王雨亭，王 淼，李元敬，施樹良，雷 虹,*，馮 磊*

（1.黑龍江大學生命科學學院，農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江省寒地生態(tài)修復與資源利用重點實驗室，黑龍江省普通高校分子生物學重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.華南師范大學材料與新能源學院，廣東 汕尾 516600；3.哈爾濱工業(yè)大學生命科學與技術學院，黑龍江 哈爾濱 150001；4.黑龍江省林業(yè)科學院科研處，黑龍江 哈爾濱 150081）

缺鐵性貧血（iron deficiency anemia，IDA）嚴重影響機體健康，可導致結腸組織中黏膜潰瘍、氧化應激增加和炎性細胞浸潤[1]，產(chǎn)生過多且具有強氧化活性的自由基，引起細胞膜、DNA分子堿基修飾等多種氧化損傷，從而導致潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）甚至更嚴重的結腸癌發(fā)生[2]。誘導UC疾病的臨床癥狀多表現(xiàn)為體質量下降、腹瀉、便血等情況[3]。目前，對于炎癥性腸病的治療多采用氨基水楊酸等藥劑，但長期服用副作用較大[4]。一些天然產(chǎn)物具有極佳的抗氧化、抗炎效果，有研究表明，天然產(chǎn)物15,16-二氫丹參酮I可通過改善氧化應激能力及抗炎活性等改善UC[5]?？嗍徧崛∥锞哂幸欢ǖ目寡椎壬锘钚訹6]。綜上，天然產(chǎn)物可能是一種改善IDA誘導UC潛在的安全有效新藥物。

黑木耳是一種在我國分布極為廣泛且具有獨特營養(yǎng)價值與保健功能的食用菌[7]，被證實具有免疫調節(jié)、抗氧化等作用[8-9]，根據(jù)本課題組的前期研究，從黑木耳中提取的黑色素以吡咯環(huán)和吲哚環(huán)為骨架，骨架上連接著脂肪碳鏈和羰基，大量聚合后形成不規(guī)則的單體，且在207 nm波長處有強吸收峰，由元素組成結果可以得到黑木耳黑色素中真黑色素與棕黑色素的含量比為10.36∶1.00[10]，與球狀蜣螂殼黑色素結構[11]基本一致，說明天然黑色素結構具有較高的相似性。黑色素作為黑木耳的主要天然產(chǎn)物之一，具有清除自由基、抗炎、抗氧化、抗病毒及增強免疫力等多種生物功效[12-14]。研究表明，墨魚黑色素可以改善機體炎癥浸潤、清除自由基并改善氧化應激損傷，最終減緩UC的發(fā)生[15]，本課題組前期實驗結果表明，IDA可導致腸道損傷，而黑木耳黑色素可改善IDA小鼠的貧血癥狀，并修復腸道損傷[16-17]，然而黑木耳黑色素對IDA誘導的小鼠UC保護作用機制尚不清楚。

許多天然產(chǎn)物具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等特性[18]，且可通過調控Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，T L R 4）/核轉錄因子-κ B（n u c l e a r f a c t o rk a p p a B，N F-κ B）信號通路來抑制炎癥發(fā)生[19]，但有關利用天然產(chǎn)物黑木耳黑色素治療UC的研究相對較少，因此，本研究通過IDA誘導UC小鼠模型，探究灌胃黑木耳黑色素對UC小鼠氧化應激反應及TLR4/NF-κB信號通路的調控作用，以期為黑木耳黑色素功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級昆明種雄性小鼠，購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部，生產(chǎn)許可證號：SCXK（黑）2019-001。

黑木耳購自東寧黑木耳產(chǎn)業(yè)基地（菌種保藏號：CCTCC-HDX）。

濃鹽酸 哈爾濱理工化學試劑有限公司；氫氧化鈉天津市大陸化學試劑廠；氯仿、異丙醇 天津市科密歐化學試劑有限公司；乙酸乙酯、無水乙醇 天津市富宇精細化工有限公司。以上試劑均為分析純。

