李漢琪，王治軍，鄭清瑤，曹文紅,2,*，陳忠琴,2，林海生,2，高加龍,2，鄭惠娜,2

（1.廣東海洋大學食品科技學院，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東省海洋生物制品工程實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088；2.大連工業(yè)大學 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

血栓栓塞及其后遺癥在全世界的發(fā)病率和死亡率居高不下[1]。年齡增長導致血栓性疾病發(fā)生風險上升[2]，伴隨著人口老齡化趨勢加劇，對抗血栓性疾病的形勢日益嚴峻。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2021年6月的統(tǒng)計結(jié)果，血栓誘發(fā)的缺血性心臟病和中風是心血管疾病的兩大主要組成部分，累計造成1 790萬人死亡，占2019年全球死亡人數(shù)的32%。其發(fā)病機制為血栓或栓塞在形成部位與血管壁分離并隨血流移動，導致栓塞部位的組織損傷甚至梗死[3]。根據(jù)血栓和血管疾病的病理生物學特征，將抗血栓藥物分為三大類，即抗凝劑、抗血小板藥物和溶栓劑?？鼓委熓桥R床醫(yī)學預(yù)防和治療血栓性疾病的重要手段[4]，通過抑制機體的凝血功能，以延緩血栓的形成和擴張，降低血栓性疾病的發(fā)生率，預(yù)防溶栓治療后的復發(fā)。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的抗凝劑有4 類：1）肝素，包括低分子肝素；2）VK拮抗劑，如華法林；3）直接凝血酶抑制劑，如比伐盧定和達比加群酯；4）直接活化凝血因子（actived blood coagulation factor X，F(xiàn)Xa）抑制劑，如阿哌沙班、依多沙班和利伐沙班[5]?？鼓幬锏母弊饔脮鹨幌盗胁l(fā)癥，已出現(xiàn)如出血性大皰皮炎[6]、胸髓內(nèi)出血[7]、血小板減少癥[8]等病例報告，因此需要尋找更安全的抗凝藥物。

生物活性肽通常由2～20 個氨基酸殘基組成，能夠發(fā)揮超出其親本蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的有益生物活性[9]；其具有一系列的優(yōu)勢，包括低毒性和免疫原性、良好的溶解性、不同的組織分布模式、優(yōu)良的藥代動力學表現(xiàn)[10-11]。食源性生物活性肽是指從體外攝取，直接或間接來源于食物蛋白質(zhì)的功能性肽。因為食源性活性肽具有安全性高和原料來源廣泛易得的優(yōu)勢，目前在營養(yǎng)和食品科學領(lǐng)域受到高度關(guān)注[12]。近年來，已有研究報道了以各種食源性蛋白制備的抗血栓活性肽，包括大豆蛋白肽[13]、牡蠣蛋白肽[14]和莧菜蛋白肽[15]等，在體外以及動物實驗中均表現(xiàn)出良好的抗凝血效果。在抗血栓治療藥物及功能性食品的研發(fā)領(lǐng)域，食源性抗血栓肽有著廣闊的應(yīng)用前景。本文針對食源性抗血栓肽的蛋白來源、制備分離純化、抗凝血活性評價及作用機制進行綜述，以期為未來深入研究開發(fā)新型抗凝類血栓藥物及血管健康功能性食品提供參考。

1 食源性抗血栓肽的蛋白來源

1.1 食源性抗血栓肽的蛋白來源

蛋白質(zhì)既是人體必需氨基酸的來源也是生物活性肽的來源，具有特殊氨基酸序列的特定肽段被稱為生物活性肽，一旦從母體蛋白中釋放出來就會具有相應(yīng)的生物學效應(yīng)[16]。近年來，血栓導致的心血管疾病的發(fā)病率不斷上升，抗血栓活性肽的研究也逐漸成為熱點。

食源性抗血栓活性肽絕大多數(shù)是從食源性蛋白質(zhì)中通過一定方法提取制備的。根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果，制備食源性抗血栓活性肽的蛋白根據(jù)來源主要分為三大類——動物蛋白、植物蛋白、海洋生物蛋白，其中食源性抗血栓肽的動物蛋白來源包括酪蛋白[17]、藥用水蛭蛋白[18]、雞冠肉蛋白[19]等；植物源抗血栓活性肽的蛋白來源有大豆蛋白[20]、花生蛋白[21]等；海洋源抗血栓活性肽的蛋白來源有牡蠣蛋白[14]、貽貝蛋白[22]、蝦虎魚肌肉蛋白[23]、紫菜蛋白[24]等。Tu Maolin等[25]通過模擬胃腸道消化乳鐵蛋白，在其水解物中鑒定出一種多肽——ENLPEKADRD，該多肽具有體外抗凝血活性。Liu Hanxiong等[17]分離、純化酪蛋白水解物后，對其中具有體外抗血栓活性的組分進行多肽序列鑒定并結(jié)合分子對接技術(shù)評估活性，得到6 種抗凝血多肽（FRQFYQL、NENLLRF、NPWDQVKR、PVVVPPFLQ、PVRGPFPIIV、ARHPHPHLSF）。海洋生物生活在復雜的棲息地并暴露于極端條件下，例如高鹽度、高壓力、低溫度和弱光照，極端環(huán)境條件導致它們會產(chǎn)生多種在其他陸地生物體中未發(fā)現(xiàn)的次生代謝物，與陸地生物蛋白相比，海洋生物蛋白的氨基酸構(gòu)成和序列存在顯著差異[26]，因此海洋生物蛋白具有制備新型生物活性肽的潛力。Jo等[27]從海洋蠕蟲中分離到一種特異性靶向凝血因子FIXa的抑制肽（UAP），并鑒定出其氨基酸序列為GELTPESGPDLFFHFLDGNPSYSLYADAVPR（分子質(zhì)量3 343 kDa），發(fā)現(xiàn)其可有效延長活化部分凝血活酶時間（activated partial thrombin time，APTT）。Cheng Suzhen等[28]從牡蠣蛋白胃酶水解物中分離并鑒定了一種新型食源性抗凝劑七肽（P-3-CG）。由表1可知，目前食源性抗血栓肽主要以動植物蛋白和海洋生物蛋白為原料加工提取。雖然鮮有以食源性微生物蛋白提取抗血栓活性肽的相關(guān)研究，但從食源性微生物蛋白質(zhì)中獲得抗血栓活性肽具有潛在研究價值。

