露在細(xì)胞外,更易激活宿主的免疫系統(tǒng)。Sun等[17]制備熒光假單胞菌外膜蛋白ExbB并評價其被動免疫保護作用,發(fā)現(xiàn)ExbB對熒光假單胞菌的保護率可達54%,同時對嗜水氣單胞菌具有交叉免疫保護作用,保護率為38.4%;Liu等[18]構(gòu)建表達的熒光假單胞菌外膜蛋白PF1380同樣具有交叉被動免疫保護作用,對熒光假單胞菌保護率為57%,對嗜水氣單胞菌的保護率為50%。可見熒光假單胞菌外膜蛋白的免疫原性較好,有疫苗候選潛質(zhì)。

綜上所述,本研究選擇熒光假單胞菌外膜蛋白LolB對其進行分子克隆原核表達,免疫紅鯽(Carassiusauratus),評價免疫原性,為后續(xù)重組蛋白疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株及供試動物 熒光假單胞菌 ATCC 13525、EscherichiacoliDH5a、BL21菌株及pET-32a質(zhì)粒由陜西理工大學(xué)中德天然產(chǎn)物研究所保存;紅鯽購自漢中市水族館,體表健康,平均體質(zhì)量約18 g,身長平均約10 cm,試驗前在90 L水箱中飼養(yǎng)兩周,每天換水1/3,飼養(yǎng)用水經(jīng)過處理,平均水溫(22 ± 2) ℃,飼料(上海傲滋水族科技有限公司)每日供給魚體質(zhì)量的1%,使用氣泵不間斷供給空氣。

1.1.2 主要試劑 rTaq聚合酶、T4-DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ 及XhoⅠ 購自日本TaKaRa 公司;細(xì)菌基因組提取試劑盒購自北京天根試劑公司,質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自杭州博日公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、氨芐西林(Ampicillin,AMP)購自北京索萊寶;TMB顯色液為上海生工公司產(chǎn)品;酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)、溶菌酶(Lysozyme,LZM)、免疫球蛋白M(ImmunoglobulinM,IgM)、過氧化氫酶(Catalase from micrococcus lysodeikticus,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自MP生物醫(yī)療公司;動物總RNA抽提試劑盒購自上海生物工程有限公司;Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green ProTaqHS預(yù)混型qRT-PCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;引物合成、基因測序由西安奧科生物公司提供;大鼠抗魚血清為實驗室自制;HRP標(biāo)記山羊抗大鼠IgG(免疫球蛋白G,Immunoglobulin G)購于Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 從NCBI(美國國家生物技術(shù)信息中心,National center of biotechnology information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上獲取不同菌株外膜蛋白LolB序列,利用GeneDoc 3.2軟件繪制不同菌株外膜蛋白的氨基酸序列比對圖進行同源性分析,以MEGA 5.0軟件繪制不同菌株系統(tǒng)發(fā)育樹,比較不同菌株親緣關(guān)系。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 NCBI數(shù)據(jù)庫中查找熒光假單胞菌 ATCC 13525 全基因組,根據(jù)全基因組設(shè)計lolB的擴增引物。lolB基因登錄號為SNY09892.1,大小為618 bp,上游引物:5′-ACCGGATCCATGTTTTTGCGCCACGTT-3′,下游引物:5′-CCACTCGAGTTATTGCCCCAG CTTGCG-3′,下劃線處為酶切位點。擴增模板為熒光假單胞菌基因組;利用rTaq聚合酶進行擴增,擴增體系為50 μL,預(yù)變性溫度、退火溫度與退火時間分別為94 ℃、55 ℃、90 s;對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠純化;使用BamH Ι 與XhoⅠ 對PCR回收產(chǎn)物與pET-32a雙酶切,再對酶切產(chǎn)物(目的片段和載體)進行切膠回收;通過T4-DNA 連接酶將目的片段與載體進行連接,16 ℃連接16 h。將連接后的產(chǎn)物進行E.coliDH5α轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化成功后提取質(zhì)粒,即得構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒。利用雙酶切與基因測序技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒,準(zhǔn)確無誤后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21中,進行蛋白的原核表達。

