王光堯， 李鳳東

（1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院胃腸外科，常州 213000； 2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，常州 213000）

胃癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2018 年全球新發(fā)癌癥病例1 810 萬(wàn)例，其中胃癌占比8.2%，我國(guó)新發(fā)45.6 萬(wàn)例，死亡39.0 萬(wàn)例[1]?；诟涡允中g(shù)的多學(xué)科治療成為胃癌的首選治療手段，尤其對(duì)于早期患者來(lái)說(shuō)，是目前可能治愈的有效手段，但術(shù)后仍存在較高的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移概率，5 年累積存活率僅為30%～50%[2]，因此，早期評(píng)估胃癌根治術(shù)后預(yù)后具有重要意義。研究[3]表明，腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中存在多種非編碼基因和編碼基因異常表達(dá)，微小RNA（microRNA，miR）是一種非編碼小分子RNA，因其具有促癌或抑癌作用而被廣泛關(guān)注。近年來(lái)，有研究[4-5]顯示，miR-144、miR-203 在多種實(shí)體腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、耐藥等行為。也有研究[6-7]報(bào)道，胃癌組織中miR-144、miR-203 表達(dá)明顯下調(diào)，可作為胃癌診斷和預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)記物。但血清miR-144、miR-203 是否可預(yù)測(cè)胃癌根治術(shù)后預(yù)后有待研究，本研究旨在分析血清miR-144、miR-203水平對(duì)胃癌根治術(shù)后預(yù)后的評(píng)估價(jià)值，以期為臨床早期評(píng)估患者預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院（2015 年1 月至2017 年12 月）收治的113 例接受胃癌根治術(shù)治療的胃癌患者為胃癌組，其中男性74 例，女性39 例；年齡34～76 歲，平均年齡（50.02±8.61）歲；腫瘤直徑：53 例≥5 cm，60例＜5 cm；TNM 分期[8]：32 例Ⅰ期，38 例Ⅱ期，43 例Ⅲ期；分化程度：21 例低分化，33 例中分化，59 例高分化；52 例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）經(jīng)術(shù)后病理確診；2）TNM 分期為Ⅰ～Ⅲ期，具備胃癌根治術(shù)治療指征[9]；3）患者及家屬均知情；4）臨床資料完整，可接受隨訪者；5）初次確診，未接受任何抗腫瘤治療者；6）年齡＜80 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并其他部位腫瘤者；2）既往惡性腫瘤病史者；3）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；4）心、肝、腎功能嚴(yán)重受損者。另選取同期66 例接受內(nèi)鏡下切除治療的胃息肉患者為對(duì)照組，其中男性43 例，女性23 例；年齡38～74歲，平均年齡（51.28±8.55）歲。兩組性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。本研究經(jīng)常州第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（2021倫字128 號(hào)）。

1.2 方法

采集兩組患者入院當(dāng)日靜脈血，3 000 r·min-1離心10 min，半徑10 cm，取上清液置于-80 ℃低溫冰箱中保存，Total RNA 提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司；貨號(hào)：RN0401）提取血清總RNA，取5 μL 總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，Qiagen 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海易匯生物科技有限公司；貨號(hào)：206143）合成cDNA，加入上下游引物0.8 μL。miR-144 上游引物：5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’，下游引物：5’- TGCTTATACAGTATA GATG-3’；miR-203 上游引物：5’-TCCGATGATCACCAGGAT-3’，下游引物：5’-GTGCAG GGTGCAAGGTAGC-3’；以U6 做內(nèi)參校正，上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3’；上游引物：5’-TCTCGCTTCGGCAGCACA-3’。下游引物：5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測(cè)定，反應(yīng)條件95 ℃、30 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、45 s，循環(huán)40 次，2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-144、miR-203 相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 預(yù)后評(píng)估

所有胃癌患者均接受胃癌根治術(shù)治療，其中48 例全胃切除術(shù)，65 例遠(yuǎn)端胃癌根治切除術(shù)，術(shù)后根據(jù)SOX 或FOLFOX 方案輔助化療。隨訪3年，截至2020 年12 月，統(tǒng)計(jì)3 年累積存活率，定義為手術(shù)至隨訪截止或死亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；Kaplan-Meier曲線繪制存活率，組間存活率Log-rank 檢驗(yàn)；多因素Cox 回歸分析胃癌根治術(shù)預(yù)后不良影響因素；ROC 曲線判斷血清miR-144、miR-203 水平對(duì)胃癌根治術(shù)預(yù)后不良的評(píng)估價(jià)值，曲線下面積（area under curve，AUC）采用Z 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血清miR-144、miR-203 水平比較

胃癌組血清miR-144、miR-203 水平分別為（0.221±0.070）、（0.343±0.063），對(duì)照組分別為（0.964±0.168）、（1.027±0.179），胃癌組血清miR-144、miR-203 水平低于對(duì)照組（t=-41.315、-36.941，P均＜0.001）。

2.2 不同臨床特征miR-144、miR-203 表達(dá)水平

不同性別、年齡、腫瘤直徑胃癌患者血清miR-144、miR-203 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），與TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同臨床特征miR-144、miR-203 表達(dá)水平（±s）