表1 食品蛋白來源的抗血栓肽Table 1 Antithrombotic peptides derived from food proteins

此外，隨著工業(yè)的快速發(fā)展，大量生產(chǎn)廢料產(chǎn)生，例如商業(yè)魚類生產(chǎn)和海產(chǎn)品加工會產(chǎn)生大量含氮廢料，從而造成繁重的處理問題和環(huán)境問題[40]。魚皮內(nèi)臟、肉類生產(chǎn)邊角料等生產(chǎn)廢料富含蛋白質(zhì)，是生產(chǎn)食源性抗血栓肽的低成本蛋白來源，因此，有效利用這些廢料生產(chǎn)有用的適銷產(chǎn)品，可在提高企業(yè)經(jīng)濟效益的同時實現(xiàn)資源的有效利用。

1.2 食源性抗血栓肽的結(jié)構(gòu)特征

抗血栓肽的活性及作用機制與肽的分子結(jié)構(gòu)有一定相關(guān)性，從表1中最長的活性肽序列（GELTPESGPDLF FHFLDGNPSYSLYADAVPR，分子質(zhì)量為3 412.72 Da）與最短活性肽序列（LCR、HCF，分子質(zhì)量分別為390、410 Da）可分析得出，已發(fā)現(xiàn)的食源性抗血栓肽分子質(zhì)量在300～3 500 Da范圍內(nèi)。此外，目前文獻報道的食源性抗血栓肽主要通過抑制凝血酶的活性達到抗凝血效果，所以對表1中具凝血酶抑制作用的食源性抗血栓肽進行結(jié)構(gòu)特征分析，發(fā)現(xiàn)其氨基酸組成占比最高的是脂肪類氨基酸，達到33.59%；其次為酸性氨基酸，占比為18.92%。因此，選擇富含脂肪族氨基酸和酸性氨基酸的蛋白質(zhì)作為抗血栓肽的蛋白來源可能更有優(yōu)勢，例如膠原蛋白富含甘氨酸。對表1中的凝血酶抑制肽的C端氨基酸分析可得：亮氨酸占比最高（14.92%），其次為異亮氨酸、天冬氨酸以及脯氨酸，占比均為10.71%。此外，多肽C端帶有電荷的氨基酸被認為可以影響凝血酶抑制活性或者可以同時參與凝血過程[23]。對表1中肽序列的N端氨基酸進行統(tǒng)計分析可知，谷氨酸與精氨酸出現(xiàn)頻率最高（14.29%），其次為賴氨酸與纈氨酸，出現(xiàn)頻率均為10.71%。α-凝血酶有3 個主要的結(jié)構(gòu)區(qū)域：1 個活性部位和2 個外切酶切點（Exosite-I和Exosite-II）；其中活性部位更傾向結(jié)合帶正電的氨基酸，而2 個外切酶切點則傾向與帶負電的氨基酸結(jié)合[32]。這與谷氨酸（-）、精氨酸（＋）還有賴氨酸（＋）在食源性抗血栓N端的高頻率出現(xiàn)有一定相關(guān)性。此外，凝血酶還會強烈地偏好以精氨酸作為剪切性多肽鍵（P1位）之前的殘基[41-42]。凝血酶的活性部位有4 個特定的結(jié)合位點：S1、S2、S3和S4，其中S1在其底端包含一個天冬氨酸殘基（Asp-189），其作為堿性側(cè)鏈的識別位點；S2位點是圍繞色氨酸殘基（Trp-60D）的插入環(huán)，其封閉了一個疏水位點，可以接受較大的脂肪族殘基，如纈氨酸和脯氨酸；S3位點是平坦的，暴露在溶劑中；S4位點也具有疏水性，包括1 個色氨酸殘基（Trp-215）和2 個脂肪族氨基酸（異亮氨酸殘基（Ile-174）和亮氨酸殘基（Leu-99））[41]。位于食源性抗血栓肽兩端的脂肪族氨基酸（亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸）以及脯氨酸均可能與S2位點結(jié)合從而發(fā)揮抑制作用。