1.2.3 重組蛋白的表達與純化 挑取重組單菌落培養(yǎng)8 h,以1∶100轉(zhuǎn)接至新的含氨芐青霉素液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至OD600=0.5后用0.1 mol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h。完成后取1 mL菌液并離心收菌,加入300 μL的2×SDS上樣緩沖液后于沸水中煮5 min,通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測目的蛋白的表達;重組菌株成功構(gòu)建后,吸取重組菌液以1∶100轉(zhuǎn)接至新的600 mL含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至OD600=0.5后用0.1 mol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h,結(jié)合包涵體洗滌和SDS-PAGE蛋白電泳切膠法純化目的蛋白,凍干后-80 ℃保存,備用。

1.2.4 蛋白誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化 采用L9(34)正交試驗?zāi)Ｐ吞骄磕康牡鞍椎淖罴驯磉_條件。主要分為以下步驟:將過夜培養(yǎng)的蛋白表達菌液以1∶100的比例接入600 mL培養(yǎng)液中,按照要求(表1)加入不同濃度的IPTG,按照不同溫度與時間培養(yǎng)至設(shè)定的OD600值,每組進行3次重復(fù)。取1 mL誘導(dǎo)菌液,離心收菌后菌體加入300 μL 2×SDS 蛋白上樣緩沖液,沸水浴5 min,SDS-PAGE電泳獲得不同誘導(dǎo)條件下的LolB蛋白表達圖譜。通過軟件Phoretix 1D和SPSS 22.0分別對表達圖譜光密度和因子進行顯著性分析。

表1 蛋白表達條件正交試驗Table 1 Factors and levels of orthogonal test for protein expression condition

1.2.5 紅鯽LolB多克隆抗體制備、特異性與效價檢測 試驗組與對照組各15條紅鯽,試驗組按照2 μg/g體質(zhì)量的LolB蛋白劑量進行免疫,蛋白溶液與福氏不完全佐劑按照1∶1的比例混合,置于搖床中過夜乳化,腹腔注射免疫紅鯽(每尾40 μL),對照組注射無菌水;14 d后進行第2 次免疫,21 d后進行第3 次免疫,操作同上,免疫完成后7 d,紅鯽尾靜脈取血,血液4 ℃靜置2 h, 4 ℃、3 000 r/min離心10 min獲取血清。免疫印跡(Western blotting)夾心法驗證LolB紅鯽血清抗體特異性,步驟如下:將熒光假單胞菌全蛋白進行SDS-PAGE電泳;將硝酸纖維素(Nitrocellulose membrane,NC)膜置于電轉(zhuǎn)槽中,80 V電轉(zhuǎn)1 h,隨后將NC膜于脫脂牛奶中充分封閉;將封閉好的NC膜在不同稀釋倍數(shù)的紅鯽血清(1∶100, 1∶200)中于37 ℃中孵育40 min,隨后用TBST溶液洗滌3 次,每次10 min;隨后于 1∶400的大鼠抗魚血清中孵育,具體步驟同上;再于1∶3 000山羊抗大鼠抗體中孵育,完成后TBST溶液10 min洗滌3 次,利用DAB進行顯色并確定抗原-抗體的結(jié)合。

1.2.6 紅鯽免疫活性及抗氧化指標(biāo)的檢測 紅鯽第3 次免疫LolB蛋白后7 d,尾靜脈取血,對血清中ACP、AKP、LZM和IgM進行測定,免疫因子對機體免疫功能的激活具有參考意義。第3 次免疫后7 d對紅鯽攻毒熒光假單胞菌,3 d后取血,血清中SOD、CAT、GSH-Px和MDA的含量測定對機體抗氧化自由基的能力具有參考意義。本試驗采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定,按說明書步驟進行。

