魯 重，劉靜聰，吳詩(shī)媛，馮立芳，陳 劍，朱軍莉*

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018）

我國(guó)生鮮食品資源豐富，如生鮮肉蛋奶、水產(chǎn)品和果蔬都是備受大眾青睞的食品種類，消費(fèi)量巨大。然而，生鮮食品水分含量高、具有季節(jié)性和地域性的特點(diǎn)使其收獲后在冷鏈貯運(yùn)過程中的腐損率較高，這造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。微生物是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的重要因素，特別是假單胞菌（Pseudomonas）。由于獨(dú)特的生物學(xué)特性和代謝功能，假單胞菌被公認(rèn)為導(dǎo)致魚類、肉類及乳制品等生鮮食品腐敗的最常見菌屬之一[1]。假單胞菌為假單胞菌科（Pseudomonadaceae），1984年由德國(guó)科學(xué)家Migula首次提出，按照rRNA和DNA的同源性將假單胞菌分為5 個(gè)亞群（RNA I、II、III、IV、V群）和未確定群[2]。假單胞菌屬中參與生鮮食品腐敗的熒光假單胞菌（P.fluorescens）、莓實(shí)假單胞菌（P.fragi）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）等多屬于RNA I群。致腐假單胞菌有較強(qiáng)的新陳代謝活性，可以分泌多種蛋白質(zhì)酶和脂肪酶，而該菌屬的耐冷特性使其成為在冷藏條件下導(dǎo)致生鮮食品腐敗的優(yōu)勢(shì)菌。

近年來，生物被膜作為致腐菌重要的致腐因子引起廣泛的關(guān)注。生物被膜是細(xì)菌由單個(gè)細(xì)胞的浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗉?xì)胞群集狀態(tài)時(shí)，依附于接觸表面所形成的由胞外多糖、纖維蛋白、脫氧核糖核酸等構(gòu)成的多聚體復(fù)合物[3]。生物被膜不僅存在食品表面，還可以在食品加工設(shè)備表面擴(kuò)散，使肉類、乳制品、水產(chǎn)品等食品加工環(huán)境產(chǎn)生持續(xù)性污染，造成經(jīng)濟(jì)損失。因此，生物被膜細(xì)菌是食品污染的潛在來源，能夠?qū)е率称纷冑|(zhì)或傳播食源性病原體，威脅人類健康。

1 生鮮食品中致腐假單胞菌的污染

食品生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中，低溫冷鏈?zhǔn)怯行б种粕r食品微生物污染和繁殖的主要方式。致腐菌附著在食物表面并繁殖到一定數(shù)量會(huì)導(dǎo)致食物腐敗變質(zhì)或交叉污染。在需氧冷藏的多種生鮮食品中，假單胞菌被公認(rèn)為主要的優(yōu)勢(shì)腐敗菌屬，包括莓實(shí)假單胞菌、熒光假單胞菌和隆德假單胞菌（P.lundensis）等。

1.1 污染肉類及肉制品

多項(xiàng)研究表明，從雞肉、豬肉、牛肉等肉品中都能夠分離出多種致腐假單胞菌，肉類及其制品中的致腐假單胞菌主要以莓實(shí)假單胞菌、熒光假單胞菌和隆德假單胞菌為主[4]。Xu Yi等[5]從腐敗雞肉中分離出莓實(shí)假單胞菌、熒光假單胞菌、嗜冷假單胞菌（P.psychrophila）以及蓋氏假單胞菌（P.gessardii）4 種假單胞菌；Wang Guangyu等[6]在變質(zhì)的冷鮮雞肉中分離出熒光假單胞菌和莓實(shí)假單胞菌，并發(fā)現(xiàn)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)迅速，是冷鮮雞肉的主要致腐菌；Wickramasinghe等[7]通過熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察莓實(shí)假單胞菌在冷藏牛肉表面的生物被膜，發(fā)現(xiàn)莓實(shí)假單胞菌易在肉表面形成生物被膜并與肉類滲出液相結(jié)合形成黏液，導(dǎo)致肉品腐敗。本課題組在冷鮮牛肉中分離出致腐性較強(qiáng)的隆德假單胞菌，并發(fā)現(xiàn)該菌與熱索環(huán)絲菌發(fā)生相互作用，導(dǎo)致肉品產(chǎn)生不良感官性狀和品質(zhì)劣變[8]。