表1 不同臨床特征miR-144、miR-203 表達(dá)水平（±s）

臨床特征nmiR-144t 值P 值miR-203t 值P 值性別男性740.214±0.066-1.4420.1520.342±0.064-0.3920.696女性390.234±0.0770.356±0.063年齡≥60 歲630.214±0.070-1.1270.2620.342±0.066-0.2110.833＜60 歲500.229±0.0710.345±0.060腫瘤直徑≥5 cm530.208±0.066-1.8650.0650.332±0.067-1.7410.084＜5 cm600.233±0.0720.353±0.058 TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期700.236±0.0653.4070.0010.358±0.0623.743＜0.001Ⅲ期430.190±0.0710.313±0.060分化程度高分化590.234±0.0732.0340.0440.356±0.0592.3440.021中低分化540.207±0.0650.329±0.065淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有520.199±0.065-3.2680.0010.319±0.061-3.916＜0.001無(wú)610.240±0.0690.363±0.058

2.3 血清miR-144、miR-203 水平與胃癌根治術(shù)后3 年累積存活率的關(guān)系

隨訪5～36（24.55±7.24）個(gè)月，死亡29 例，3年累積存活率為74.34%（84/113）。根據(jù)血清miR-144、miR-203 水平均值分為高、低水平組。高血清miR-144 水平組（≥0.221，n=55）死亡9例，3 年累積存活率為83.64%（46/55）；低血清miR-144 水平組（＜0.221，n=58）死亡20 例，3 年累積存活率為65.52%（38/58）。高血清miR-203水平組（≥0.343，n=56）死亡7 例，3 年累積存活率為87.50%（49/56）；低血清miR-203 水平組（＜0.343，n=57） 死亡22 例，3 年累積存活率為61.40%（35/57）。Kaplan-Meier 生存曲線顯示，高血清miR-144、miR-203 水平組胃癌根治術(shù)后3年累積存活率高于低水平組（Log-rank χ2=7.795、10.083，P=0.005、0.001），見(jiàn)圖1。

圖1 不同血清miR-144、miR-203 水平與胃癌根治術(shù)后3 年累積存活率曲線

2.4 胃癌根治術(shù)預(yù)后不良影響因素的Cox 回歸分析

以性別（男性=1，女性=0）、年齡（≥60 歲=1，＜60 歲=0）、TNM 分期（Ⅲ期=1，Ⅱ期=0）、分化程度（高分化=1，中低分化=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有=1，無(wú)=0）、miR-144、miR-203 為自變量，生存時(shí)間為時(shí)間變量，預(yù)后情況（死亡=1，存活=0）為因變量，建立多因素Cox 回歸模型，選擇Enter 法篩選自變量。結(jié)果顯示，TNM 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為胃癌根治術(shù)預(yù)后不良獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，高miR-144、miR-203 為獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05），見(jiàn)表2、表3。

表2 胃癌根治術(shù)預(yù)后不良影響因素的單因素Cox 回歸分析

表3 胃癌根治術(shù)預(yù)后不良影響因素的多因素Cox 回歸分析

2.5 血清miR-144、miR-203 水平對(duì)胃癌根治術(shù)預(yù)后不良的評(píng)估價(jià)值

ROC 曲線結(jié)果顯示，miR-144+miR-203 評(píng)估胃癌根治術(shù)預(yù)后不良的AUC 大于miR-144、miR-203 評(píng)估（Z=2.628、2.435，P=0.009、0.015），見(jiàn)表4、圖2。

圖2 血清miR-144、miR-203 水平評(píng)估胃癌根治術(shù)預(yù)后不良的ROC 曲線

表4 血清miR-144、miR-203 水平對(duì)胃癌根治術(shù)預(yù)后不良的評(píng)估價(jià)值

3 討論

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)生率居全球首位[1]，盡管其根治性手術(shù)的多學(xué)科治療已取得了極大進(jìn)展，可根據(jù)患者的一般情況、體能狀態(tài)、病理特征等選擇化療方案，但胃癌具有高度異質(zhì)性，容易產(chǎn)生多藥耐藥性，導(dǎo)致復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重降低了患者的預(yù)后存活率。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)可早期預(yù)測(cè)胃癌根治術(shù)不良預(yù)后的臨床標(biāo)記物。癌癥的發(fā)生發(fā)展是多因素、多機(jī)制、多基因共同參與的復(fù)雜過(guò)程。在人類基因組中，約98%的基因序列被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA，無(wú)須翻譯為蛋白，在RNA 水平就可行使各自的生物學(xué)功能。miRNA 是一類內(nèi)源性非編碼長(zhǎng)19～25 個(gè)核苷酸的小RNA，高度保守，可通過(guò)結(jié)合靶基因調(diào)節(jié)基因表達(dá)，降解mRNA 或阻礙其翻譯，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)[10]。研究表明，miRNA多位于腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)或基因區(qū)域，可通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生物學(xué)行為，影響腫瘤發(fā)展和易感性[11]。