1.2.7 細(xì)胞吞噬試驗 紅鯽第3次免疫LolB蛋白后7 d,尾靜脈取血,魚血漿(加抗凝劑)200 μL和1%甲醛生理鹽水滅活的金黃色葡萄球菌(6×108cfu/mL)200 μL混合,25 ℃水浴60 min(每10 min振蕩混勻1 次);隨后制作血涂片,用快速姬姆薩染色試劑盒(上海生工)進行染色,油鏡下觀察吞噬細(xì)胞,計數(shù)吞噬細(xì)胞中金黃色葡萄球菌,SPSS 22.0檢測顯著性。吞噬百分?jǐn)?shù)(PP)=(發(fā)生吞噬的吞噬細(xì)胞數(shù)/所觀察的吞噬細(xì)胞)×100%;吞噬指數(shù)(PI)=(巨噬細(xì)胞吞噬的金黃色葡萄球菌數(shù)/參與吞噬的吞噬細(xì)胞數(shù))×100%[19]。

1.2.8 體外模擬魚血清對熒光假單胞菌的免疫識別作用 紅鯽第3 次免疫LolB蛋白后7 d,尾靜脈取血。酶聯(lián)免疫吸附測定法[20](Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測魚血清與熒光假單胞菌的相互作用。步驟簡述如下:將熒光假單胞菌培養(yǎng)至OD600約1.0后將菌體離心并洗滌;生理鹽水調(diào)整OD600至1.0(菌濃度109cfu/mL),分裝菌體每管150 μL,再與不同稀釋倍數(shù)的血清(1∶100,1∶200,1∶400,1∶800, 1∶1 600,1∶3 200),對照為陰性血清,37 ℃條件下孵育90 min,再與1∶400的大鼠抗魚血清(實驗室自制)孵育90 min;最后與1∶3 000羊抗大鼠抗體孵育1 h。將洗滌好的菌體與20 μL PBS混合后加入酶標(biāo)板,再加入200 μL的TMB顯色液;再用50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),450 nm讀數(shù)。

1.2.9 實時熒光定量法檢測紅鯽炎癥因子 紅鯽第3 次免疫LolB蛋白后攻毒熒光假單胞菌, 3 d后取組織(腎、脾、鰓),液氮靜置30 min預(yù)冷,研磨至粉碎,TRIzol法提取總RNA,Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA,利用SYBR Green ProTaqHS試劑盒和實時熒光定量基因擴增儀(CFX96)進行熒光定量檢測,具體設(shè)置如下。預(yù)變性溫度95 ℃,30 s(初始1 個循環(huán));變性95 ℃,5 s,退火-延伸60 ℃,30 s(40 個循環(huán))。實時熒光定量基因擴增儀上查看炎癥因子IL-1β和TNF-α表達情況,SPSS 22.0分析顯著性。

1.2.10 組織病理學(xué)觀測 紅鯽第3 次免疫LolB蛋白后攻毒熒光假單胞菌,3 d后取組織(腎、脾、腸)。病理切片主要分為3 個步驟,即組織包埋、組織切片與H&E染色。組織包埋:將取出的組織立即浸泡在改良的Davidson’s[21]固定液中,固定18～24 h后轉(zhuǎn)入10%甲醛溶液中繼續(xù)固定;將固定好的組織于梯度濃度(80%,90%,95%,100%)的乙醇中脫水,放入二甲苯中透明;將透明好的組織于60 ℃的石蠟中浸泡,再將組織包埋于折疊好的模具中。切片:將包埋好的組織修正成約1 cm3的立方體,石蠟切片機切成厚度為4 μm的切片,將其附著于載玻片上,烘干。H&E染色:使用蘇木素與伊紅進行染色。首先將烘干的切片放入二甲苯中脫蠟;再于梯度濃度的乙醇中復(fù)水,復(fù)水結(jié)束后蘇木素染色30 s,使細(xì)胞核上色,伊紅染色20 min,使細(xì)胞質(zhì)著色。繼續(xù)于梯度濃度的乙醇中脫水,在二甲苯中透明,最后用中性樹脂封片,完成后置于37 ℃恒溫箱過夜,以備觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI上獲取不同菌種的外膜蛋白氨基酸序列,利用GeneDoc 3.2軟件繪制同源分析圖,對氨基酸序列進行BLAST比對,結(jié)果顯示,熒光假單胞菌的LolB蛋白序列作為母本,乳酸假單胞菌的LolB蛋白序列相似度達到94.63%,卡尼斯假單胞菌為94.63%,奧加拉假單胞菌為 87.32%,大腸桿菌為28%,嗜水氣單胞菌為 28.16%,副溶血弧菌為28.85%,奧奈達希瓦氏菌為26.24%,可見,假單胞菌蛋白質(zhì)序列相似度明顯高于其他菌(圖1);利用MEGA 5.0軟件繪制菌株進化樹,結(jié)果顯示假單胞菌屬間親緣關(guān)系較近(圖2)。結(jié)合同源分析圖、BLAST序列比對、菌種發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌外膜蛋白LolB可能對不同假單胞菌具有交叉免疫保護作用。