1.2 污染水產(chǎn)品

假單胞菌是引起溫水域養(yǎng)殖水產(chǎn)品腐敗的重要細(xì)菌種類，其中惡臭假單胞菌（P.putida）、熒光假單胞菌、產(chǎn)氮假單胞菌（P.azotoformans）較為常見。惡臭假單胞菌是淡水魚的重要腐敗菌之一，Zhuang Shuai等[9]在草魚魚片中分離出惡臭假單胞菌，發(fā)現(xiàn)該菌有較強(qiáng)的吸收和代謝游離氨基酸能力，能夠促進(jìn)草魚的腐敗。嚴(yán)羽萍等[10]在養(yǎng)殖的海產(chǎn)魚冷藏過程中也分離到了熒光假單胞菌，其在大黃魚和大菱鲆中發(fā)現(xiàn)5 株具有較高蛋白酶活性和產(chǎn)嗜鐵素活性的熒光假單胞菌。另外，研究表明從雜交石斑魚中分離出的假單胞菌中，64.85%為產(chǎn)氮假單胞菌，其對(duì)冷藏石斑魚的氣味和風(fēng)味產(chǎn)生較大的不良影響[11]。Jeyasekaran等[12]發(fā)現(xiàn)假單胞菌不僅是養(yǎng)殖魚類的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，而且在冷藏蝦產(chǎn)品中也優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。

1.3 污染乳及乳制品

耐冷假單胞菌在冷藏乳及其制品的微生物污染和品質(zhì)劣變中占據(jù)主導(dǎo)作用，也是引起巴氏殺菌乳變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。研究表明，大多數(shù)熒光假單胞菌具有胞外蛋白酶、脂肪酶和卵磷脂酶活性，是加工乳制品中的主要腐敗菌[13]。Zarei等[14]在冷生乳中分離出假單胞菌復(fù)合菌群，包括熒光假單胞菌、莓實(shí)假單胞菌、蓋氏假單胞菌、維氏假單胞菌（P.veronii）等，該混合群體提高了生物被膜形成的能力，并能產(chǎn)多種蛋白酶以破壞奶制品穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，乳制品中不同分離株間的蛋白水解酶活性差異較大，在山羊、水牛、駱駝和牦牛乳中分離出的假單胞菌群中，牦牛乳分離株的蛋白水解活性最高[15]。假單胞菌種屬間因其差異特性對(duì)牛奶品質(zhì)劣變產(chǎn)生不同的感官影響。從冷藏的原料乳中篩選出的熒光假單胞菌、莓實(shí)假單胞菌、惡臭假單胞菌等7 株假單胞菌表現(xiàn)出不同的蛋白水解和脂解活性，耐冷菌數(shù)量及蛋白水解酶和脂解酶的性質(zhì)影響牛奶色澤和風(fēng)味品質(zhì)[16]。此外，耐冷假單胞菌也會(huì)引起冷鮮奶酪的變質(zhì)并縮短其貨架期。

1.4 污染果蔬

果蔬產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)豐富、含水量高，經(jīng)過鮮切和即食加工后，因表皮等天然屏障被破壞、汁液外流等因素，易出現(xiàn)腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象。假單胞菌是能夠引起果蔬腐敗的重要腐敗細(xì)菌之一。研究表明，在即食生菜中分離出的13 種腐敗細(xì)菌中，假單胞菌屬和泛細(xì)菌屬比例最高[17]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌主要通過代謝產(chǎn)生亞硝酸鹽和消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等方式導(dǎo)致西蘭花的腐敗與變質(zhì)[18]。除能夠引起果蔬腐敗，假單胞菌還作為果蔬作物的致病菌受到關(guān)注，如菊苣假單胞菌（P.cichorii）是導(dǎo)致番茄壞死和生菜葉腐爛的關(guān)鍵致病菌[19]。