總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、羥自由基（·OH）檢測試劑盒、小鼠超氧陰離子自由基（O2-·）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；TRIzol、反轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 江蘇康為世紀生物科技股份有限公司；糞便隱血定性檢測試劑盒 上海尚寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JE3002型電子分析天平 上海浦春計量儀器有限公司；BCM-1000A型生物潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；H2050R型臺式高速離心機 美國Thermo Sorvall公司；Elx800uv型酶標儀 美國Gene公司；NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計 美國Thermo Scientific公司；QuantStudioTH1型熒光定量PCR儀 哈爾濱覆霜科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳黑色素的制備

參考Zou Yu等[20]的實驗方法，黑木耳粉碎后過80 目篩，取25 g黑木耳粉末于500 mL 3 mol/L鹽酸中，70 ℃下水浴攪拌浸提1.0～1.5 h后加入15.6 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至12，4 000 r/min離心10 min。上清液用12 mol/L鹽酸調節(jié)pH值至2，4 000 r/min離心20 min，沉淀即為黑色素粗品。粗品通過氯仿、乙酸乙酯和乙醇試劑依次洗滌兩次，去離子水洗滌5～7 次，所得固體冷凍干燥得到純化的黑色素[21]，實驗室前期采用原子吸收法測定黑木耳黑色素中鐵元素的含量為（2.03±0.49）mg/kg[17]。

1.3.2 低鐵飼料的配制

參照AIN-93G標準配方，委托北京科澳協(xié)力飼料有限公司加工低鐵飼料，成分如表1所示，加工配制的飼料由北京譜尼測試集團采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductively coupled plasma atomic emission spectrometer，ICP-AES）測得其含鐵量為4.98 mg/kg，符合低鐵飼料要求（＜5 mg/kg），普通飼料含鐵量為116.12 mg/kg[22]。

表1 動物低鐵飼料成分Table 1 Ingredients of low-iron diet

1.3.3 實驗動物分組及模型建立

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范實施手冊》中的具體操作方法[23]，選取24 日齡昆明種雄性小鼠，隨機分為3 組，每組15 只，分別為空白對照組、模型組、黑木耳黑色素組。適應性喂養(yǎng)1 周后開始實驗，空白對照組小鼠整個實驗周期始終飼喂正常飼料，自由飲用雙蒸水。模型組、黑木耳黑色素組小鼠飼喂低鐵飼料，自由飲用去離子水，造模時間為2 周。實驗治療期，黑木耳黑色素組小鼠持續(xù)3 周進行黑色素灌胃處理；模型組小鼠喂養(yǎng)方式與造模期間相同。為避免外源鐵污染，實驗采用塑料籠體和非鐵質籠蓋。自實驗開始，每7 d稱一次體質量。

實驗動物飼養(yǎng)：動物實驗室所有的設施條件與管理任務均依照《中華人民共和國衛(wèi)生部實驗動物環(huán)境及設施標準》進行，溫度（20±2）℃、相對濕度45%～65%，自動控制系統(tǒng)進行12 h的日夜光照更替。

1.3.4 全血血液指標檢測

對小鼠眼球進行采血，將40 μL血液加入至360 μL肝素鈉生理鹽水中，利用血細胞自動分析儀檢測并記錄血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、紅細胞（red blood cell，RBC）、白細胞（white blood cell，WBC）水平。

1.3.5 疾病活動指數(shù)評分

記錄各組小鼠體質量變化率，觀察大便性狀及大便隱血等情況，參照Murthy等[24]的評分系統(tǒng)進行疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分，糞便性狀分為3 個等級：正常、松散和稀便。小鼠正常糞便成型，為顆粒狀；若糞便黏度增加且易散，但不黏附于肛門，則為松散；若糞便不成形或呈稀水樣，且黏附于肛門，則為稀便；利用糞便隱血定性檢測試劑盒檢測糞便隱血陽性，若糞便中加入試劑后出現(xiàn)藍色，則為隱血陽性；若糞便肉眼可見有紅褐色或鮮紅色血液，則為肉眼血便。具體評分標準見表2。按公式（1）計算DAI評分。