多肽的氨基酸組成與母體蛋白質(zhì)的氨基酸組成有高度相關(guān)性，食源性蛋白質(zhì)多樣性導致研究人員在各種蛋白質(zhì)中尋找抗血栓肽的過程存在一定的盲目性和隨機性，因此，希望通過以上討論為制備食源性抗血栓肽縮小蛋白質(zhì)來源的選擇范圍。

2 食源性抗血栓肽的制備方法

選擇適宜食源性生物活性肽制備方法，必須結(jié)合蛋白來源、制備成本等多方面進行綜合考慮。目前最常見的食源性抗血栓肽制備方法為酶解法、化學合成法以及微生物發(fā)酵法。隨著蛋白質(zhì)組學發(fā)展，近年來也出現(xiàn)了以計算機模擬酶切法為代表的食源性抗血栓肽制備新方法。

2.1 食源性抗血栓肽的常見制備方法

食源性抗血栓活性肽主要通過酶解法獲得，蛋白酶的高度特異性既保證了產(chǎn)物成分的穩(wěn)定性，又能避免最終多肽產(chǎn)物中有毒化學物質(zhì)殘留，使得酶水解成為生產(chǎn)生物活性肽的首選工藝[43]。以特定的蛋白水解酶制劑對蛋白質(zhì)進行酶促修飾以切割特定的肽鍵已經(jīng)被廣泛用于食品工業(yè)[44]。優(yōu)質(zhì)的商業(yè)酶通常從動植物和微生物中提取獲得[44-48]。Zhang Shaobing[21]發(fā)現(xiàn)用堿性蛋白酶制備的花生蛋白水解物具有抗血栓活性，進而使用響應(yīng)面法確定最佳酶解工藝。通過控制酶濃度、pH值、提取溫度、提取時間和料液比不僅能使酶解生產(chǎn)更高效，還能實現(xiàn)可控和可重復的效果[48]。相較于酶解法，微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物活性肽的優(yōu)勢在于無需使用昂貴的蛋白酶，為低成本生產(chǎn)方法。微生物發(fā)酵法是利用微生物生長過程中分泌的蛋白酶水解蛋白質(zhì)，Rojas-Ronquillo等[35]利用干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌對酪蛋白進行發(fā)酵，所得多肽對凝血和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotension converting enzyme，ACE）均有抑制作用。然而，微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物活性肽的工業(yè)化還存在許多問題未克服，包括發(fā)酵多肽得率低、發(fā)酵條件難以控制以及產(chǎn)物多肽品質(zhì)不穩(wěn)定。通過上述兩種制備方法所制備的抗血栓活性肽均具有雜質(zhì)多、純度低的缺點，需要進一步分離純化，而化學合成法是一種對已知氨基酸序列的目標肽段進行定向合成的方法，所獲得的肽純度較高，還可實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，故目前化學合成肽已經(jīng)逐漸成為多肽類抗血栓藥物研發(fā)的常用方法之一[49-50]?；瘜W合成法制備的抗血栓肽常用來探究單一食源性抗血栓肽活性及機制，即已知抗血栓肽氨基酸序列后，通過化學合成法制備高純度的肽以排除其他物質(zhì)影響，有效評估其抗血栓活性強度并研究其作用機制，上述步驟組成了抗血栓活性肽研究的常用技術(shù)路線。

2.2 食源性生物活性肽制備新方法

2.2.1 計算機模擬酶切法

制備食源性抗血栓肽的酶解法需要選擇合適的酶、蛋白質(zhì)底物以及適宜的酶解條件，因此必須進行大量的平行實驗。近年來蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫不斷豐富，例如UniProtKB、NCBI和BIOPEP，其包含可用于分析前體蛋白質(zhì)的氨基酸圖譜和各種蛋白質(zhì)序列。使用在線工具BIOPEP和ExPASy-Peptide Cutter能夠選擇特定的酶和蛋白質(zhì)模擬酶切反應(yīng)，已被廣泛應(yīng)用于新型活性肽的開發(fā)[51]。Cheng Shuzhen等[30]采用ExPASy-Peptide Cutter在線工具，選擇胰蛋白酶對牡蠣肌球蛋白重鏈蛋白進行在線虛擬酶切，將獲得的多肽序列肽段與凝血酶進行分子對接，篩選活性高的序列，結(jié)合胰蛋白酶酶解實驗對酶解產(chǎn)物中的多肽氨基酸序列進行鑒定，證明計算機模擬酶解獲得的活性肽序列可以通過酶解制備獲得。計算機模擬酶解方法的出現(xiàn)可避免傳統(tǒng)酶解法繁瑣的平行實驗及漫長的分離純化步驟，為尋找新的抗血栓肽節(jié)約時間及開發(fā)成本。但需要注意的是由于食源性蛋白種類繁多，目前只有少部分蛋白質(zhì)被測定并明確了氨基酸序列，該方法只能對已完成測序的蛋白質(zhì)進行模擬酶切，存在一定的局限性。

2.2.2 新型輔助提取技術(shù)