部分食品中污染的假單胞菌和致腐特性如表1所示。

表1 部分食品中污染的假單胞菌和致腐特性Table 1 Contamination of Pseudomonas in some foods and its spoilage characteristics

2 假單胞菌生物被膜形成過程

生物被膜是微生物生存的重要策略，也是假單胞菌的重要致腐因素。生物被膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)循環(huán)的過程，包括初期黏附、微菌落形成、生物被膜成熟和被膜散播4 個(gè)階段[3]。首先，浮游細(xì)菌黏附至實(shí)體表面進(jìn)行分裂繁殖，合成與分泌生物被膜基質(zhì)，形成微菌落；隨后多個(gè)微菌落互相融合形成成熟的生物被膜，最后成熟的生物被膜釋放出浮游細(xì)菌來擴(kuò)展和播散。實(shí)際上，冷鏈環(huán)境中肉類表面腐敗過程中產(chǎn)生的黏液層就是生物被膜，當(dāng)黏液層被膜菌數(shù)量高達(dá)108CFU/cm2時(shí)，肉就會(huì)形成不良的風(fēng)味，縮短貨架期[4]。前期研究已發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌和隆德假單胞菌的肉源分離株在氣-液交接面處容易形成薄膜[23]。假單胞菌的生物被膜還表現(xiàn)出種間的易變性，肉和乳中33 株假單胞菌分離株在不銹鋼和塑料表面黏附的特性表現(xiàn)菌株依賴性，菌株間生物膜形成具有異質(zhì)性[22]。另外，環(huán)境因素也是菌體生存方式轉(zhuǎn)變的重要信號(hào)[18]，如溫度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、滲透壓、pH值等。研究表明，低溫環(huán)境能有效促進(jìn)熒光假單胞菌、莓實(shí)假單胞菌和隆德假單胞菌多株致腐菌的生物被膜形成胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）分泌[8,20,23]。加工器具接觸面性質(zhì)、食物基質(zhì)及加工應(yīng)激都會(huì)影響假單胞菌的生物膜形成，而被膜發(fā)育過程中假單胞菌也會(huì)與表面的多種微生物相互作用，形成更復(fù)雜的混合生物被膜，導(dǎo)致食品連續(xù)和交叉污染，對(duì)食品安全性造成威脅[4]。

3 假單胞菌生物被膜胞外基質(zhì)的組成

在成熟的生物被膜中，微生物只占其質(zhì)量的約10%，而生物被膜基質(zhì)占到90%以上[31]。生物被膜基質(zhì)是細(xì)胞外物質(zhì)，由微生物自身產(chǎn)生并輸送至胞外，將細(xì)胞嵌入其中。生物被膜基質(zhì)由不同類型的EPS組成，包括多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等物質(zhì)。這些成分能維持生物被膜穩(wěn)定性，介導(dǎo)細(xì)菌與固體表面的黏附，并形成穩(wěn)定的三維聚合物網(wǎng)絡(luò)[32]。EPS作為生物被膜三維結(jié)構(gòu)的支架，保證了微生物群落營(yíng)養(yǎng)代謝功能和毒力特性，并對(duì)抗菌劑、pH值、紫外線等外界環(huán)境刺激具有抵抗作用。