表2 DAI評分標準Table 2 Disease activity index (DAI) scoring criteria

1.3.6 器官指數(shù)測定

將小鼠處死后，對小鼠肝臟、脾臟、心臟進行快速分離及稱質量，按公式（2）計算器官指數(shù)[25]。

1.3.7 組織病理學分析

快速解剖小鼠后，將結腸組織經(jīng)甲醛固定，制備成石蠟塊，切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后在顯微鏡下觀察結腸組織損傷變化。通過判斷炎性細胞浸潤、上皮損傷、隱窩丟失的程度對炎癥程度進行鑒定[26]。參考朱磊等[27]的方法進行組織病理學評分，具體評分標準見表3。

表3 結腸組織病理學評分標準Table 3 Colonic histological evaluation criteria

1.3.8 氧化應激生物標志物水平測定

分離小鼠結腸，保存在-80 ℃條件下，用相應試劑盒測定TAC、MDA、SOD、·OH、O2-·的水平。

1.3.9 熒光定量PCR檢測炎癥因子及相關基因相對表達量

利用T R I z o l 試劑提取結腸組織總R N A。使用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit合成cDNA。使用2×Realstar Green Fast Mixture with ROX II進行熒光定量PCR。擴增條件為：預變性溫度95 ℃，2 min；變性溫度95 ℃，15 s；退火溫度60 ℃，15 s；延伸溫度72 ℃，30 s，40 次循環(huán)。相對mRNA水平歸一化為內源性控制基因β-Actin。采用比較閾值循環(huán)（Ct）法分析基因的相對表達量。本實驗使用引物如表4所示。

表4 TLR4、NF-κB-p65、TNF-α、IL-10的mRNA引物序列及片段長度Table 4 mRNA primer sequences and fragment lengths of TLR4,NF-κB-p65, TNF-α, and IL-10

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應用Graphpad Prism 9軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理并作圖。樣本平均值采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗。P＜0.05表明數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 黑木耳黑色素對IDA誘導的UC小鼠血液指標的影響

臨床貧血癥狀可通過血液中的Hb、RBC、WBC等水平來診斷[28]。如圖1A、B所示，與空白對照組相比，模型組小鼠Hb質量濃度、RBC數(shù)均顯著降低（P＜0.000 1，P＜0.01），灌胃黑木耳黑色素3 周后，Hb質量濃度、RBC數(shù)顯著提高（P＜0.000 1，P＜0.01），且與空白對照組無顯著差異（P＞0.05），表明黑木耳黑色素具有改善機體貧血的功效。與空白對照組相比，模型組小鼠WBC數(shù)顯著下降（P＜0.000 1），黑木耳黑色素干預組小鼠的WBC數(shù)顯著恢復（P＜0.000 1）（圖1C），表明缺鐵引起的IDA小鼠可能存在攝入營養(yǎng)不均衡，導致WBC數(shù)偏低，說明免疫系統(tǒng)的能力降低，易引發(fā)結腸炎癥[29]，研究表明，IDA小鼠常伴隨著腸道損傷[16]，灌胃黑木耳黑色素后小鼠WBC數(shù)恢復正常，說明加入黑色素可有效提高IDA小鼠的免疫能力，緩解結腸炎癥。

圖1 黑木耳黑色素對IDA誘導的UC小鼠血液中Hb（A）、RBC（B）和WBC（C）水平的影響Fig.1 Effect of Auricularia auricula melanin on hemoglobin (A), red blood cell (B) and white blood cell (C) levels in blood of IDA-induced UC mice

