李楠張晨孫艷君高晟瑋李多靜王心蕊王保和

（1. 天津中醫(yī)藥大學，天津 301600；2. 天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300143；3. 天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300380）

Langendorff 離體心臟灌流模型技術是一種體外技術，用于研究動物心臟的藥理學和生理學。 該模型具有多項優(yōu)點，包括模擬心臟缺血狀態(tài)、實時將藥物直接輸送至心肌并對藥物進行功能評估等特點。 Oscar Langendorff 利用逆行灌注的原理于1895年開創(chuàng)了離體哺乳動物心臟灌注系統(tǒng)［1］。 從那時起，Langendorff 不斷發(fā)展并提供了豐富的數(shù)據(jù)來支持對心臟基本生理學的理解。 近年來，該技術在研究心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury， MIRI）和心律失常方面得到廣泛應用，同時也被用于分離成年大鼠心肌細胞［2－3］。

MIRI 是指由于心肌供血的中斷和在一定時間的恢復時對原有缺血的心肌造成更嚴重的損傷［4］。它是一個復雜的過程，涉及各種病理機制，可對心肌產(chǎn)生有害的影響。 MIRI 經(jīng)常發(fā)生在恢復心臟血流的醫(yī)療干預過程中，如經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）或冠狀動脈旁路移植（CABG）。 因此，MIRI疾病成為近幾年研究的熱點。

利用Langendorff 通過停止灌流液中的氧氣供應，模擬心肌缺血，心肌無法獲得氧氣，導致?lián)p傷；隨著再次將灌流液通入冠脈中，模擬心肌再灌注，從而導致進一步的損傷。 因此，本文將對Langendorff灌流技術模擬MIRI 的發(fā)展和應用進行綜述。

1 灌流原理

利用逆行灌注的方法，通過心臟主動脈插管灌注，隨著灌注緩沖液的充盈，主動脈瓣在壓力下關閉。 主動脈內(nèi)的灌注液，通過主動脈根部的兩個冠狀動脈口（左和右）填充。 然后灌注緩沖液進入冠狀動脈血管，通過冠狀靜脈流出到右心房的冠狀竇（位于后心房三尖瓣的隔葉上方），通過右心房流出［5］。

2 常規(guī)步驟

（1）配制Krebs Henseleit 緩沖液（KHB），向KHB 中通入95% O2和5% CO2混合氣體，緩沖液pH ＝7.4，并取部分KHB 放入冰箱中，使其溫度降到4℃。 （2）使用前用蒸餾水清潔Langendorff 管路，打開水浴循環(huán)，再用KHB 將整個灌流管路系統(tǒng)進行沖洗。 確保清除管內(nèi)的氣泡。 （3）大鼠充分肝素化后，麻醉，固定至手術臺，開胸，取下完整心臟，放入預冷KHB 中去除血液。 （4）將灌流管插入主動脈中，固定心臟，逆行灌入預先以95% O2和5% CO2氧合的KHB，剪開右心耳以便灌流液流出，以此狀態(tài)平衡20 min。 （5）待心臟復跳后，將左心耳剪開，經(jīng)左心耳穿過二尖瓣，將一個心室內(nèi)壓球囊插入左心室，通過壓力感受器連接，并全程記錄心臟電生理活動。 （6）全心缺血再灌注方案：轉動旋鈕使KHB 停止流入冠狀動脈，引起缺血。 缺血完成后，再次打開旋鈕，使KHB 再次流入冠狀動脈，實現(xiàn)再灌注（見圖1）［5］。

