石璐璐， 田雪敏， 董 輝， 楊彩虹

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心腦血管病醫(yī)院，銀川 750004）

子宮內(nèi)膜癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一[1]，其發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，且容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2-3]，對女性的健康和生命構(gòu)成了極大的威脅。以往研究[4]表明，子宮內(nèi)膜癌好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性，隨著生活水平的提高，肥胖、雌激素水平紊亂、糖尿病及高血壓等危險(xiǎn)因素促使其發(fā)病趨于年輕化[1，5]。因此，探討子宮內(nèi)膜癌的致癌基因和發(fā)病機(jī)制對于子宮內(nèi)膜癌的預(yù)防和治療尤為重要。

miRNAs 是一類長度為19～25 個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA 分子，通過與靶基因的3’非翻譯區(qū)結(jié)合來調(diào)控基因的表達(dá)，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。miR-34a-5p 作為miR-34 家族中的一員，具有與p53 通路相關(guān)的腫瘤抑制功能[6]。相關(guān)研究[7-9]發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p 在結(jié)直腸癌、乳腺癌和卵巢癌中低表達(dá)，這表明miR-34a-5p 的表達(dá)失調(diào)是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞的過程，也是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的重要機(jī)制。研究[10]表明，腫瘤細(xì)胞通過miRNAs來參與EMT 過程從而調(diào)控相關(guān)的癌癥轉(zhuǎn)移，如miR-451 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和EMT過程。但miR-34a-5p 在子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)研究較少，故本研究旨在探討miR-34a-5p 對子宮內(nèi)膜癌AN3CA 細(xì)胞侵襲、遷移和EMT 過程的影響，從而為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)防、診斷和治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 人子宮內(nèi)膜癌AN3CA 細(xì)胞由寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院科研設(shè)備管理中心提供。

1.1.2 主要試劑 miR-34a-5p 過表達(dá)慢病毒及其空載體慢病毒購自漢恒生物科技（上海）有限公司，SYBR Green PCR 試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，引物miR-34a-5p 購自生工生物技術(shù)（上海）有限公司，引物U6 購自廣州銳博生物科技有限公司，高糖DMEM 培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份有限公司，胎牛血清購自以色列Biological Industries 公司，Transwell 小室購自美國Corning Incorporated 公司，胰蛋白酶、青鏈霉素混合液和結(jié)晶紫甲醇溶液均購自北京索萊寶科技有限公司，蛋白轉(zhuǎn)移緩沖液購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，Tris-甘氨酸-SDS 緩沖液和TBST 購自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司，Western Lighting Plus ECL 購自Perkin Elmer公司，全蛋白提取試劑盒和BCA 蛋白含量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。ZEB1購自ABclonal 公司，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、SNAI1、α-SMA、GAPDH 抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國Proteintech 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞均培養(yǎng)于含有10%的胎牛血清、1%的青鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量為80%～90%時(shí)，PBS 清洗1 次，加入1 mL 的0.25%胰蛋白酶消化，消化后將細(xì)胞懸液收集于15 mL 離心管中，1 200 r·min-1離心5 min，棄掉上清液后重懸并傳代，用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用處于對數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜癌AN3CA 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為Control組（空白對照）、NC 組（轉(zhuǎn)染慢病毒空載體）及miR-34a-5p 組（轉(zhuǎn)染miR-34a-5p 過表達(dá)慢病毒）。轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞接種于6 孔板中，待第2 天生長密度為50%～60%時(shí)，分別將慢病毒轉(zhuǎn)染于相應(yīng)細(xì)胞組（MOI=60），培養(yǎng)24 h 后換液，至48和72 h 時(shí)用熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染成功后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

1.2.3 RT-qPCR 檢測各組細(xì)胞中miR-34a-5p的表達(dá)水平 將生長狀況良好的各組細(xì)胞用Trizol 法提取總RNA，檢測各濃度后，以總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以U6 為內(nèi)參，按照說明書進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃3 min，95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2－ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞中miR-34a-5p 表達(dá)水平。反轉(zhuǎn)錄引物序列：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAACCAG-3’；miR-34a-5p 引物序列：F 引物：5’-ACACTCCAGCTGGCTGGCAGTGTCTTAGC-3’，R 引物：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；U6 引物序列：F 引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R 引物：5’-AACGC TTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.4 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力 預(yù)先在Transwell 小室底部鋪入40 μL 的水凝膠待用，取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，用胰酶消化后重懸計(jì)數(shù)，接種于上室中（細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/100 μL），下室加入700 μL 含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后，棄掉上室中的培養(yǎng)液，用棉簽輕輕蘸去小室中未侵入的細(xì)胞。4%多聚甲醛固定15 min，0.25%結(jié)晶紫避光染色15 min后在顯微鏡下（×200）隨機(jī)選取5 個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)，計(jì)算各組細(xì)胞的侵襲數(shù)量。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力 在6 孔板的背面預(yù)先畫5 條橫線，然后將生長狀況良好的各組細(xì)胞接種于6 孔板中，當(dāng)細(xì)胞完全貼壁且鋪滿底部后，用牙簽在各孔的細(xì)胞表面劃一條垂直于橫線的愈合傷口，PBS 洗去劃掉的漂浮細(xì)胞，加入不含血清的培養(yǎng)基，顯微鏡下（×200）拍照記錄劃痕面積。培養(yǎng)24 h 后，在同一位置再次拍照記錄劃痕面積，計(jì)算各組細(xì)胞的遷移率。細(xì)胞遷移率（%）=（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.6 Western blot 檢測EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞后，使用全蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，并用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。每孔的蛋白上樣量為30 μg，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育4 ℃過夜，二抗室溫孵育1.5 h，最后加入ECL 發(fā)光液曝光目的條帶。以GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J 軟件計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0 和SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-34a-5p 過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染后升高miR-34a-5p 的表達(dá)水平