2.2 黑木耳黑色素對IDA誘導的UC小鼠體質量變化及DAI評分的影響

在實驗過程中，空白對照組小鼠行動活躍、毛發(fā)光亮整潔；模型組小鼠出現(xiàn)了行動緩慢、活動力下降等現(xiàn)象，但給藥后小鼠在反應、行動等方面均有改善。由圖2A可知，實驗結束時，與模型組相比，給藥后的小鼠體質量顯著增加（P＜0.001），且與空白對照組小鼠相比無顯著差異（P＞0.05），結果表明，影響小鼠體質量生長的因素可能與機體結腸損傷影響食物的消化吸收有關[30]，黑木耳黑色素可使小鼠胃腸消化吸收功能逐漸恢復，從而使結腸受損的模型小鼠體質量恢復至正常水平。

圖2 黑木耳黑色素對IDA誘導的UC小鼠體質量（A）及DAI評分（B）的影響Fig.2 Effect of Auricularia auricula melanin on body mass (A) and DAI score (B) in IDA-induced UC mice

DAI評分可用來評判結腸炎癥的損傷程度，DAI評分越高，說明疾病越嚴重[31]，UC能引起小鼠體質量增長緩慢、糞便特征異常及伴隨便血等癥狀[32]。相關研究發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物芍藥提取物可明顯降低結腸炎小鼠的DAI評分，并使糞便性狀得到改善[33]，在本研究中，黑木耳黑色素也有相同的治療效果。由圖2B可知，模型組小鼠與空白對照組小鼠相比DAI評分顯著升高（P＜0.000 1），黑木耳黑色素干預后DAI評分顯著降低，且與空白對照組小鼠相比無顯著差異（P＞0.05），結果表明黑木耳黑色素可顯著恢復小鼠DAI評分，對由IDA誘導UC所表現(xiàn)的體質量增長緩慢、糞便稀散、便血等癥狀具有極佳的改善效果。

2.3 黑木耳黑色素對IDA誘導的UC小鼠免疫器官指數(shù)的影響

脾臟是外周免疫器官，免疫細胞會在成熟的脾臟中定植并對抗原作出反應。胸腺是中樞免疫器官，胸腺的主要功能是產(chǎn)生T淋巴細胞。因此，脾臟和胸腺指數(shù)可反映機體先天免疫功能的強弱[34-35]。如圖3 所示，與空白對照組相比，模型組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.000 1），脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.000 1），經(jīng)黑木耳黑色素灌胃給藥后，各指數(shù)恢復至空白對照組水平（P＞0.05），因此黑木耳黑色素對UC小鼠的免疫器官指數(shù)具有調節(jié)作用。

圖3 黑木耳黑色素對IDA誘導的UC小鼠胸腺指數(shù)（A）及脾臟指數(shù)（B）的影響Fig.3 Effect of Auricularia auricula melanin on thymus index (A) and spleen index (B) of IDA-induced UC mice

2.4 黑木耳黑色素對IDA誘導UC小鼠結腸組織病理學及病理學評分的影響

如圖4所示，空白對照組小鼠結腸上皮細胞排列緊密有序，有大量結構良好的隱窩和絨毛，隱窩和絨毛長而清晰，無潰瘍及炎癥細胞的浸潤。而模型組小鼠腸道組織結構受損，隱窩結構和杯狀細胞扭曲，結腸黏膜潰爛，上黏膜及屏障變形，黏膜下層炎癥細胞嚴重浸潤。有研究表明，UC對小鼠結腸組織造成嚴重破壞，導致結腸充血、健康組織受到損傷、大量上皮細胞凋亡[36]，本實驗中模型組小鼠的結腸組織病理學分析與此情況較為一致，與空白對照組相比，病理學評分顯著升高（P＜0.000 1），黑木耳黑色素給藥治療后可顯著改善腸道組織損傷情況，隱窩結構基本恢復正常，使腸黏膜潰瘍和隱窩破壞程度均有所減輕，炎癥細胞浸潤基本消失，病理學評分明顯下降，與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05），表明黑木耳黑色素在維持結腸結構完整及改善炎癥等方面有著極佳的效果，同時有相關研究報道，天然產(chǎn)物蒲公英的提取物可修復潰瘍性結腸損傷[37]，與本研究中的黑木耳黑色素效果相似，提示黑木耳黑色素有助于IDA誘導UC小鼠腸道恢復正常。