圖1 Langendorff 離體心臟灌流模型Figure 1 Langendorff isolated heart perfusion model

3 動物選擇

3.1 動物類別

幾乎大多數(shù)哺乳動物心臟均可用于Langendorff離體心臟灌注模型，較大體積動物（豬、猴或狗）的心臟便于操作，且結果更接近人類血液動力學特征［6］，但是大型哺乳動物成本相對較高，對灌流液消耗較大。 嚙齒類動物（大、小鼠、兔子、豚鼠等）相對成本較低，受到研究者的青睞。 但是不同嚙齒動物的心臟電生理不同。 研究發(fā)現(xiàn)大鼠、豚鼠和兔心臟在動作電位的復極化不同。 豚鼠心室肌細胞不產(chǎn)生瞬時外向鉀電流，并且存在幅度非常高的延遲整流電流。 而兔心室細胞有大約一半表現(xiàn)出1 期復極化和瞬時外向電流。 大鼠心室肌細胞也有明顯的1 期復極化，但是缺乏明顯的平臺期，動作電位明顯短于兔和豚鼠心室肌細胞［7］。 不同動物心臟適合的模型不同，經(jīng)過實驗研究評估豚鼠、大鼠和兔的缺血再灌注損傷的反應，大鼠離體心臟的缺血恢復最為顯著；而豚鼠對缺氧的抵抗力比較強［8］，缺血再灌注對豚鼠影響較低；而兔更多被用于Langendorff 心律失常模型。 因此大鼠更適合用于Langendorff 離體心臟缺血再灌注模型；此外由于大鼠羥自由基的產(chǎn)生更為顯著（心律失常的發(fā)生率和嚴重程度與羥基自由基的產(chǎn)生之間存在密切關系），因此大鼠心臟也適合于缺血再灌注損傷誘發(fā)心律失常模型［9］。 隨著轉基因小鼠作為人類疾病轉基因模型的研究逐漸廣泛，轉基因小鼠也成了Langendorff 技術常使用的動物類型，雖然小鼠心臟結構小巧，考驗研究者操作水平，但是依然是研究者常采用的物種。

3.2 動物性別

不同性別也對Langendorff 離體心臟灌流模型有影響。 與雄性動物相比，雌性動物對心肌缺血再灌注損傷的耐受性更高，提高了心臟存活率。 一個犬類心臟實驗的結果表明，雌激素可能會限制梗死的范圍［10］。 研究發(fā)現(xiàn)雌激素補充的大鼠在心肌缺血再灌注后具有更高的冠狀動脈血流速度和左心室壓力以及生成更高的硝酸鹽（硝酸鹽通過調(diào)節(jié)eNOS 和iNOS 表達并抑制心臟中的脂質過氧化作用來提供心臟保護以防止心肌缺血再灌注損傷）［11］。 另外有團隊研究發(fā)現(xiàn)雌激素會增加線粒體連接蛋白43（Cx43）的含量和磷酸化，Cx43 是一種間隙連接蛋白，越來越多的證據(jù)表明，Cx 蛋白與線粒體的多個功能有關，包括線粒體復合物I 介導的耗氧和ATP 產(chǎn)生、鉀處理、mPTP 開放和ROS 形成，因此雌激素通過調(diào)節(jié)Cx43 間接性的起到心臟保護作用［12］。 在動物性別的選擇上，需要對心臟存活率和成模率之間斟酌。 一個研究對Langendorff 相關基礎研究的動物性別進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)雄性動物的研究占63.3%，兩種性別都選的研究占了11.6%，僅5.1%的研究選擇使用雌性動物［13］。

3.3 動物年齡

動物的年齡也對該模型具有影響。 與青年鼠（4 ～6 個月）相比，老年鼠（18 ～20 個月）再灌注后，LVDP、dp／dtmax 和dp／dtmin 的恢復率有降低的趨勢，老年鼠心肌缺血再灌注損傷程度加重，可能與老齡鼠心肌細胞凋亡和壞死的加速，心肌細胞總數(shù)減少，心肌細胞為了維持心功能恢復而發(fā)生適應性肥大，并且膠原沉積增加，導致嚴重的心功能受損［14］。 較早前研究結果顯示，對缺血抵抗力的年齡依賴性變化呈現(xiàn)雙相模式，耐受性增加至23 日齡，隨后下降。 因此，未成熟的大鼠心臟在缺血和再灌注期間比新生兒大鼠心臟更不易受損，成熟心臟比年輕的心臟更容易受損［15］。

3.4 動物體重

不同體重的大鼠心臟心室腔和冠脈體積也會有差異，因此需選擇體重保持在一定范圍內(nèi)的大鼠。 筆者在練習時，利用體重超過500 g 的大鼠心臟灌流，發(fā)現(xiàn)即使泵速已經(jīng)達到最高（13.17 mL／min），灌注壓依然無法達到65 mmHg。 這可能是由于重量更大的心臟，冠脈總體積比體重小的心臟的相對體積大，在同一泵速下，灌脈壓更小（保持在同一心率下）。 并且為了保證心臟左心室發(fā)展壓能夠保持在同一基線，球囊的大小也需要根據(jù)心臟大小進行調(diào)整，因此，同一批實驗，最好保證大鼠體重保持在同一水平。