miR-144 為紅細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中特異性高表達(dá)的miRNA 分子之一，參與紅細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，因此，既往多用于分析紅細(xì)胞潛能，近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，miR-144 還參與了多種惡性腫瘤進(jìn)展，多呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)[12-13]。Cheng 等[12]研究顯示，結(jié)直腸癌中miR-144 表達(dá)明顯減少，高表達(dá)miR-144 可通過(guò)調(diào)節(jié)白血病前轉(zhuǎn)錄因子3 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和入侵。Tao 等[13]研究顯示，宮頸癌中miR-144 表達(dá)明顯下調(diào)，高表達(dá)miR-144 可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C 抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，胃癌患者血清miR-144 水平明顯低于對(duì)照組，與TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，符合miR-144 在胃癌組織中的表達(dá)情況[6]，并提示低血清miR-144 水平參與了胃癌TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移變化，但其與胃癌根治術(shù)不良預(yù)后的關(guān)系尚不明確。本研究進(jìn)一步分析顯示，高血清miR-144 水平3 年累積存活率明顯提升，為預(yù)后不良獨(dú)立保護(hù)因素，說(shuō)明miR-144 可能成為評(píng)估預(yù)后的生物標(biāo)記物。關(guān)于miR-144 在胃癌中的抑癌機(jī)制尚不明確，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖高度依賴糖酵解獲取能量，譚業(yè)儒等[14]將miR-144 模擬物轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定表明，miR-144 可通過(guò)靶向抑制糖酵解和凋亡調(diào)控子抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡、自噬。激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白4 具有促進(jìn)胃癌遷移和侵襲的作用，Mushtaq 等[15]將miR-144 模擬物轉(zhuǎn)染至HGC-27 細(xì)胞，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定表明，miR-144 能結(jié)合其3’非翻譯區(qū)抑制激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白4 表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌遷移和侵襲能力。上述研究表明，miR-144 可靶向抑制糖酵解和凋亡調(diào)控子激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白4，抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和促進(jìn)凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用。

miR-203 基因位于人染色體14q32.33，目前發(fā)現(xiàn)的12%的miRNA 基因位于14 號(hào)染色體，其中miRNA 密度較高，而該區(qū)域又是染色體不穩(wěn)定的脆性區(qū)域，因此，容易出現(xiàn)雜合性丟失，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[16]。由于惡性腫瘤組織起源、所處微環(huán)境、發(fā)生發(fā)展信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不同，所參與的基因也存在差異，miR-203 就是一種在不同腫瘤中表達(dá)矛盾的miRNA。王媛等[17]研究顯示，子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-203 表達(dá)顯著提升，與組織學(xué)類型和生存時(shí)間相關(guān)；Huang 等[18]研究顯示，非小細(xì)胞肺癌中miR-203 表達(dá)明顯下調(diào)，可通過(guò)抑制SMAD3抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移和入侵，說(shuō)明miR-203 在不同惡性腫瘤中具有癌基因或抑癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，胃癌患者血清miR-203水平明顯低于對(duì)照組，與TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-203 在胃癌中具有抑癌基因作用，符合既往研究報(bào)道[7]。進(jìn)一步分析顯示，高血清miR-203 水平3 年累積存活率明顯提升，為預(yù)后不良獨(dú)立保護(hù)因素，說(shuō)明血清miR-203 可能成為評(píng)估預(yù)后的生物標(biāo)記物。膜聯(lián)蛋白A4 為多基因家族鈣調(diào)節(jié)磷脂結(jié)合蛋白，能促進(jìn)上皮向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤組織侵襲和轉(zhuǎn)移，參與胃癌發(fā)生發(fā)展[19]。Li 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織和細(xì)胞系中miR-203 表達(dá)降低與膜聯(lián)蛋白A4 升高有關(guān)，生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)膜聯(lián)蛋白A4 為miR-203 潛在靶基因，進(jìn)一步熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定證實(shí)二者關(guān)系，miR-203 模擬物轉(zhuǎn)染表明miR-203 可靶向抑制膜聯(lián)蛋白A4 抑制胃癌細(xì)胞增殖和上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌作用。ROC 曲線顯示，血清miR-144、miR-203 水平均對(duì)胃癌根治術(shù)不良預(yù)后具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，AUC 均＞0.80，且聯(lián)合評(píng)估AUC 明顯提升，說(shuō)明聯(lián)合檢測(cè)血清miR-144、miR-203 水平能更好地評(píng)估胃癌根治術(shù)的不良預(yù)后，指導(dǎo)為患者制訂方案。

綜上所述，胃癌患者血清miR-144、miR-203水平明顯下調(diào)，為胃癌根治術(shù)不良預(yù)后獨(dú)立保護(hù)因素，聯(lián)合檢測(cè)可提升不良預(yù)后評(píng)估價(jià)值。本研究局限性在于為單中心研究，同時(shí)胃癌根治術(shù)患者預(yù)后影響因素較多，未全部納入分析，此外，有關(guān)miR-144、miR-203 在胃癌根治術(shù)中不良預(yù)后的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。