3.1 胞外多糖

胞外多糖是EPS的主要組成成分。根據(jù)化學(xué)組成不同，胞外多糖分為雜多糖和均多糖。大多數(shù)假單胞菌的胞外多糖是由中性和帶電糖殘基混合物組成的雜多糖，如假單胞菌的藻酸鹽。而假單胞菌的胞外多糖還包含少量的均多糖，即由一種糖分子縮合而成的多糖，如纖維素。研究表明，假單胞菌中與生物被膜形成直接相關(guān)的胞外多糖至少有3 種——藻酸鹽、Pel、Psl，在生物被膜形成過程中發(fā)揮著不同的作用[33]。藻酸鹽是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸2 種單體組成，參與生物被膜形成的初期黏附和微菌落形成，也在生物被膜成熟后維持生物被膜的穩(wěn)定性[34]。Pel是由葡萄糖組成的多聚物，由合酶依賴性多糖分泌途徑產(chǎn)生，主要作為生物被膜的結(jié)構(gòu)支架并發(fā)揮保護(hù)作用[35]。而Psl是由D-甘露糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖組成的戊多糖，參與細(xì)菌對(duì)生物或非生物表面的黏附作用，是不依賴藻酸鹽的非黏液型菌株產(chǎn)生生物被膜所必需的多糖[36]。研究發(fā)現(xiàn)，惡臭假單胞菌中胞外多糖A（putida exopolysaccharide A，Pea）、胞外多糖B（putida exopolysaccharide B，Peb）和纖維素是重要的EPS組成成分，尤其Pea是褶皺菌落形態(tài)和生物被膜形成所必需的[37]。因此，多種致腐假單胞菌生物被膜EPS中胞外多糖所占比例很高，胞外多糖合成受阻的細(xì)菌生物被膜形成受到顯著抑制，甚至無法形成。

3.2 胞外蛋白質(zhì)

生物被膜中存在多種細(xì)胞外酶，大部分細(xì)胞外酶參與生物聚合物的降解，如多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等[38]。這些細(xì)胞外酶可將生物聚合物分解成低分子物質(zhì)，被細(xì)菌吸收并用作能量來源。細(xì)胞外酶通過與多糖的相互作用存在于生物膜基質(zhì)，銅綠假單胞菌中的胞外內(nèi)酯化脂肪酶LipA與藻酸鹽結(jié)合，從而保證了胞外酶位于細(xì)胞表面并防止酶的變性和水解[39]。同時(shí)，EPS中存在大量非酶類蛋白，參與組成細(xì)菌生物被膜的支架。凝集素（lectin，Lec）是EPS中一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，由銅綠假單胞菌分泌合成的LecB對(duì)生物被膜起穩(wěn)定作用。假單胞菌EPS中普遍存在的蛋白質(zhì)成分還有Fap功能性淀粉樣蛋白，介導(dǎo)細(xì)菌在固體表面的黏附作用，并為成熟的生物被膜提供穩(wěn)定性。Wickramasinghe等[20]曾報(bào)道，相比于25 ℃，4 株肉源假單胞菌在10 ℃時(shí)分泌的胞外蛋白質(zhì)含量顯著增加。胞外蛋白與胞外多糖等EPS組分共同參與細(xì)菌生物被膜從初期黏附到三維結(jié)構(gòu)的形成。

3.3 脫氧核糖核酸

在假單胞菌等多種細(xì)菌產(chǎn)生的生物被膜中都檢測(cè)到了胞外脫氧核糖核酸（extracellular DNA，eDNA）。研究表明，eDNA作為細(xì)菌生物被膜的重要成分，能夠維持生物被膜穩(wěn)定性和細(xì)胞間連接[40]。銅綠假單胞菌的eDNA對(duì)于菌體生物被膜形成的初期黏附階段至關(guān)重要，eDNA降解后細(xì)菌會(huì)停止表面附著作用[41]。在惡臭假單胞菌形成的生物被膜中，eDNA在鉻的吸附和絡(luò)合過程中起關(guān)鍵作用[42]。在莓實(shí)假單胞菌和隆德假單胞菌的生物被膜中檢測(cè)到eDNA，其含量存在菌株差異性，且與培養(yǎng)溫度無相關(guān)性[40]。另外，研究表明eDNA還具有一定的抗菌活性，能通過螯合脂多糖和細(xì)菌外膜陽(yáng)離子引起細(xì)胞裂解[43]。研究發(fā)現(xiàn)，EPS中多個(gè)組分能夠幫助假單胞菌抵抗消毒劑、抗生素和宿主免疫防御等外界不良因素的影響[44]。