4 灌流模式

4.1 恒定灌注壓力模式（穩(wěn)定壓力）

在恒定壓力設置下，灌注壓力保持恒定，研究者可以檢測實驗過程中灌注液流量的變化。 一種方法是通過設置流體柱保持在一定的高度來施加恒定的灌注壓力，或者通過蠕動泵調(diào)整流速保持灌注壓力恒定。 該模式下，可以自動調(diào)節(jié)冠狀動脈血管張力和改變灌注流量匹配心臟需求的能力。 大鼠灌流壓力一般維持在60 ～70 mmHg。

4.2 恒定灌注流量模式（穩(wěn)定流量）

恒定灌注流量模式是指使用蠕動泵使灌注液通過冠狀動脈血管的流速保持恒定，研究者可以觀察冠狀動脈壓力的變化，因此，恒流模式更適合評估冠脈血管對藥物的反應。 但是恒定流量灌注模式不可以根據(jù)心臟的情況進行調(diào)節(jié)，比如在局部缺血時，由于灌流液在相同時間內(nèi)流入灌流液體積不變，相同量的灌流液進入結扎后的冠脈，冠脈總體積變小，灌注液比冠脈結扎前相對變多，容易在結扎部位導致冠狀動脈損傷。 大鼠灌流量一般在10～15 mL／min，家兔為20 mL／min［16－17］。

5 灌注液類型

灌注液具有血液的基本特質，一般灌注液具有緩沖能力（pH ＝7.4），提供能量來源，具有滲透壓、攜氧能力，并且灌注液在灌注時保持的生理溫度37℃。

5.1 晶體灌注液

一般指的是Krebs-Henseleit 緩沖液，由Hans Krebs 和Kurt Henseleit 開發(fā)，是目前離體心臟再灌注損傷模型使用最廣泛的灌注緩沖液。 KHB 包含鈉（Na）、鉀（K）、氯化物（Cl）、鈣（Ca）、硫酸鎂（MgSO4）、碳酸氫鹽（HCO3－）、磷酸鹽（PO43－）和葡萄糖。 但是KHB 中無蛋白質，滲透壓低于生理水平，容易導致水腫，并且在沒有血紅蛋白存在的情況下，攜氧力相對低。 同時不能解決血細胞和血源性分子與心肌細胞和內(nèi)皮細胞的基本相互作用（這種相互作用在病理生理條件下是非常重要的）。 并且，在無紅細胞灌注的動物心臟中，心室壁厚度相對較早增加，在某些情況下增加了15%，而且這些心臟的功能穩(wěn)定性明顯低于血液灌注的心臟［18］。此外，由于晶體灌注液粘稠度較血液粘稠度低，流量明顯升高，長時間灌流會引起心肌水腫。 盡管如此，由于KHB 成本低、好獲取，目前依然是多數(shù)研究者在Langendorff 實驗中，使用的灌注液類型。 KHB可以現(xiàn)用現(xiàn)配也可以配制成母液。 配制母液時，不添加葡萄糖和CaCl2，需在使用時臨時加，以防細菌滋生和溶液渾濁［19］。 此外由于灌流液中葡萄糖和鈣離子的存在，灌流系統(tǒng)管壁容易殘留細菌和形成結晶沉淀，在灌流過程中，有脫落的風險，從而堵塞冠脈，造成梗塞。 因此文飛等［20］在灌流系統(tǒng)遠端加入輸液器濾頭，避免晶體沉淀和細菌栓子等異物進入冠脈血管。