圖4 小鼠結腸組織病理學HE染色及組織病理學評分Fig.4 Hematoxylin-eosin staining and histopathological scores of colon tissues in mice

2.5 黑木耳黑色素對IDA誘導的UC小鼠結腸氧化應激損傷的影響

氧化應激與氧化細胞損傷是結腸炎的主要標志之一[38]，其中TAC與SOD活力是反映抗氧化能力的重要指標[39]；MDA含量及·OH、O2-·水平可反映氧化應激損傷程度[40-41]。如圖5所示，與空白對照組相比，模型組小鼠結腸組織中TAC與SOD活力顯著下降（P＜0.000 1），MDA、·OH、O2-·水平顯著上升（P＜0.000 1、P＜0.01），而黑木耳黑色素組與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。說明黑木耳黑色素能調節(jié)IDA誘導的UC小鼠體內氧化應激水平，與前人對其他天然產(chǎn)物研究的結果[42-45]一致，說明黑木耳黑色素能有效恢復IDA誘導的UC小鼠總抗氧化能力及結腸中SOD抗氧化酶活性，并能有效改善疾病小鼠脂質過氧化損傷，同時調節(jié)結腸中氧自由基的異常表達。

圖5 黑木耳黑色素對IDA誘導的UC小鼠結腸中TAC（A）、SOD活力（B）、MDA含量（C）及·OH（D）、O2－·（E）水平的影響Fig.5 Effect of Auricularia auricula melanin on the levels of TAC (A),SOD (B), MDA (C), ·OH (D), and O2－· (E) in colon tissues of IDA-induced UC mice

2.6 黑木耳黑色素對TLR4/NF-κB信號通路調控的影響

T L R 4/N F-κB是導致腸道免疫炎癥反應的重要細胞間信號通路[46]，越來越多的研究顯示，TLR4/NF-κB介導的信號轉導通路在炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，可通過激活NF-κB與TLR4結合產(chǎn)生大量TNF-α及其他炎癥因子[47]。炎癥因子水平是評估炎癥性疾病的重點指標之一[48]，促炎細胞因子TNF-α的過表達在一定程度上會加重腸道損傷，導致腸道炎癥發(fā)生[49]?？寡滓蜃覫L-10在維持腸道黏膜免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用，可以拮抗炎癥因子的產(chǎn)生，并保持腸黏膜屏障完整，進而減輕炎癥性腸病的進展。增強IL-10在體內的表達或者補充IL-10均可以預防腸炎發(fā)生[50]。如圖6所示，與空白對照組相比，模型組小鼠結腸組織中TLR4、NF-κB-p65mRNA表達量顯著上升（P＜0.001、P＜0.000 1），黑木耳黑色素干預后表達量均下降至與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05）。相應地，給藥治療后促炎因子TNF-αmRNA表達水平顯著降低（P＜0.01），抗炎因子IL-10 mRNA表達量顯著增加（P＜0.05），表明黑木耳黑色素通過調控TLR4/NF-κB信號通路，有效逆轉炎癥細胞因子異常表達，從而緩解IDA誘導的UC小鼠炎癥反應，恢復防御功能。該結果與鐘繼紅等[51]的實驗結果相似。

圖6 黑木耳黑色對信號通路中相關基因TLR4（A）、NF-κB-p65（B）、TNF-α（C）、IL-10（D）表達水平的影響Fig.6 Effect of A. auricula melanin on the expression levels of TLR4 (A),NF-κB-p65 (B), TNF-α (C) and IL-10 (D)

3 結 論

黑木耳黑色素在UC小鼠腸道中表現(xiàn)出顯著的抗氧化、抗炎功能。黑木耳黑色素可通過增強機體抗氧化酶活力、降低氧化應激損傷、調控TLR4/NF-κB信號通路中相關基因表達，保護腸黏膜，從而減輕結腸炎癥的病理程度。以上結果表明，從天然物質中提取黑色素可以作為治療UC功能食品或營養(yǎng)藥品的有效成分，本研究可為其藥物開發(fā)提供理論參考。