4 生物被膜形成的調(diào)控因子及通路

微生物生物被膜發(fā)育和發(fā)展存在復(fù)雜的協(xié)調(diào)機(jī)制，包括非生物因素和生物因素，從而影響菌體從浮游態(tài)向被膜態(tài)生長(zhǎng)模式的轉(zhuǎn)變。在生物因素層面，已發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬水平內(nèi)存在多種對(duì)生物被膜形成發(fā)揮重要調(diào)控作用的調(diào)控系統(tǒng)和調(diào)控因子。

4.1 C-di-GMP調(diào)控通路

環(huán)鳥苷二磷酸（cyclic di-guanylate monophosphate，c-di-GMP）是細(xì)菌胞內(nèi)普遍存在的第二信使，對(duì)革蘭氏陰性菌生物被膜的形成有重要的調(diào)控作用。C-di-GMP由含有GGD(/E)EF結(jié)構(gòu)域的雙鳥苷酸環(huán)化酶（diguanylate cyclases，DGCs）催化2分子三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）合成，并被含有EAL/HD-GYP結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs）催化降解為5’-磷酸鳥苷酸-(3’,5’)-鳥苷（5’-phosphoguanylyl-(3’,5’)-guanosine，pGpG）或鳥苷酸（guanosine monophosphate，GMP）[45]。GGD(/E)EF和EAL結(jié)構(gòu)域可以同時(shí)存在于同一個(gè)蛋白質(zhì)中，通常僅有1 個(gè)結(jié)構(gòu)域具有催化活性，或者存在第3個(gè)活性結(jié)構(gòu)域破壞GGD(/E)EF和EAL結(jié)構(gòu)域[46]。C-di-GMP參與調(diào)控細(xì)菌中多種生理生化過程，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、生物被膜的合成與降解、鞭毛運(yùn)動(dòng)和毒性等[47]。而c-di-GMP調(diào)控系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)細(xì)菌胞內(nèi)處于高濃度的c-di-GMP時(shí)，黏附素和胞外多糖等生物被膜基質(zhì)成分大量合成以促進(jìn)細(xì)菌生物被膜的形成；另一方面c-di-GMP可以抑制細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，也有利于細(xì)菌生物被膜的形成。近年來，已發(fā)現(xiàn)假單胞菌有多個(gè)c-di-GMP代謝酶參與生物被膜形成的調(diào)控[45]。

銅綠假單胞菌生物被膜的形成依賴于DGCs合成c-di-GMP，其中最具代表性的是WspR。WspR是銅綠假單胞菌中Wsp趨化性調(diào)節(jié)系統(tǒng)的一部分。WspR的寡聚化增強(qiáng)了DGCs的活性，使胞內(nèi)c-di-GMP顯著升高，生物被膜形成量也顯著增加[48]。生物被膜形成的主調(diào)節(jié)因子FleQ和PelD是c-di-GMP的效應(yīng)蛋白，F(xiàn)leQ可以感知c-di-GMP水平增加，并與c-di-GMP結(jié)合，從而激活pel和psl操縱子的轉(zhuǎn)錄[49]。除調(diào)控Pel和Psl的表達(dá)，c-di-GMP和FleQ還調(diào)控多個(gè)EPS相關(guān)基因的表達(dá)，如cdrA編碼黏附素CdrA[50]。此外，F(xiàn)leQ可以抑制銅綠假單胞菌的鞭毛運(yùn)動(dòng)，有利于細(xì)菌生物被膜的形成。

惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌中LapA是重要的EPS成分，周質(zhì)蛋白酶LapG切割LapA的N端，使LapA脫離細(xì)胞外膜，導(dǎo)致細(xì)菌的黏附能力降低；而LapG的活性由具有GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域的內(nèi)膜蛋白LapD調(diào)節(jié)[51]。當(dāng)胞內(nèi)c-di-GMP水平降低時(shí)，LapG從LapD中釋放出來，LapA進(jìn)而被LapG切割，破壞其生物被膜結(jié)構(gòu)的完整性[52]。