5.2 全血灌注液

該方法需要供體動物，并對供體動物大動脈和靜脈進行插管，動脈管連接到離體心臟的主動脈插管，供體動物的血液流入到離體心臟，然后收集離體心臟流出的血液，將其泵回供體動物的靜脈，通過供體動物的呼吸系統(tǒng)給靜脈血液充氧，如此循環(huán)。 該方法更接近生理情況，但是血液在體外循環(huán)時容易出現(xiàn)溶血的情況。 此外，提供血液的供體動物因為體液在體外循環(huán)的原因，會導致內(nèi)啡肽釋放明顯增加，研究證實內(nèi)啡肽在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中有一定的心肌保護作用，因此可能影響實驗結果［21－22］。 也有研究在缺血前利用小鼠全血和人類全血加載到離體鼠類的心臟中，并發(fā)現(xiàn)全血在MI／RI 模型中起到保護作用，并且將轉基因小鼠的血液成分加載到不同品系的小鼠心臟中，該方式有助于開發(fā)新的靶向治療［23］。

5.3 紅細胞灌注

紅細胞灌注是在KHB 基礎上，加入牛來源的紅細胞和白蛋白，使灌注液維持生理滲透壓，并且使心臟也能獲得足夠的氧氣供應。 在開始全心缺血時，將小鼠紅細胞加載至離體小鼠冠脈中，當缺血結束后，用KHB 重新灌注冠狀動脈，減少血液在冠脈中存留的時間［24］。 有研究采用健康的人類紅細胞注射到Langendorff 灌注的小鼠心臟的冠狀系統(tǒng)中，與小鼠紅細胞發(fā)揮相當?shù)男呐K保護作用，并且另外有研究表明，2 型糖尿病人類患者的紅細胞注入非糖尿病大鼠心臟中，與健康人類患者的紅細胞相比，明顯減弱了缺血后心臟功能。 雖然人類紅細胞攜帶抗原，可以誘導動物心臟的免疫調(diào)節(jié)反應，但是多個研究認為這種影響是微不足道的。 因此，利用人類血細胞替代動物血細胞的方法為研究人類疾病提供了創(chuàng)新的實驗方法［23］。

由于全血灌注液或血細胞灌注液需要大量的血液，因此只能限制在使用大鼠或兔等相對大型的實驗動物，而不能使用具有廣泛基因修飾品系和較低成本的小鼠，增加了實驗成本［23］。 此外，為了提高梗死面積，Yang 等［25］在全心缺血期間將線粒體DNA 片段加載到冠狀動脈系統(tǒng)中。 另外，有研究者在灌流液中加入丙酮酸，使離體心臟通過增強能量產(chǎn)生和抗氧化等機制，起到抗心肌缺血再灌注損傷的心臟保護作用和線粒體通透性轉換孔的關閉的作用［26］。

6 Langendorff 測量指標

6.1 心肌功能

利用Langendorff 與檢測模塊連接后，在灌注過程中， 直接檢測心肌功能。 離體心臟連接Langendorff 后，剪開左心房，通過二尖瓣向內(nèi)置入自制球囊［27］，注射器向內(nèi)注水以調(diào)整球囊大小，使左心室舒張末壓保持在5 ～7 mmHg（也有實驗保持在8 ～12 mmHg［28］），實時監(jiān)測左心室壓力，利用壓力軌跡計算心室功能的多個參數(shù)。 比如左心室發(fā)展壓（LVDP），計算收縮壓和舒張壓之差，正常的大鼠的LVDP 是70 ～130 mmHg。 此外還可以計算心率（heart rate，HR）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（ ＋dp／dtmax）、左心室內(nèi)壓最大下升速率（－dp／dtmax）等。并且可以定時收集冠狀動脈流出物的體積，計算冠狀動脈血流（CF），以此反應心肌功能。

6.2 心臟電活動

電活動是心臟不可缺少的檢測指標，如檢測心電的正負電極分別置于心臟表面（或蛙心夾）、連接生物放大器模塊、直接描繪心臟表面心電圖（ECG）。 此外，利用鉑金刺激電極連接多道電生理儀，使用吸力或浮動電極的電氣測量（單點測量）或使用單個光電探測器（單點測量）或圖像傳感器（面積測量）的光學測量［29］。 此外還可以利用多極陣列記錄場電位［30］。 近幾年，多個研究聯(lián)合光學映射技術使用熒光染料和相機對心臟組織的關鍵動態(tài)特性進行非接觸式測量，例如跨膜電位和細胞內(nèi)鈣濃度［31］。 一種常用的熒光分子是di-4-ANEPPS，作為可興奮細胞（如心肌細胞和神經(jīng)元）毫秒級動作電位變化的快速響應探針。 染料被添加到灌注溶液中，從而分布在整個心臟組織中，以檢測跨膜電位［32］。 但是一個兔孤立心臟模型結果顯示，di-4-ANEPPS 對兔心臟自發(fā)心率和心室沖動傳導具有顯著的直接不可逆影響（其他物種不確定），因此兔心臟缺血性研究需要考慮到這一點［33］。 此外根據(jù)前面提到的原理，針對鈣離子濃度，也可以使用熒光指示劑Fluo-4 進行檢測［34］。