慢病毒轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌AN3CA 細(xì)胞后，通過熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Control組無熒光表達(dá)，而NC 組和miR-34a-5p 組可見明顯的綠色熒光，提示轉(zhuǎn)染成功，見圖1A、圖1B。RT-qPCR 結(jié)果顯示，與Control 組和NC 組相比，miR-34a-5p 組中，miR-34a-5p 的表達(dá)水平均升高（P 均＜0.01），進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。而Control組和NC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1C。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染AN3CA 細(xì)胞后的熒光表達(dá)及各組細(xì)胞中miR-34a-5p 的表達(dá)

2.2 miR-34a-5p 過表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌AN3CA 細(xì)胞的侵襲

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Control 組、NC組和miR-34a-5p 組的細(xì)胞侵襲數(shù)量分別為（492.40±18.80）個(gè)、（497.00±36.94）個(gè)和（62.60±12.18）個(gè)。與Control 組和NC 組相比，miR-34a-5p 組的細(xì)胞侵襲數(shù)量均減少（P 均＜0.01），而Control 組和NC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測miR-34a-5p 過表達(dá)AN3CA 細(xì)胞的侵襲

2.3 miR-34a-5p 過表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌AN3CA 細(xì)胞的遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Control 組、NC 組和miR-34a-5p 組的細(xì)胞遷移率分別為（50.94±4.61）%、（49.66±5.64）%和（34.49±1.15）%。與Control 組和NC 組相比，miR-34a-5p 組的細(xì)胞遷移率均降低（P 均＜0.01），而Control 組和NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測miR-34a-5p 過表達(dá)AN3CA 細(xì)胞的遷移率

2.4 miR-34a-5p 過表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌AN3CA 細(xì)胞的EMT 過程

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control 組和NC 組相比，miR-34a-5p 組中E-cadherin 均增高，N-cadherin、Vimentin、SNAI1、α-SMA 和ZEB1降低（P＜0.05 或P＜0.01），而Control 組和NC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 Western blot 檢測miR-34a-5p 過表達(dá)AN3CA 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是最具侵襲性和致命性的癌癥之一，其最常見的癥狀是絕經(jīng)后不規(guī)則的陰道流血，但絕經(jīng)后不規(guī)則的陰道流血不是子宮內(nèi)膜癌的特異性表現(xiàn)[11]，因此早期診斷比較困難。相關(guān)研究[12]發(fā)現(xiàn)，早期子宮內(nèi)膜癌患者具有良好的預(yù)后，而那些晚期及被診斷為復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性的患者的總體生存率很低。因此，迫切需要進(jìn)一步了解子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制，從而確立與之相對應(yīng)的預(yù)防措施和治療策略。近年來，隨著對腫瘤相關(guān)生物標(biāo)記物的深入研究，基于分子特征的基因檢測和靶向治療有望成為早期發(fā)現(xiàn)和改善子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的關(guān)鍵措施[13-14]。

miRNAs 在癌癥中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，既可作為致癌基因，也可作為腫瘤抑制因子。miR-34a-5p 作為腫瘤抑制因子之一，能夠影響腫瘤的發(fā)生、生長、EMT 過程、侵襲和遷移[15]。在黑色素瘤中，miR-34a-5p 下調(diào)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平與TNM 分期密切相關(guān)[16]。在乳腺癌中，miR-34a-5p 通過靶向上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子（EMT-TFs）抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[17]。在結(jié)腸癌中，miR-34a-5p 過表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT 過程[7]。由此可見，miR-34a-5p 通過腫瘤抑制作用來影響癌癥的生物學(xué)功能，提示miR-34a-5p 可作為預(yù)測不同類型腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記物。在本研究中，通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建了miR-34a-5p 過表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌AN3CA 細(xì)胞系，采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-34a-5p 過表達(dá)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌AN3CA細(xì)胞的遷移和侵襲。

EMT 對胚胎發(fā)育、傷口愈合、組織再生、器官纖維化和癌癥進(jìn)展至關(guān)重要，其異常激活在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18-19]。EMT過程非常復(fù)雜，在該過程中，細(xì)胞失去上皮表型而轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型，使上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)降低，間充質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin、SNAI1、α-SMA、ZEB1 的表達(dá)水平增加，從而賦予腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移的特性[20]。而轉(zhuǎn)移是癌癥致死的主要原因之一[21]，因此抑制EMT 的發(fā)生對于預(yù)防子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移非常重要。許多miRNAs 可通過調(diào)控EMT 過程影響腫瘤的轉(zhuǎn)移。An等[22]認(rèn)為，miR-203a-3p 過表達(dá)可以維持胰腺癌細(xì)胞的上皮表型，抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，從而抑制胰腺癌的EMT 進(jìn)程。為了進(jìn)一步明確miR-34a-5p 是否影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的EMT 過程和轉(zhuǎn)移，本研究Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-34a-5p 過表達(dá)能夠上調(diào)E-cadherin 的表達(dá)，而下調(diào)N-cadherin、Vimentin、SNAI1、α-SMA 和ZEB1 的表達(dá)水平。說明miR-34a-5p 是上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制因子，其過表達(dá)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的EMT過程，從而有效阻斷子宮內(nèi)膜癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的傾向。

綜上所述，miR-34a-5p 過表達(dá)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌AN3CA 細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并抑制EMT 過程。 因此，認(rèn)為miR-34a-5p 可作為預(yù)測子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移傾向的新型生物標(biāo)記物，從而有效指導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌的靶向治療。