當前食源性抗血栓肽主要通過酶解法制備，然而酶的高成本、低產(chǎn)量和食品級酶的種類選擇有限，這都是探索新型抗血栓肽的限制因素。與此同時，新型輔助技術(shù)與酶解法聯(lián)用以制備生物活性肽越來越受人們關(guān)注，例如高靜水壓力、超聲波、歐姆加熱、脈沖電場、微波輔助萃取和亞臨界水水解，通常與酶法結(jié)合使用[52]，可有效地優(yōu)化酶解工藝以提高酶解產(chǎn)物的多肽得率和生物活性。微波輔助萃取和超聲輔助提取技術(shù)[53-54]是當前酶解制備生物活性肽應(yīng)用最為廣泛的輔助技術(shù)?，F(xiàn)有研究已表明，微波輔助萃取可以提高從各種基質(zhì)中所提取生物活性化合物的產(chǎn)量，其機理是通過分子間和分子內(nèi)的摩擦，加上大量帶電離子的運動和碰撞，使反應(yīng)體系迅速升溫，從而導致細胞壁和細胞膜的破壞[55]。超聲輔助技術(shù)在食品加工中的輔助提取效果是通過3 種機制實現(xiàn)的，包括空穴效應(yīng)、熱效應(yīng)和機械效應(yīng)，其協(xié)同形成綜合效應(yīng)對細胞壁進行破壞，從而實現(xiàn)高效提取細胞內(nèi)容物[56]。目前已有微波和超聲輔助提取生物活性肽的研究報道，如Mala等[53]使用超聲輔助提取和微波輔助提取從而更高效地從菠蘿副產(chǎn)品中提取抗氧化肽；Yang Lihua等[46]利用超聲輔助雙酶水解法提取牛骨低分子肽，在提高牛骨肽產(chǎn)率的同時，也提高了酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。綜上，新技術(shù)應(yīng)用于食源性抗血栓肽研究領(lǐng)域具有實際可行性以及潛在研究價值。

3 食源性抗血栓肽的分離純化及序列鑒定

含有生物活性多肽的蛋白水解物和發(fā)酵液的成分組成通常非常復雜，因此很難明確混合物中的哪種多肽具有特定的生物活性[57]。必須采用分離技術(shù)來降低水解物和發(fā)酵液的組成復雜性，以便對目標多肽進行鑒定[58]。從上述對抗血栓肽結(jié)構(gòu)的討論可知，具有抗血栓活性的肽一般為300～3 500 Da范圍內(nèi)的小分子，因此通常使用沉淀法及膜過濾對粗產(chǎn)物進行初步分離純化。再根據(jù)目標物的電荷性、極性、分子質(zhì)量等性質(zhì)，利用色譜分離技術(shù)逐級分離純化出寡肽[59]。離子交換色譜、凝膠層析色譜、反相高效液相色譜都是食源性抗血栓肽常用的分離技術(shù)。隨著質(zhì)譜分析技術(shù)在生物領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用，分離技術(shù)與質(zhì)譜分析聯(lián)用對純化后抗血栓肽的氨基酸序列進行鑒定已成為多肽結(jié)構(gòu)分析的常用方法。Jung等[22]使用凝膠過濾柱分離得到目標活性肽組分，采用電噴霧電離質(zhì)譜對純化后的貽貝抗凝多肽進行序列鑒定。Chen Fangyuan等[39]使用離子交換色譜柱分離得到目標組分后，利用凝膠層析色譜柱收集高活性組分，對其進行反相高效液相色譜洗脫，再使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定洗脫成分的多肽序列結(jié)構(gòu)。實際上分離純化技術(shù)各有優(yōu)勢與不足，例如：凝膠過濾色譜分離技術(shù)在操作過程中有丟失抗血栓活性組分的可能性，且凝膠填料的使用成本高，不適宜商業(yè)化生產(chǎn)；而反向高效液相色譜技術(shù)雖然分離效果顯著，但受限于使用成本高及高污染性等問題，只能在實驗室規(guī)模研究使用。所以為了達到預(yù)期的分離純化效果，需要按實際需求對不同分離技術(shù)進行組合搭配。

4 食源性抗血栓肽的活性評價

抗血栓肽活性通常從3 個方面進行探究：抗凝血、抑制血小板聚集和促進栓溶。例如Liu Hui等[60]從鮭魚皮膠原蛋白水解物中發(fā)現(xiàn)了抑制血小板聚集的多肽，Ren Yao等[18]從寬體金錢蛭的蛋白水解物中發(fā)現(xiàn)了能夠促進栓溶的多肽。根據(jù)目前研究結(jié)果顯示，在已知的食源性抗血栓肽中，具有抗凝血活性的肽數(shù)量遠多于具有另外兩種活性的肽數(shù)量。因此食源性抗血栓肽在抗凝血方面的研究相對深入，并在活性評價方面已有較為成熟的技術(shù)路線，常見的抗凝血評價分為體外評價和體內(nèi)評價2 個方面。隨著生物信息學的發(fā)展，近年來出現(xiàn)了第3種可靠的活性評價方法，主要是從分子水平進行定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）的模型擬合或結(jié)合分子對接技術(shù)等利用計算機分析預(yù)測多肽活性。