圖1 氨基酸同源性分析Fig.1 Amino acid homology analysis

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白的純化

PCR擴增獲得lolB基因,在600 bp左右處有單一且清晰的條帶(圖3-A),與NCBI公布的理論值相同;重組質(zhì)粒pET-32a-lolB經(jīng)過BamH Ι 與XhoΙ 雙酶切鑒定,在600 bp左右獲得條帶,與理論值相同(圖3-B),證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒經(jīng)E.coliBL21轉(zhuǎn)化,IPTG誘導(dǎo)后,利用包涵體洗滌與SDS-PAGE切膠法純化后在42 ku處獲得LolB蛋白(圖3-C)。

A.PCR擴增lolB基因; B.重組質(zhì)粒pET-32a-lolB的雙酶切; C.LolB蛋白的表達純化.M1.DNA Marker; M2.蛋白Marker; 1.lolB基因; 2.重組質(zhì)粒pET-32a-lolB; 3.BamHⅠ和XhoⅠ 雙酶切; 4.未誘導(dǎo)菌株; 5.誘導(dǎo)菌株; 6.純化的LolB蛋白

2.3 蛋白表達條件的優(yōu)化

設(shè)計L9(34)正交試驗?zāi)Ｐ?探索熒光假單胞菌外膜蛋白LolB的最佳誘導(dǎo)表達條件,每組條件3個重復(fù),結(jié)果顯示,不同誘導(dǎo)條件下蛋白質(zhì)的表達有差異(圖4),利用Phoretix 1D軟件進行光密度分析(表1),再利用SPSS 22.0軟件極差分析數(shù)據(jù),最終獲得最佳表達條件:A3B2C1D3(誘導(dǎo)溫度37 ℃,菌液濃度OD600=0.8,IPTG終濃度0.1 mmol/L,誘導(dǎo)時間12 h);顯著性分析顯示,誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間對蛋白表達影響顯著(表1)。

A,B,C為3 次重復(fù);M.蛋白質(zhì)Marker;1.未誘導(dǎo)菌株;2～4.誘導(dǎo)溫度為28 ℃,OD600分別為0.5,0.8,1.0; 5～7.誘導(dǎo)溫度30 ℃,OD600分別為0.5,0.8,1.0;8～10.誘導(dǎo)溫度為37 ℃,OD600分別為0.5,0.8,1.0; 2,7,9.IPTG濃度為0.1 mmol/L; 3,5,10.IPTG濃度為0.3 mmol/L;4,6,8.IPTG濃度為0.5 mmol/L; 2,6,10.誘導(dǎo)時間為3 h;3,7,8.誘導(dǎo)時間為8 h;4,5,9.誘導(dǎo)時間為12 h

2.4 紅鯽抗血清的特異性、效價檢測

紅鯽免疫LolB蛋白后,獲取血清進行特異性、效價檢測,Western blotting試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在22 ku處具有特異性條帶,且LolB抗血清的效價可達1∶200(圖5)。

