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        四種致瀉性大腸桿菌多重PCR檢測方法的建立及在大熊貓上的應用

        2023-10-17 12:29:52王路才蘇小艷張煥容劉頌蕊李明喜
        四川畜牧獸醫(yī) 2023年9期
        關(guān)鍵詞:標準優(yōu)化檢測

        王路才,蘇小艷,張煥容,劉頌蕊,燕 霞,楊 梅,李明喜*

        (1.成都大熊貓繁育研究基地,四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室,四川 成都 610081;2.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院,四川 成都 610041)

        大腸桿菌(E.coli)屬革蘭氏陰性短桿菌,為條件致病菌,在自然條件下普遍存在,僅有致病性大腸桿菌具有致病性,可引起人和動物發(fā)生以腹瀉癥狀為主的疾病。根據(jù)不同的生物學特性,將致病性大腸桿菌分為5 類:腸道致病性大腸桿菌(EPEC)、腸道侵襲性大腸桿菌(EIEC)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)、腸道集聚性大腸桿菌(EAEC)和腸道出血性大腸桿菌(EHEC)[1]。

        自1983年起,陸續(xù)有大熊貓感染致瀉性大腸桿菌的報道,嚴重者甚至導致死亡[2-3]。多重PCR檢測在轉(zhuǎn)基因鑒定、食品檢測、病原體檢測、腫瘤診斷等領(lǐng)域已成功運用[4-8],具有快速、靈敏、準確等優(yōu)點。本研究擬針對escV、stx1、stx2 和bfpB 毒力基因建立檢測EPEC 和EHEC 的多重PCR 體系,針對lt、sth、astA、aggR 和pic毒力基因建立檢測ETEC 和EAEC 的多重PCR 體系,為大熊貓腸道腹瀉性疾病提供及時、可靠的診斷結(jié)果,指導臨床用藥。

        1 材料與方法

        1.1 菌株 ETEC(CICC10667)、EAEC(CICC24186)、EHEC(CICC24187)、EPEC(CICC24189)均為標準菌株,購自CICC 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司和中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922、肺炎克雷伯菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、綠膿桿菌、糞腸球菌、鮑曼不動桿菌、盲腸腸球菌、巴氏鏈球菌、摩氏摩根菌,均由四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室保存。

        1.2 主要試劑和儀器 細菌基因組DNA 提取試劑盒,2×Taq PCR MasterMix,核酸染料;PCR 儀,核酸電泳儀,凝膠成像系統(tǒng)。

        1.3 引物的設(shè)計與合成 按食品安全國家標準(大腸桿菌GB 4789.6-2016)中EPEC 和EHEC 的escV、stx1、stx2、bfpB 基因序列設(shè)計引物,根據(jù)ETEC 和EAEC 的lt、sth、astA、aggR、pic基因序列設(shè)計引物,引物序列送至生工生物(上海)股份有限公司合成。

        1.4 細菌DNA的提取 將保存的EPEC、EHEC、ETEC、EAEC 標準菌株分別接種于LB 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜后,取菌懸液1 mL,按照DNA 提取試劑盒說明書提取DNA。根據(jù)公式計算相應拷貝數(shù)。

        1.5 單一PCR擴增及反應條件優(yōu)化 單一PCR反應體系為25 μL,對單一PCR的引物添加量和退火溫度進行優(yōu)化,引物濃度設(shè)為10 μmol/L,引物添加量優(yōu)化范圍為0.1~2.0 μL,退火溫度優(yōu)化范圍為54~64 ℃。優(yōu)化結(jié)束后,選取最優(yōu)反應條件進行單一PCR 擴增,PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測,并將其余產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定。

        1.6 多重PCR 擴增及反應條件優(yōu)化 在單一PCR的基礎(chǔ)上,對多重PCR方法進行引物和退火溫度優(yōu)化。EPEC 和EHEC 多重PCR 反應中,引物添加量優(yōu)化為0.1~2.0 μL,退火溫度優(yōu)化為57~65 ℃。ETEC 和EAEC 多重PCR 反應中,引物添加量優(yōu)化為0.1~2.0 μL,退火溫度優(yōu)化為55~63 ℃。