4.1 食源性抗血栓肽體外抗凝血活性評價

4.1.1 凝血途徑的體外抑制活性評價

凝血四項是體現(xiàn)抗凝劑對凝血途徑抑制活性的常用檢測指標，包括APTT、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）與纖維蛋白原時間（fibrinogen time，F(xiàn)IB）。其中APTT用于反映內(nèi)源性凝血途徑，若僅延長APTT，應(yīng)考慮抑制內(nèi)源性凝血因子FVIII、FIX、FXI或FXII的活性；PT反映外源性凝血途徑，PT延長通常是由于凝血因子FVII活性受到影響：TT與FIB都能反映凝血級聯(lián)共同途徑中的凝血因子FV、FX、FII和FI活性受抑制的情況，共同途徑受抑制還會導致APTT延長，因此APTT通常與TT、FIB的結(jié)果進行對比分析[31]。Ktari等[61]發(fā)現(xiàn)分離、純化后的斑馬肌肉酶解物F1組分對APTT和PT有延遲效果，說明F1的抗凝血活性途徑為內(nèi)源性凝血途徑及外源性凝血途徑。雖然凝血四項方法成熟、實驗省時且可信度高，但無法明確抗血栓活性肽對凝血因子的靶向作用機制，僅能反映所抑制的凝血途徑，這是凝血四項的使用局限性。此外，需要注意的是，凝血四項以血清作為主要反應(yīng)溶劑，而不同來源血清的質(zhì)量差異對實驗數(shù)據(jù)有較大影響。

4.1.2 對凝血酶及其他凝血因子體外抑制活性評價

測定凝血酶抑制率最早出現(xiàn)的兩種方法為滴定法與發(fā)色底物法[62-63]。滴定法操作簡單但靈敏性不佳，實際應(yīng)用不多。發(fā)色底物法因具有高靈敏度的特點被廣泛應(yīng)用于凝血酶及其他凝血因子的抑制效果測定；選擇加入凝血因子對應(yīng)的發(fā)色底物：FIIa-S2238、FXa-S2765/S2222/S2732、FXIIa-S2302、FXIa-S2366、FVIIa-S2288，使顯色基團從底物中釋放，其顯色程度與抑制活性呈正相關(guān)，由此明確樣品靶向抑制凝血因子的肽及抑制強度[64]。但鑒于各種發(fā)色底物價格昂貴，Yang Wangen等[65]在凝血酶發(fā)色底物法的基礎(chǔ)上進行改良，建立了測定凝血酶抑制活性的分光光度法，原理為在纖維蛋白原底物中加入抗凝劑樣品和凝血酶，在405 nm波長處反應(yīng)前后吸光度差值與凝血酶活性成正相關(guān)。雖然該方法的標準曲線有效值范圍有限，但其有較好的穩(wěn)定性與經(jīng)濟性，是食源性抗凝血肽活性評價及初步機制探究的高性價比選擇。表2分類總結(jié)了近年來食源性抗血栓肽體外抗凝血活性評估常見方法及其優(yōu)缺點，今后研究人員可根據(jù)實際實驗需求選擇適當?shù)姆椒▉碓u估活性肽的體外抗凝血效果。

表2 食源性抗血栓肽體外抗凝血活性評價常見方法Table 2 Common methods for in vitro anticoagulant activity evaluation of food-derived antithrombotic peptides

此外，凝血酶與抑制肽之間的相互作用也可以通過其他非標記分析和檢測方法來分析，如等溫滴定量熱法[68]、靜態(tài)光散射法[69]、動態(tài)光散射法[70]、聚丙烯酰胺凝膠電泳法[71]、生物膜干涉法[72]、表面等離子體共振法[70]等。以上方法只能用于確定抑制肽是否與凝血酶結(jié)合，而不能推斷它們之間的結(jié)合部位和作用力，因此使用化學結(jié)構(gòu)分析技術(shù)如X射線晶體衍射或分子對接技術(shù)，對明確凝血酶抑制劑復合體結(jié)構(gòu)信息及作用機理至關(guān)重要[73]。

4.2 食源性抗血栓肽體內(nèi)活性驗證

以化學藥物誘導法構(gòu)建動物血栓模型進行藥物體內(nèi)實驗具有可靠性和重復性好的特點，食源性抗血栓肽研究中常用的模型包括：角叉菜膠誘導鼠尾靜脈血栓模型（炎癥性血栓）、凝血酶誘導急性肺栓塞模型（內(nèi)源性血栓）、膠原暴露誘導頸動脈血栓模型（損傷性血栓）等。

4.2.1 角叉菜膠誘導鼠尾靜脈血栓模型

角叉菜膠也被稱作卡拉膠，是由D-半乳糖和3,6-脫水-D-半乳糖重復單元組成的直鏈含硫大分子多糖。建造模型的方法通常為：室溫環(huán)境下將一定劑量的角叉菜膠生理鹽水溶液注入小鼠腹腔，造模6～12 h內(nèi)小鼠尾尖出現(xiàn)暗紅色血栓并逐漸向尾根擴大，24 h左右血栓區(qū)域趨于穩(wěn)定，觀察小鼠尾動脈血栓發(fā)生率并測量血栓長度[74]。該模型具有簡便快捷、成本低的優(yōu)點，已應(yīng)用于多種動物的血栓模型建立。為了提高了動物實驗造模成功率及模型的穩(wěn)定性，Hagimori等[75]通過簡單的結(jié)扎來改變大鼠的血流動性，顯著改善了靜脈注射β-卡拉膠后血栓形成的頻率和體征，特別是當1 mg/kgmb角叉菜膠注射與尾部結(jié)扎10 min相結(jié)合，使大鼠血栓形成率增加到近100%。Arslan等[76]通過角叉菜膠誘導的鼠尾血栓模型證實了山楂提取物在小鼠體內(nèi)具有抑制血栓形成的效果。