M.蛋白質(zhì) Marker; 1.陰性對照; 2.血清稀釋倍數(shù)為 1∶100; 3.血清稀釋倍數(shù)為1∶200

2.5 紅鯽抗血清與熒光假單胞菌的免疫識別作用

ELISA試驗結(jié)果表明,LolB抗血清與熒光假單胞菌在體外具有相互識別作用,且抗體滴度在1∶3 200仍具有識別作用(圖6)。

圖6 紅鯽抗血清與熒光假單胞菌體外相互識別Fig.6 Mutual recognition between C.auratusserum and P.fluorescens in vitro

2.6 紅鯽免疫相關(guān)因子檢測

紅鯽免疫LolB蛋白后,獲取血清檢測免疫因子(AKP、ACP、LZM、IgM),結(jié)果顯示均呈上升趨勢(圖7),大多數(shù)達到顯著性(P<0.05),表明LolB蛋白激活了紅鯽的非特異性免疫。

*表示P<0.05; **表示P<0.01; NC表示對照組; 圖8,9同

2.7 紅鯽細(xì)胞吞噬作用

紅鯽免疫后獲取血漿,細(xì)胞吞噬作用結(jié)果(表2)顯示免疫后吞噬百分?jǐn)?shù)和吞噬指數(shù)呈上升趨勢,且吞噬百分?jǐn)?shù)達到極顯著升高(P<0.01)。

表2 紅鯽免疫血漿細(xì)胞吞噬作用Table 2 Phagocytosis of immune plasma cell in C.auratus

2.8 熒光假單胞菌攻毒紅鯽抗氧化因子檢測

紅鯽免疫LolB蛋白后攻毒熒光假單胞菌,獲取血清檢測抗氧化因子(CAT、SOD、MDA、GSH-Px),結(jié)果(圖8)顯示血清抗氧化指標(biāo)較對照組大部分呈降低趨勢,表明免疫LolB蛋白對熒光假單胞菌感染具有一定的抗氧化保護作用。

圖8 熒光假單胞菌攻毒紅鯽后血清抗氧化因子指標(biāo)檢測Fig.8 Detection of serum antioxidant factor in C.auratu after challenge with P.fluorescens

2.9 熒光假單胞菌攻毒紅鯽炎癥因子檢測

紅鯽免疫LolB蛋白后攻毒熒光假單胞菌, 3 d后取組織(腎、脾、鰓),采用熒光定量PCR法進行檢測,結(jié)果顯示炎癥因子均呈下降趨勢,脾臟的IL-1β下降趨勢達到顯著性,腎臟的TNF-α下降趨勢達到極顯著性(圖9)。

圖9 熒光假單胞菌攻毒紅鯽后炎癥因子檢測Fig.9 Detection of inflammatory factor after invasion of C.auratu by P.fluorescens

2.10 熒光假單胞菌攻毒紅鯽病理切片觀測

紅鯽免疫LolB蛋白后攻毒熒光假單胞菌, 3 d后取組織(腎、脾、腸)進行病理學(xué)切片;對照組腎臟結(jié)構(gòu)不完整,腎小球退化、組織間隙增大;脾臟細(xì)胞密度減少、細(xì)胞核損傷、細(xì)胞凋亡;腸道結(jié)構(gòu)松散、細(xì)胞游離、細(xì)胞邊界界限不規(guī)則。紅鯽免疫LolB蛋白后攻毒熒光假單胞菌組織形態(tài)較為完好(圖10)。