        1.7 多重PCR 特異性試驗 分別以EPEC 標準菌株、EHEC 標準菌株、ETEC 標準菌株、EAEC 標準菌株、金黃色葡萄球菌標準菌株、大熊貓源肺炎克雷伯菌、大熊貓源多殺性巴氏桿菌、大熊貓源奇異變形桿菌、大熊貓源綠膿桿菌、大熊貓源糞腸球菌、大熊貓源鮑曼不動桿菌、大熊貓源盲腸腸球菌、大熊貓源巴氏鏈球菌、大熊貓源摩氏摩根菌的DNA為模板進行多重PCR擴增,評估所建立的多重PCR方法的特異性。

        1.8 多重PCR 敏感性試驗 提取EPEC 標準菌株、EHEC 標準菌株、ETEC 標準菌株、EAEC 標準菌株的DNA后,將DNA濃度調(diào)整為200 ng/mL,再用滅菌ddH2O 進行10 倍系列稀釋成6 個梯度濃度,將每組各個稀釋度等比例混合,按照1.6建立的多重PCR方法擴增,檢測多重PCR方法的敏感性。將4 種致瀉性大腸桿菌菌液進行10 倍系列稀釋成6 個梯度濃度,將每組各個稀釋度等比例混合,檢測多重PCR方法對菌液的敏感性。

        1.9 多重PCR重復性試驗 利用優(yōu)化后的多重PCR 方法以相同的條件進行重復性試驗,重復8次,每次間隔一周。以此驗證本次建立的多重PCR方法的重復性和穩(wěn)定性。

        1.10 多重PCR 對人工模擬糞便污染樣品的檢測 EPEC標準菌株、EHEC標準菌株、ETEC標準菌株、EAEC 標準菌株過夜培養(yǎng)后調(diào)整濃度為2.0×101CFU/mL,取1 mL 混合菌液加入0.1 g 健康大熊貓糞便中進行糞便污染樣本模擬,并設(shè)為試驗組,設(shè)置生理鹽水(替換菌液)為陰性對照組。提取糞便樣本DNA,用所建立的多重PCR方法和單一PCR 方法對10 份人工模擬糞便污染樣品進行檢測,比較兩種方法的檢測結(jié)果,并計算兩者的符合率。

        1.11 多重PCR對臨床腹瀉糞便樣本的檢測 采集大熊貓的腹瀉糞便樣本,增菌培養(yǎng)后提取DNA,進行大腸桿菌通用毒力基因phoA 檢測,再將檢測為陽性的DNA 模板作為多重PCR 的模板進行致病型鑒定檢測。采用本試驗建立的多重PCR方法和標準單一PCR方法對110份臨床大熊貓糞便樣品進行檢測,比較兩種方法的檢測結(jié)果,并計算兩者的符合率。

        2 結(jié)果

        2.1 單一PCR 方法的建立 經(jīng)過引物濃度、退火溫度等條件摸索,ETEC、EAEC、EHEC 和EPEC四種菌單一PCR 的最佳擴增體系和反應條件見表1。

        表1 單一PCR最佳反應體系及條件

        2.2 多重PCR擴增及反應條件優(yōu)化結(jié)果 經(jīng)過引物濃度、退火溫度等條件摸索,結(jié)果得出EPEC和EHEC 多重PCR 反應的最佳體系為:2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,DNA模板量均為2.0 μL,escV、stx1、stx2 引物(10 μmol/L)量各0.2 μL,bfpB為0.4 μL,滅菌ddH2O 為8.5 μL;最佳退火溫度為61 ℃45 s(表2 和圖1A)。ETEC 和EAEC 多重PCR 反應的最佳體系為:2×Taq PCR MasterMix12.5 μL,escV、stx1、stx2 引物(10 μmol/L)量各0.2 μL,bfpB為0.4 μL,DNA模板量均為2.0 μL,滅菌ddH2O 為8.5 μL;最佳退火溫度為59 ℃ 30 s(表3和圖1B)。

        表2 EPEC和EHEC多重PCR反應條件

        表3 ETEC和EAEC多重PCR反應條件

        2.3 特異性試驗結(jié)果 多重PCR 方法特異性檢測結(jié)果顯示,EPEC 和EHEC 多重PCR 僅在escV(544bp)、stx1(244bp)、stx2(324bp)和bfpB(910bp)基因擴增為陽性;ETEC和EAEC多重PCR僅在astA(102 bp)、sth(171 bp)、lt(655 bp)、aggR(400 bp)和pic(1 111 bp)基因擴增為陽性。兩組多重PCR對肺炎克雷伯菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、綠膿桿菌、糞腸球菌、鮑曼不動桿菌、盲腸腸球菌、巴氏鏈球菌、摩氏摩根菌均未觀察到擴增條帶,表明該方法的特異性較強。