4.2.2 凝血酶誘導急性肺栓塞模型

肺栓塞主要由深靜脈血栓（deep venous thrombosis，DVT）引起。DVT形成于下肢的大靜脈和深靜脈血管，隨著血液流動進入肺血管中引發(fā)肺栓塞，使人體表現(xiàn)出慢性血栓栓塞性肺動脈高壓病理狀態(tài)[77]。靜脈注射凝血活酶可使血液達到高凝狀態(tài)，常用于誘導DVT形成，進而引發(fā)動物急性肺栓塞，可利用其構(gòu)建肺栓塞模型[78]。適度調(diào)節(jié)凝血活酶注射劑量，可使不同動物體內(nèi)形成DVT具有可控性和穩(wěn)定性。Cheng Shuzhen等[28]使用凝血酶靜脈注射誘發(fā)小鼠急性肺栓塞建立動物實驗?zāi)Ｐ停l(fā)現(xiàn)凝血酶組的小鼠死亡率最高（87.5%），幸存的小鼠在5 min內(nèi)出現(xiàn)癱瘓，灌胃牡蠣肽（P-3-CG）的對照組小鼠生存率為100%，肺部的組織學研究表明，凝血酶組小鼠的肺中形成了大量致命的大血塊，而對照組的肺中只有少部分小的血塊，證明P-3-CG可通過抗凝血抑制急性肺栓塞發(fā)生，從而顯著提高小鼠的存活率。

4.2.3 膠原暴露誘導頸動脈血栓模型

膠原蛋白是一種強烈的血栓刺激物質(zhì)，通過直接和間接與各種血小板受體結(jié)合發(fā)揮作用。血管組織中已發(fā)現(xiàn)了幾種膠原蛋白（例如I型、III型、IV型）[79]。該動物模型是用FeCl3溶液外敷血管致血管損傷，利用血管壁組織中膠原蛋白暴露誘發(fā)血小板黏附集聚，并與凝血級聯(lián)反應(yīng)協(xié)同作用形成混合型血栓[80]。FeCl3溶液外敷法建立動物血栓模型簡便易行，不同動物、不同血流量的血管所需FeCl3濃度和外敷時間不同，必要時可將FeCl3外敷法與制作狹窄血管或完全阻止血流結(jié)合起來提高建模成功率[81]。鄭媛媛等[38]為探究雙齒圍沙蠶抗凝血肽（anticoagulant peptides fromPerinereis aibuhitensis，PAAP）體內(nèi)活性，建立了小鼠頸動脈血栓模型，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，高劑量PAAP灌胃的大鼠組頸動脈中血栓塊質(zhì)量顯著下降，表明PAAP對血栓形成有抑制作用且存在劑量效應(yīng)。

近年來，血栓性疾病模型越來越復雜多樣，盡管沒有單一的動物模型能夠完全反映人類血栓栓塞性疾病的所有臨床特征和病理特征，但是每種動物模型都有助于更好地理解各種血栓性疾病的發(fā)生過程和生理機制。為了客觀、真實地反映實驗動物體內(nèi)血栓疾病發(fā)展程度，不能僅以分析疾病導致的動物體征變化作為依據(jù)，還需結(jié)合疾病部位組織學、病理學特征，并從基因水平和蛋白水平等方面來對病情程度做出更加確切的判斷，為抗凝藥物評價提供依據(jù)。

4.3 食源性抗血栓肽計算機預(yù)測活性評價

結(jié)構(gòu)特性對食源性多肽針對各種分子疾病靶點的特定生物活性有很大影響，如鏈長和理化特性（包括氨基酸殘基的疏水性、分子電荷和側(cè)鏈的膨脹性）[82]?；谶@些多肽特征，研究人員開發(fā)了一系列預(yù)測多肽活性的方法，如在線軟件Peptide Ranker、QSAR建模和分子對接等[51]。目前根據(jù)多肽結(jié)構(gòu)進行抗血栓活性預(yù)測主要從3 個方面開展：多肽序列比對、多肽分子結(jié)構(gòu)比對以及分子對接。Feng Liting等[37]對從貽貝蛋白水解物鑒定得到的39 條多肽與凝血酶（PDB：2BVR）進行分子對接結(jié)合能分析并與本地數(shù)據(jù)庫中已知的抗血栓多肽進行序列同源性比對，通過多肽構(gòu)效關(guān)系分析其潛在抗血栓活性，結(jié)合分子對接非鍵相互作用進行多方面評估，預(yù)測結(jié)果顯示貽貝抗凝血肽Peptide26（KNAENELGEVTVR）和Peptide 36（NAESLRK）具有較高抗血栓活性及研究價值。Cheng Shuzhen等[28]在凝血酶-牡蠣肽（P-3-CG）分子對接復合體中發(fā)現(xiàn)了10 個可能結(jié)合凝血酶活性部位的位點，進而分析了凝血酶抑制活性的生化機制。

盡管分子對接、QSAR等作為新方法已廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)設(shè)計、發(fā)現(xiàn)和分析研究中，但還需根據(jù)豐富的理論基礎(chǔ)輔以有效的運算模型設(shè)計，進一步提高活性預(yù)測的準確性[51]。雖然現(xiàn)有研究結(jié)果已表明以上方法用于預(yù)測活性具有較高可信度，但結(jié)合體內(nèi)外實驗進行活性評價仍是不可或缺的環(huán)節(jié)。