3 討 論

熒光假單胞菌是魚類養(yǎng)殖的主要病原菌之一,生物信息分析發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌外膜蛋白LolB在假單胞菌屬間同源性較高,進化樹圖譜也發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬間親緣關(guān)系較近。史姿聰?shù)萚22]生物信息預(yù)測鴨源雞桿菌tolC基因多菌種間同源性較高,最后發(fā)現(xiàn)鴨源雞桿菌TolC蛋白是具有交叉免疫保護性的抗原;康超等[23]生物信息學(xué)分析嗜水氣單胞菌外膜蛋白AH6169,發(fā)現(xiàn)AH6169在氣單胞菌間有較高同源性,最后得出AH6169可為不同種類的氣單胞菌提供交叉免疫保護作用的結(jié)論。因此LolB蛋白也可能對不同假單胞菌有交叉保護作用。

分子克隆技術(shù)是獲取重組蛋白的一種常見方法。伍娜娜等[24]利用分子克隆成功構(gòu)建重組菌株獲取大腸桿菌外膜蛋白OmpF。趙亮等[25]利用原核表達系統(tǒng)構(gòu)建大腸桿菌重組菌株,獲取馬鈴薯V病毒外殼蛋白。筆者也采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建熒光假單胞菌外膜蛋白LolB的重組表達菌株,通過SDS-PAGE電泳檢測重組外膜蛋白的誘導(dǎo)表達情況,采用包涵體洗滌和SDS-PAGE電泳切膠法純化獲得純度較高的重組蛋白。本文通過分子克隆成功構(gòu)建pET-32a-lolB重組菌株,發(fā)現(xiàn)最佳誘導(dǎo)表達條件為:OD600=0.8,IPTG=0.1 mmol/L,溫度為37 ℃培養(yǎng)12 h,為LolB蛋白的批量獲取奠定基礎(chǔ)。

多克隆抗體制備常采用動物免疫法,因其具有操作簡便和制備周期短的優(yōu)點而被廣泛使用。劉望等[26]用嗜水氣單胞菌外膜融合蛋白免疫斑馬魚,成功制備魚抗血清;Khushiramani等[27]純化Omp48蛋白并免疫兔子,成功獲得兔抗血清。本文也采用動物免疫法制備多克隆抗體,通過對紅鯽免疫LolB蛋白,成功制備紅鯽LolB抗血清,可為后續(xù)免疫學(xué)試驗奠定基礎(chǔ)。

魚體的非特異性免疫應(yīng)答可防御外界入侵[28-29],魚類血液是機體進行免疫反應(yīng)的重要場所,血清相關(guān)指標(biāo)的檢測可間接解釋不同免疫原對魚體的影響情況[30]。趙林輝等[31]對鯉魚免疫OmpA、FlaA重組蛋白,發(fā)現(xiàn)血清中AKP、IgM等指標(biāo)上升;馬少鴻[32]對魚體免疫flgE蛋白,發(fā)現(xiàn)血清中l(wèi)ZM、IgM等指標(biāo)上升,說明激活了魚體的非特異免疫。本文對紅鯽抗血清進行免疫因子檢測,發(fā)現(xiàn)免疫組均高于對照組,且AKP、LZM、IgM達到顯著水平。江葉舟等[33]對鼠類過表達miR-223進行研究,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞吞噬是機體非特異性免疫的重要指標(biāo);趙娜等[34]對牙鲆進行海豚鏈球菌胞外產(chǎn)物免疫后,其吞噬指標(biāo)上升。本文也發(fā)現(xiàn)紅鯽免疫LolB蛋白組相較未免疫蛋白組,其吞噬百分比和吞噬指數(shù)均存在上升趨勢,且吞噬百分?jǐn)?shù)達到極顯著水平。孫薇等[35]利用 Western blotting 發(fā)現(xiàn)免疫外膜蛋白的動物血清和熒光假單胞菌具有特異性結(jié)合;榮娜等[13]利用Western blotting和ELISA對P5魚抗血清進行評價,顯示P5抗血清可與嗜水氣單胞菌特異性結(jié)合,ELISA顯示P5抗血清與嗜水氣單胞菌存在識別作用。本文也對紅鯽LolB抗血清與熒光假單胞菌全蛋白進行Western blotting,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LolB抗血清與熒光假單胞菌全蛋白特異性結(jié)合,效價比達到 1∶200。紅鯽LolB抗血清與熒光假單胞菌進行ELISA模擬體外相互識別,結(jié)果識別滴度達1∶3200。免疫因子、吞噬指數(shù)和吞噬百分?jǐn)?shù)的上調(diào)確定LolB蛋白具有增強機體免疫力的效果,Western blotting確定紅鯽LolB抗血清和熒光假單胞菌可以特異性結(jié)合,結(jié)合ELISA試驗確定紅鯽LolB抗血清和熒光假單胞菌可以相互識別,表明魚體的非特異免疫已被激活。