        2.4 敏感性試驗結(jié)果 在本試驗建立的多重PCR 方法中,EHEC 和EPEC 的最低DNA 檢測限為2.71×104拷貝/μL(圖2A),EAEC 的最低DNA檢測限為3.23×104拷貝/μL,ETEC 的最低檢測限為3.23×103拷貝/μL(圖2B)。菌液檢測中,EPEC和EHEC的最低檢測限為1.85×104CFU/mL,ETEC的最低檢測限為2.9×103CFU/mL,EAEC 的最低檢測限為2.62×104CFU/mL。以上結(jié)果表明該方法具有較高的敏感性。

        2.5 重復性試驗結(jié)果 將提取的細菌基因組DNA利用建立好的EHEC和EPEC多重PCR方法與ETEC 和EAEC 多重PCR 方法在不同時間進行8次重復擴增。結(jié)果表明每次多重PCR結(jié)果都能擴增出相應的目的片段,說明該方法的穩(wěn)定性、重復性好。

        2.6 人工模擬糞便污染樣品的檢測結(jié)果 采用本試驗建立的兩組多重PCR分別檢測,結(jié)果都能擴增出相應的目的條帶,說明該方法對人工模擬糞便污染樣品的檢測結(jié)果較為準確。

        2.7 臨床腹瀉糞便樣品的檢測結(jié)果 臨床樣品檢測結(jié)果顯示,均檢出phoA 陽性(圖3),將phoA陽性菌株分別用EHEC 和EPEC 多重PCR 方法、ETEC 和EAEC 多重PCR 方法進行4 種致 瀉性 大腸桿菌的檢測,結(jié)果檢出2 個樣品的escV 基因呈陽性,目的條帶為544 bp,其余擴增結(jié)果均為陰性(圖4A)。通過標準單一PCR 進行驗證,確證escV 基因在544 bp 處擴增出條帶(圖4B),且通過測序再次驗證了結(jié)果。本試驗建立的多重PCR 與標準單一PCR 的陽性符合率為100%,表明兩組多重PCR 方法均可用于臨床樣品的檢測。

        圖3 部分臨床糞便樣本phoA基因擴增結(jié)果

        圖4 臨床糞便樣品的多重PCR(A)和單一PCR(B)擴增結(jié)果

        3 討論

        大腸桿菌作為一種常見的條件致病菌,在大熊貓臨床糞便樣本中普遍存在。EPEC、EHEC、ETEC 和EAEC 可引起大熊貓以腹瀉癥狀為主的腸道疾?。?]。本研究建立了這4種不同致病性病原的多重PCR檢測體系,結(jié)果證明該檢測體系具有操作簡單、快速、靈敏、準確等優(yōu)點。

        多重PCR 在擴增中的特異性和敏感性受到多方面因素的影響,本研究選用9 對毒力基因分別建立了2 組多重PCR,這9 對毒力靶標基因的分子質(zhì)量大小范圍不等,可以使目的片段分布在Marker 不同標尺大小的區(qū)域,不易造成對目的片段的誤判。對于多重PCR 反應結(jié)果影響最大的因素是反應體系的退火溫度和引物量。通過引物添加量的優(yōu)化,可以避免引物問題導致錯配和非特異性擴增[10]。Taq酶的添加量過低會造成產(chǎn)量降低,過高會導致非特異性擴增[11]。退火溫度的優(yōu)化可以提高PCR 擴增效率,在合適的范圍內(nèi),較高的退火溫度的特異性較強[12]。延伸時間在多重PCR里與酶的含量有一定的關(guān)系,在合適范圍內(nèi)增加延伸時間可以增加產(chǎn)物的量。故本試驗對退火溫度、引物添加量、酶添加量和延伸時間進行了反復多次優(yōu)化,成功建立了2 組多重PCR體系,可以有效地檢測出樣本中的病原菌。張鐵男等[13]的研究結(jié)果顯示,ETEC 的檢測下限為2.6×104CFU/mL,本試驗方法的檢測下限為2.9×103CFU/mL,相比之下用本試驗建立的方法檢測ETEC更為敏感。

        4 結(jié)論

        本研究建立的2組多重PCR檢測方法具有良好的特異性、靈敏性和重復性,在臨床樣本檢測中提高了檢出效率,為大熊貓種群4 種致瀉性大腸桿菌感染的快速診斷及流行病學調(diào)查提供了技術(shù)支撐。

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