4.2 群體感應(yīng)系統(tǒng)

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是發(fā)生在細(xì)菌種內(nèi)及種間的一種信息交流機(jī)制，細(xì)菌會(huì)釋放被稱為自誘導(dǎo)劑（autoinducer，AI）的小型可擴(kuò)散信號(hào)分子到外部環(huán)境中，而當(dāng)外界環(huán)境中積累的信號(hào)分子達(dá)到某一閾值水平時(shí)，信號(hào)分子與受體結(jié)合，激活或抑制細(xì)菌胞內(nèi)多個(gè)靶基因的表達(dá)，使細(xì)菌對(duì)環(huán)境刺激做出反應(yīng)[53]。大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌在QS系統(tǒng)中使用N-酰基-高絲氨酸內(nèi)酯（N-acylhomoserine lactone，AHL）作為信號(hào)分子。AHLs能夠調(diào)控假單胞菌等腐敗菌脂解、蛋白水解和幾丁質(zhì)分解酶活性等表型特征，導(dǎo)致多種食物的腐敗劣變[54]。

假單胞菌中AHLs介導(dǎo)的I型信號(hào)系統(tǒng)有Lux、Las和Rhl信號(hào)系統(tǒng)。而這些信號(hào)系統(tǒng)主要由3 個(gè)基本部分組成：1）信號(hào)合成酶（I基因），負(fù)責(zé)AI信號(hào)分子的合成；2）AIs；3）受體分子（R基因），是編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白（R蛋白）所必需的。當(dāng)胞內(nèi)的AHLs濃度達(dá)到臨界閾值時(shí)，AHLs與LuxR結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)[55]。QS系統(tǒng)可以通過影響細(xì)菌的胞外多糖相關(guān)基因表達(dá)來調(diào)控生物被膜的形成，然而不同假單胞菌對(duì)生物被膜形成的QS調(diào)控有差異。惡臭假單胞菌生物被膜表面蛋白基因的轉(zhuǎn)錄譜分析表明，AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)由LuxIR型信號(hào)分子組成，并對(duì)其生物被膜產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用[56]。從冷藏淡水魚分離的嗜冷假單胞菌PSPF19中AHLs信號(hào)分子促進(jìn)了蛋白水解酶和脂肪分解酶的合成以及生物被膜形成，而添加QS抑制劑減弱了該菌生物被膜的形成和附著能力[57]。在魚源熒光假單胞菌PF07中也發(fā)現(xiàn)了LuxIR蛋白以及高含量的C4-HSL，敲除luxIR能顯著降低生物被膜的形成和蛋白酶等致腐因子的表達(dá)[58]。此外，部分假單胞菌能通過QS對(duì)外源AHLs作出反應(yīng)，以調(diào)節(jié)其腐敗特征。Dai Jinyue等[59]發(fā)現(xiàn)添加外源C6-HSL提高了韓國(guó)假單胞菌PS1的脂肪酶和蛋白酶活性，加速腐敗豬肉中糖類、蛋白質(zhì)和脂肪分解。然而，并非所有假單胞菌都使用AHLs作為信號(hào)分子，從新鮮和變質(zhì)肉類中分離的72 株莓實(shí)假單胞菌中都未能檢測(cè)到AHL活性[60]。