5 食源性抗血栓肽的抗凝血機制

5.1 凝血級聯(lián)反應(yīng)

凝血是人體中一種重要的自我保護機制，凝血系統(tǒng)和抗凝血系統(tǒng)在正常生理狀態(tài)下保持著動態(tài)平衡。一旦受傷失血的情況發(fā)生，凝血因子被迅速激活從而使血液凝結(jié)來防止其過量流失。凝血反應(yīng)有兩個起始途徑，分為內(nèi)源性凝血和外源性凝血，二者區(qū)別在于凝血因子X被激活的途徑不同。外源性途徑啟動于血管損傷膠原暴露，隨后組織因子（tissue factor，TF）釋放與磷脂表面的凝血因子FVIIa結(jié)合形成一個復合體，該復合體進一步介導激活FIX和FX分別為FIXa和FXa。內(nèi)源性途徑起始于FXII和FXI的活化，F(xiàn)XIIa介導FXI活化為FXIa的激活反應(yīng)，然后FIX在FXIa的作用下被激活為FIXa，在磷脂表面的FIXa與其輔助因子FVIIIa一起形成酶復合體，并介導FX的激活反應(yīng)?？梢妰煞N途徑的目的均為激活凝血因子FX進入共同的凝血途徑，最終激活凝血因子FII，即凝血級聯(lián)的最終產(chǎn)物凝血活酶使得溶于血清的纖維蛋白原被凝血活酶活化形成不溶的網(wǎng)狀纖維，該網(wǎng)狀纖維攔截紅細胞的同時，血小板黏附于其上共同形成血栓。外源性凝血途徑、內(nèi)源性凝血途徑和共同凝血途徑被合稱為凝血級聯(lián)反應(yīng)，凝血級聯(lián)反應(yīng)的具體機制見圖1。

圖1 凝血級聯(lián)反應(yīng)：食源性抗血栓肽的抗凝血作用機制Fig.1 Coagulation cascade: anticoagulant mechanism of food-derived antithrombotic peptides

5.2 食源性抗血栓肽的抗凝血機制

5.2.1 食源性抗血栓肽靶向凝血酶的抑制機制

凝血酶是人體凝血系統(tǒng)中的一種絲氨酸蛋白酶，即凝血級聯(lián)反應(yīng)所活化的最末端凝血因子（FIIa），凝血酶活化后將可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性纖維蛋白并與血管內(nèi)皮細胞表面的蛋白酶激活受體（proteaseactivated receptor，PAR）1/3結(jié)合，激活血管內(nèi)皮細胞，從而激活部分凝血因子，進而誘導血小板聚集快速形成血栓[33]。因此，抑制凝血酶的活性從而阻礙不溶性纖維蛋白形成可有效抑制血栓的形成。但凝血酶活性的調(diào)節(jié)是通過一個復雜的機制實現(xiàn)的，除了可作用于活性部位外，還可作用于2 個外切酶切點——Exosite-I和Exosite-II。Chen Fangyuan等從黃粉幼蟲蛋白酶解產(chǎn)物中分離純化得到樣品由2 種抗血栓肽（SLVDAIGMGP和AGFAGDDAPR）組成，樣品質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時的凝血酶抑制率為28.66%，結(jié)合QSAR建模比對分析，預(yù)測這兩種多肽可能與凝血酶的Exosite-I相互作用，這是它們有效抑制凝血酶活性的原因[39]。Xu Shiqi等[33]對乳鐵蛋白多肽LRPVAAEIY進行分子對接發(fā)現(xiàn)，該多肽既能與凝血酶的活性部位結(jié)合，又能與凝血酶的Exosite-I結(jié)合，以此抑制凝血酶活性阻礙血栓形成。

5.2.2 食源性抗血栓肽介入凝血級聯(lián)的抑制機制

凝血級聯(lián)反應(yīng)物質(zhì)由各級凝血因子組成，一系列凝血因子的活化反應(yīng)之間呈現(xiàn)為前一凝血因子活化后能夠參與下一個凝血因子的酶促反應(yīng)并逐級放大。Jung等[22]從紫貽貝的可食部分中分離到一種抗凝寡肽（MEAP），該肽能夠與凝血因子FIX、FX和FII特異性地相互作用，可抑制FIX對FX的激活作用，進而抑制凝血酶原酶復合體在劑量依賴反應(yīng)中形成FIIa，從而發(fā)揮抑制凝血的效果。Rajapakse等[83]利用黃鰭魚分離得到抗凝單鏈蛋白（YAP），YAP是通過與FXIIa形成一個失活的大復合體而不是裂解FXIIa來實現(xiàn)抗凝血效果。Jung等[84]從海洋蠕蟲中分離到一種特異性FIXa因子抑制肽（UAP）。UAP通過與FIXa結(jié)合阻礙FIXa參與FX轉(zhuǎn)化為FXa的活化反應(yīng)，從而延長凝血時間。食源性抗血栓肽與各種凝血因子在分子層面相互作用，阻礙凝血級聯(lián)反應(yīng)的逐級放大效應(yīng)，從而延緩或抑制凝血作用。

