梁念孩， 杜麗君， 馬 燕， 夏會東， 竇凱凱， 姚 青， 擺 茹

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區(qū)第五人民醫(yī)院，石嘴山 753000）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，是20～75 歲糖尿病患者視力下降或失明的重要原因[1-5]。DR 發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚未完全明確。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞不具有再生能力，但具有支持作用，可為視網(wǎng)膜提供營養(yǎng)[6]，細(xì)胞死亡后由相鄰細(xì)胞補充空余位置。高糖刺激可使視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷并失去正常生理功能，長期高血糖可導(dǎo)致視網(wǎng)膜發(fā)生特征性病理改變，如視網(wǎng)膜微血管內(nèi)膜增厚、血管通透性增加和新生血管化，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變，而視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞屏障的破壞在DR 的發(fā)展中起著重要作用[7-10]。

NLRP3 炎癥小體是組織細(xì)胞調(diào)控炎性反應(yīng)的重要信號分子，主要由NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）及半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）組成[11]。NLRP3 炎癥小體激活后，可誘導(dǎo)Caspase-1 前體裂解和活化，活化的Caspase-1 能裂解消皮素D（gasdermin D，GSDMD）并釋放其N 端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜并形成孔，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，包括炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18，激活焦亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[12-14]。研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體/細(xì)胞焦亡信號通路的激活參與DR 的發(fā)生與發(fā)展，高糖刺激NLRP3-Caspase-1-GSDMD 信號軸，可誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜細(xì)胞以濃度和時間依賴性的方式在質(zhì)膜中產(chǎn)生孔隙并分泌IL-1β 和IL-18。

枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP）是枸杞子的主要活性成分，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等多種生物活性，還具有抗衰老、細(xì)胞保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)和減緩炎性反應(yīng)的作用[17-19]。研究[20]發(fā)現(xiàn)，LBP 能夠抑制糖尿病小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的血管新生、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。本研究通過觀察LBP 對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體/細(xì)胞焦亡信號通路的影響，進(jìn)一步探討LBP 對糖尿病視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19（北京協(xié)和細(xì)胞資源中心）、LBP（寧夏沃福百瑞枸杞產(chǎn)業(yè)股份有限公司，LBP 含量為53.14%）、DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclone 公司）、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）、全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物股份有限公司）、兔抗NLRP3 抗體、兔抗ASC 抗體、兔抗Caspase-1 抗體、兔抗GSDMD 抗體（美國Proteintech Group 公司）、兔抗β-actin 抗體、羊抗兔IgG（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、IL-1β 和IL-18 ELISA 檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（蘇州新賽美生物科技有限公司）、甘氨酸（北京百奧萊博科技有限公司）、1×無蛋白快速封閉液、10×電泳液、抗體稀釋液、快速配膠試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）、相差顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）、低速冷凍離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）、電泳儀（美國Bio-Rad 公司）、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、超凈水儀（四川優(yōu)普超純科技有限公司）、1510 型多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）。

1.3 方法

1.3.1 ARPE-19 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 ARPE-19 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 低糖培養(yǎng)液（5.5 mmol·L-1葡萄糖）中，接種于6 孔板，每孔1.5×105個細(xì)胞。隨機分為正常組（5.5 mmol·L-1葡萄糖）、高糖組（55.5 mmol·L-1葡萄糖）、LBP 低濃度組（55.5 mmol·L-1葡萄糖+100 μg·mL-1LBP）、LBP 中濃度組（55.5 mmol·L-1葡萄糖+200 μg·mL-1LBP）和LBP 高濃度組（55.5 mmol·L-1葡萄糖+400 μg·mL-1LBP）。正常組和高糖組細(xì)胞分別使用含5.5 mmol·L-1和55.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM 完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。LBP 低、中、高濃度組細(xì)胞在含55.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM 完全培養(yǎng)液中分別加入100、200、400μg·mL-1LBP 進(jìn)行培養(yǎng)。作用72 h 后，收集細(xì)胞和上清液進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2 免疫熒光檢測細(xì)胞中NLRP3 蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6 孔板，每孔1.5×105個細(xì)胞，按照細(xì)胞分組，分別進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)72 h 后取出細(xì)胞爬片，4%的多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 洗3 次，0.2% TritonX-100 室溫破膜20 min 后，山羊血清封閉30 min。配制NLRP3 一抗室溫孵育1 h，羊抗兔IgG 二抗室溫避光孵育1 h。DAPI 染核5 min，封片。熒光顯微鏡下觀察并采圖。使用Image J 軟件進(jìn)行平均熒光強度分析。

1.3.3 Western blot 檢測細(xì)胞中NLRP3/細(xì)胞焦亡信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集好72 h 干預(yù)過的各組細(xì)胞，按照全蛋白提取試劑盒說明，提取蛋白并定量后，加入Loading Buffer，變性10 min備用。取30 μg 蛋白上樣，10%的膠電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（PVDF 膜、濕轉(zhuǎn)、220 mA）。用無蛋白快速封閉液封閉30 min 后，加入NLRP3（1∶3 000）、ASC（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、GSDMD（1∶5 000）、β-actin（1 ∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜。二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，隨后配制ECL 發(fā)光液（A 液∶B 液=1∶1）進(jìn)行曝光，采圖并數(shù)據(jù)處理。使用Image J 軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