4.3 sRNAs

近期研究發(fā)現(xiàn)，小RNA分子（sRNAs）在調(diào)節(jié)假單胞菌的生物被膜形成中發(fā)揮了重要作用。銅綠假單胞菌的retS基因缺失會(huì)導(dǎo)致生物被膜形成量顯著增加，RetS作為銅綠假單胞菌的傳感器激酶，在急性與慢性感染所需毒力因子的相互調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，并與另外兩種傳感器激酶GacS和LadS協(xié)同作用，共同組成一個(gè)調(diào)節(jié)系統(tǒng)[61]。GacS可以磷酸化GacA，這種活性被RetS拮抗和LadS刺激；磷酸化的GacA能夠促進(jìn)rsmZ和rsmY的轉(zhuǎn)錄[62]。rsm編碼2 個(gè)小RNA分子——RsmY和RsmZ，其表達(dá)水平與細(xì)菌在浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)間的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)[63]。另一方面，RsmA對(duì)生物被膜形成相關(guān)的Psl和QS基因產(chǎn)生負(fù)調(diào)控，而RsmZ和RsmY可以降低RsmA的活性[64]。同樣地，在惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌中也發(fā)現(xiàn)GacA/S系統(tǒng)影響生物被膜形成，其通過正向調(diào)節(jié)LuxI型AHL合酶，與AHLs介導(dǎo)的QS相關(guān)聯(lián)[65-66]。

4.4 其他調(diào)控因子

假單胞菌生物被膜的形成除了受到c-di-GMP、QS系統(tǒng)和sRNAs調(diào)節(jié)外，在不同的假單胞菌中還存在其他多種調(diào)控因子。如銅綠假單胞菌存在喹諾酮信號(hào)（Pseudomonasquinolone signal，PQS）系統(tǒng)，由3,4-二羥基-2-庚基-喹諾酮和2-庚基-4喹諾酮2 種信號(hào)分子組成，參與毒力因子的表達(dá)、生物被膜形成以及運(yùn)動(dòng)等生理過程[67]。此外，脂肪酸介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)可能在銅綠假單胞菌生物被膜的擴(kuò)散期發(fā)揮作用[68]。在熒光假單胞菌中，SadB是獨(dú)立于以上幾個(gè)調(diào)控系統(tǒng)的蛋白，它通過影響調(diào)控因子AlgU、AmrZ和FleQ對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形成和運(yùn)動(dòng)性發(fā)揮調(diào)控作用[69]。另有研究發(fā)現(xiàn)，sigma因子對(duì)于轉(zhuǎn)錄控制不同功能的基因表達(dá)必不可少，在銅綠假單胞菌中sigma因子RpoS是psl表達(dá)的正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。

假單胞菌生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制如圖1所示。

圖1 假單胞菌生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制示意圖[70]Fig.1 Schematic diagram of the regulatory mechanism of biofilm formation in Pseudomonas[70]

5 結(jié) 語(yǔ)

微生物是導(dǎo)致生鮮食品腐敗變質(zhì)的重要因素，其中假單胞菌起主導(dǎo)作用。莓實(shí)假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌等多種致腐假單胞菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的代謝分解底物能力，能夠引起肉與肉制品、乳與乳制品、水產(chǎn)品及果蔬等生鮮食品的品質(zhì)劣變和腐敗，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。生物被膜形成是假單胞菌的重要致腐特性之一，能增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境脅迫、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏和加工殺菌等惡劣條件的適應(yīng)性。盡管研究人員已開發(fā)了控制生物被膜形成和清除生物被膜的多種物理、化學(xué)和生物技術(shù)，然而假單胞菌生物被膜調(diào)控系統(tǒng)的存在，會(huì)合成新的保護(hù)性EPS屏障，導(dǎo)致細(xì)菌生物被膜再次形成，加大了有效控制食品生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸環(huán)境中持續(xù)性污染的難度。

微生物生物被膜的形成機(jī)制復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)假單胞菌生物被膜的調(diào)控系統(tǒng)包括c-di-GMP、QS、sRNAs調(diào)控因子。隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組、微生物組等多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，未來將更深入地探究生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制，這有助于阻斷生物被膜的形成以及闡明細(xì)菌被膜的耐脅迫和耐藥性機(jī)理，并為靶向控制生物被膜的新技術(shù)研發(fā)提供理論基礎(chǔ)，從而有效降低由細(xì)菌生物被膜帶來的污染和安全風(fēng)險(xiǎn)。