抗凝策略一直是血栓栓塞癥優(yōu)先考慮的防治方向[85]?，F(xiàn)有文獻報道的食源性抗血栓肽主要通過靶向抑制FIIa活性和介入凝血級聯(lián)反應(yīng)兩種機制實現(xiàn)抗凝血效果。凝血系統(tǒng)是一個復雜的調(diào)節(jié)體系，不同凝血因子對凝血反應(yīng)都發(fā)揮著其獨特的作用，從凝血反應(yīng)的分子層面認識抗血栓肽作用機制，對靶向性抗凝治療策略的發(fā)展有著重要的意義。近年來，傳統(tǒng)的VK拮抗劑正在被直接口服抗凝劑（direct oral anticoagulants，DOAC）所取代。DOAC通過靶向抑制FXa或FIIa的活性實現(xiàn)抗凝血效果，但是FXa和FIIa在抗凝血機制和正常止血反應(yīng)中都發(fā)揮著重要作用，所以抑制FXa或FIIa活性在有效預(yù)防血栓形成的同時也導致病人止血功能變差[86]。由于功能性食品具有抗凝血功能物質(zhì)，能夠在安全范圍內(nèi)調(diào)節(jié)血液凝結(jié)趨勢的同時規(guī)避副作用的風險，因此利用靶向抑制FIIa的食源性抗血栓肽開發(fā)預(yù)防血栓疾病的功能性食品或許是更好的選擇。而對于日益增長的患有合并癥的人群來說，他們需要不僅能抗凝血預(yù)防血栓且不影響正常止血功能的抗血栓藥物[87]。由于FXI和FXII在血栓形成的機制中發(fā)揮重要的作用，但它們對止血反應(yīng)來說卻是可有可無的，所以靶向抑制FXI或FXII的活性可能會在不影響止血的情況下實現(xiàn)防治血栓的效果，因此FXI和FXII已成為新的抗凝治療靶點[88]。所以通過介入凝血級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮靶向性抗凝血作用的食源性抗血栓肽更適用于新型抗凝藥物的研發(fā)。此外，目前處于在研發(fā)階段的新型抗凝靶向藥包括FXII/FXIa抑制劑、FIX/FIXa抑制劑和內(nèi)源性FXase抑制劑[86]。明確食源性抗血栓肽的作用機制，才能根據(jù)其特性開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品，提高食源性抗血栓肽進行科研成果轉(zhuǎn)化的潛在價值，促進食源性抗血栓肽的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

6 結(jié) 語

近年來，人們不斷探究新的抗血栓生物活性肽，以期能開發(fā)降低疾病發(fā)生風險的特醫(yī)食品和保健食品。但實際上食源性抗血肽從科研成果轉(zhuǎn)化為可供消費者購買的藥品、保健食品或功能食品等商業(yè)產(chǎn)品的進展相對滯后，仍需要深入且有針對性的研究以解決產(chǎn)品研發(fā)過程中所面對的實際難題：1）目前尋找新型食源性血栓肽時傳統(tǒng)上通過分離、純化再鑒定的方法需要耗費大量時間，所以在條件允許的情況下應(yīng)有效利用生物學信息方法，以實現(xiàn)高效且全面地篩選抗血栓活性肽序列；同時，為了設(shè)計可持續(xù)且規(guī)模化的食源性抗血栓肽生產(chǎn)方案，需要合理利用新技術(shù)（如高靜水壓力、亞臨界水解）從而實現(xiàn)高效生產(chǎn)。2）對于大部分食源性抗血栓肽只完成體外實驗驗證以及通過蛋白質(zhì)組學分析工具闡明活性機制，在很大程度上忽略了多肽存在體內(nèi)吸收效率低的問題，且具有在體內(nèi)消化過程中失去活性的可能性。針對以上情況還需要補充體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)進行驗證，并結(jié)合新型活性物質(zhì)載體技術(shù)（微膠囊、乳液包埋、天然聚合物、納米載體等）對其進行消化穩(wěn)定性、生物利用度優(yōu)化。3）也有少數(shù)食源性抗血栓肽進行了動物模型的體內(nèi)活性驗證，但仍缺乏人體內(nèi)藥代動力學、細胞通路、代謝組學的機理相關(guān)研究，即食源性抗血栓肽研究缺乏完整的臨床試驗數(shù)據(jù)為其有效性和未來產(chǎn)品的健康益處提供實質(zhì)性證據(jù)。此外，若食源性抗血栓肽在組分復雜的粗水解液中穩(wěn)定表現(xiàn)其抗血栓效果，在不影響安全性的條件下使用粗水解物配制功能性食品配方，不失為是一種降低產(chǎn)品生產(chǎn)難度的選擇。

本文從蛋白來源、制備方法、分離純化和序列鑒定、活性評價以及活性機制，多方面總結(jié)食源性抗血栓肽的研究進展，在提出展望的同時指出食源性抗血栓肽目前面臨的挑戰(zhàn)，以期為血栓栓塞性疾病的防治和新型抗凝劑的研發(fā)提供新思路?？v然食源性抗血栓肽由實驗階段向商業(yè)化轉(zhuǎn)變面臨各種難題亟待解決，相信隨著今后研究的深入，未來會有科研成果成功轉(zhuǎn)化為食源性抗血栓肽產(chǎn)品面世。