1.3.4 ELISA 檢測細(xì)胞上清液中IL-1β 和IL-18的表達(dá)水平 收集好72 h 干預(yù)過的各組細(xì)胞上清液，12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣品孔。各孔中加入相應(yīng)試劑或樣品，按IL-1β 和IL-18 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀450 nm 處測各孔吸光度A。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算IL-1β 和IL-18 濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布和方差齊性的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LBP 抑制高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中NLRP3 蛋白的表達(dá)

免疫熒光圖中可以看到，NLRP3 蛋白主要在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，且與正常組相比，高糖組NLRP3 蛋白的表達(dá)水平升高（P＜0.05）；而與高糖組相比，LBP 中、高濃度組NLRP3 蛋白的表達(dá)水平均降低（P 均＜0.01），而LBP 低濃度組中NLRP3 蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

圖1 免疫熒光檢測LBP 對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中NLRP3 蛋白表達(dá)的影響

2.2 LBP 降低高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖刺激后，人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、ASC 蛋白的表達(dá)均上升（P 均＜0.05）。與高糖組相比，LBP 中、高濃度組細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、ASC 蛋白的表達(dá)均降低（P 均＜0.05），而LBP 低濃度組中各蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

圖2 Western blot 檢測LBP 對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中NLRP3、ASC、Caspase-1 表達(dá)的影響

2.3 LBP 對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中GSDMD 蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，高糖組人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中焦亡蛋白GSDMD 的表達(dá)上升（P＜0.05）。與高糖組相比，LBP 中、高濃度組細(xì)胞中GSDMD 蛋白的表達(dá)均下降（P 均＜0.05），見圖3。

圖3 Western blot 檢測LBP 對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中GSDMD 蛋白表達(dá)的影響

2.4 LBP 下調(diào)高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18 炎性因子的表達(dá)

ELISA 檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，高糖組人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中IL-1β 和IL-18 的表達(dá)量均升高（P 均＜0.05）。而與高糖組相比，LBP中、高濃度組的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中IL-1β、IL-18 的表達(dá)量均降低（P 均＜0.05），但LBP低濃度組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均>0.05），見圖4。

圖4 ELISA 檢測LBP 對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞上清液中IL-18 和IL-1β 表達(dá)的影響

3 討論

NLRP3 炎癥小體的激活參與DR 的發(fā)生與發(fā)展，抑制其活化，可發(fā)揮對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用[21]。在糖尿病兔模型中，NLRP3 炎癥小體識別激活信號后，活化IL-1β 和IL-18，三者共同參與糖尿病誘發(fā)的非感染性炎性反應(yīng)[22]。而下調(diào)NLRP3/Caspase-1 通路表達(dá)，可抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜組織炎癥，減輕過氧化損傷，發(fā)揮對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用，從而改善DR 癥狀[23-25]。

NLRP3 過度活化可導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，經(jīng)典的細(xì)胞焦亡通路特點包括Caspase-1 依賴、DNA 片段化、細(xì)胞膜完整性的快速喪失和炎性細(xì)胞因子釋放，而GSDMD 蛋白是Caspase-1 的主要底物，是細(xì)胞焦亡的最終執(zhí)行者[24，26]。NLRP3 炎癥小體在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變模型中被過度激活，NLRP3、ASC、Caspase-1 和GSDMD 等蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)[27-28]。張敏等[29]也證實了Caspase-1 依賴性的細(xì)胞焦亡促進(jìn)了人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的死亡。這表明NLRP3 炎癥小體誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡促進(jìn)了DR 的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，在高糖刺激的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中，NLRP3 炎癥小體被過度激活，GSDMD 蛋白表達(dá)水平上升，也證實了NLRP3 炎癥小體/細(xì)胞焦亡信號通路的過度活化在DR 的發(fā)病過程中具有重要作用。

LBP 具有多種生物活性，對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。Liang 等[30]研究表明，LBP 可能通過調(diào)節(jié)H2O2誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡途徑中所涉及的蛋白質(zhì)的表達(dá)，并激活核因子紅細(xì)胞2 相關(guān)因子2（Nrf2）信號通路，減少氧化損傷和抑制細(xì)胞凋亡，從而對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用。本研究使用LBP 對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，與高糖組比較，LBP 中、高濃度組中NLRP3、ASC、Caspase-1 及GSDMD 蛋白的表達(dá)下降，細(xì)胞上清液中IL-1β 和IL-18 的產(chǎn)生減少，表明LBP 對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用。但低濃度LBP 未顯示其保護(hù)作用，可能與LBP 濃度過低有關(guān)。也有研究[31]報道，LBP 在較低濃度時對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的生長無顯著影響。

綜上所述，適當(dāng)濃度的LBP 可對高糖刺激的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，其分子機制可能為LBP 通過抑制NLRP3 炎癥小體的活化，下調(diào)GSDMD 而減輕細(xì)胞焦亡，同時抑制炎癥因子IL-1β 和IL-18 的釋放。本研究為進(jìn)一步深入研究LBP 在DR 中的作用及其分子機制奠定了理論基礎(chǔ)。但本研究僅通過細(xì)胞實驗進(jìn)行體外單層次驗證，存在一定的局限性。