蛋白保護原對動物感染致病菌的保護效果可以通過抗氧化因子、炎癥因子以及病理學(xué)切片來綜合評價?？寡趸蜃邮寝D(zhuǎn)化機體自由基的一類抗氧化關(guān)鍵酶,其代謝水平可以間接反應(yīng)機體損傷程度,Liu等[36]對小鼠免疫大腸桿菌外膜蛋白OmpA后對后攻毒大腸桿菌,發(fā)現(xiàn)小鼠MDA、SOD等因子下調(diào),減輕大腸桿菌對小鼠肝臟和腎臟的損傷;劉嬌等[37]對鴨糧添加葡萄糖氧化酶后攻毒大腸桿菌,發(fā)現(xiàn)MDA、DAO活性和D-LA含量呈下降趨勢,減少了細(xì)菌內(nèi)毒素的產(chǎn)生。本文對攻毒紅鯽血清中進行檢測,抗氧化因子多數(shù)呈降低趨勢,其中MDA、GSH-Px達到極顯著水平。炎癥因子是機體炎癥反應(yīng)中出現(xiàn)的一類炎癥介質(zhì),黃瑞玲等[38]對白羽雞人工感染禽腺病毒血清4型,IL-1β等因子呈上升趨勢,攻毒會促進外周血炎癥因子的釋放,炎癥因子水平的高低可反應(yīng)機體炎癥的嚴(yán)重程度;楊光等[39]通過蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)顷P(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷的研究,發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ可降低炎癥因子IL-1β、TNF-α等水平,得出蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ降低氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)從而緩解OA模型大鼠軟骨損傷的結(jié)論。本文對紅鯽攻毒組織采用實時熒光定量PCR法進行檢測,發(fā)現(xiàn)魚體試驗組中的IL-1β、TNF-α表達量均低于對照組,表明蛋白保護原對感染熒光假單胞菌起到降低炎癥的效果。研究人員普遍認(rèn)為組織病理學(xué)切片可區(qū)分出患病和正常的組織細(xì)胞[40],蘭蕾等[41]對艾煙染毒后大鼠的心、肝、脾、肺等臟器組織進行組織病理學(xué)切片觀察,發(fā)現(xiàn)染毒后均有損傷;王振軍等[42]建立貂細(xì)小病毒病動物模型,通過組織病理學(xué)切片發(fā)現(xiàn)感染致病菌后貂的內(nèi)臟有損傷。本文通過組織病理學(xué)切片觀測到,與對照組相比,蛋白免疫組攻毒后細(xì)胞形態(tài)較為完好,表明免疫LolB蛋白對感染熒光假單胞菌具有一定的保護功能。

綜上所述,本文通過分子克隆構(gòu)建重組菌株獲取LolB蛋白,正交試驗探索蛋白表達優(yōu)化條件。紅鯽免疫LolB蛋白制備多克隆抗體,通過免疫因子和吞噬活性發(fā)現(xiàn)LolB蛋白可以激活紅鯽的非特異性免疫,通過Western blotting和體外模擬識別發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌可以與LolB抗血清特異性識別與結(jié)合,通過切片和炎癥因子發(fā)現(xiàn)其對魚體有保護臟器和降低炎癥的效果,故LolB蛋白對感染熒光假單胞菌有一定的保護作用,有作為防治水產(chǎn)病害疫苗的潛力。