6.3 心臟代謝和心臟標志物

收集冠脈流出液，通過測量心肌代謝物的產(chǎn)生和消耗來評估心臟代謝狀態(tài)，如ATP、ADP、乳酸等。心臟停灌后容易引起心肌損傷，因此心肌梗死的心臟標志物檢測也是必不可少的，如肌酸激酶、乳酸脫氫酶和肌鈣蛋白等評估心臟損傷程度。 此外，實驗結束后保留心臟，可以用來做分子生物學分析（如Western Blot、PCR）和形態(tài)學變化分析（如利用TTC 染色，測量梗死面積）。

7 排除標準

心臟摘下后連接Langendorff 后，離體心臟需要20 ～30 min 穩(wěn)定期，以便清除心臟在切除過程中產(chǎn)生的有毒代謝物，并且在此期間研究可根據(jù)排除標準觀察心臟運作狀態(tài)，決定是否將該心臟納入研究當中，從而獲得一致且可重現(xiàn)的數(shù)據(jù)，降低實驗失敗的風險。 不同動物，排除標準不同。 小鼠恢復灌流大于4 min；灌流小于2 mL／min 或大于5.5 mL／min；每分鐘心律失常發(fā)生頻次大于3 次，心率小于320 次或大于620 次；左心室發(fā)展壓力小于60 mmHg 或大于140 mmHg。 兔子恢復灌流大于3 min；灌流小于55 mL／min 或大于80 mL／minn；每分鐘心律失常發(fā)生頻次大于3 次，心率小于150 次或大于190 次；左心室發(fā)展壓力小于70 mmHg 或大于130 mmHg。 大鼠恢復灌流大于3 min；灌流小于10 mL／min 或大于28 mL／min；每分鐘心律失常發(fā)生頻次大于3 次，心率小于70 次或大于400 次；左心室發(fā)展壓力小于70 mmHg 或大于130 mmHg［35］。 心臟從動物體內(nèi)取下到恢復灌流的時間是關鍵，研究者需要盡量壓縮這部分時間，從而提高心臟的活性。 左心室發(fā)展壓提示左心室在收縮期內(nèi)產(chǎn)生的最大壓力，是衡量左心室收縮功能和心肌收縮力的指標。 灌流速度也影響心臟狀態(tài)，在平衡期灌流速度慢，灌流壓過低，冠狀動脈得不到很好的灌流；灌流速度快，使灌流壓過高，容易打開二尖瓣，使灌流液進入心室，且容易使心臟水腫。 因此，研究者依據(jù)排除標準，可以保證心臟維持良好的活性。

8 缺血方式

Langendorff 缺血常見方式有兩種：一種是全心缺血，往往是在穩(wěn)定期結束后，停止Langendorff 的灌流，之后直接打開旋鈕恢復灌流；另一種是局部缺血則是在穩(wěn)定期后，利用結扎線在左降支冠狀動脈，其他冠狀動脈一直保持灌流，實現(xiàn)局部灌流，缺血結束后，松開結扎線恢復灌流。 這兩者各有利弊，對于全心缺血，當心肌細胞死亡數(shù)量達到一定程度時，心臟可能會停跳，但是操作簡單。 而局部缺血需要研究者結扎冠狀動脈，由于每只動物個體的冠狀動脈分布并不完全一致，且實驗者結扎手法無法保證完全一致，這可能導致實驗結果可比性降低，但是心臟一直保持灌流的狀態(tài)，降低心臟停跳的風險。 并且結扎線可能會破壞心肌組織，因此也有研究者利用方式，并且在圈內(nèi)放置一個小的塑料管［36］。 對于兩種缺血的方式比較，目前尚未查詢到相關研究，因此無法確定哪種缺血方式更適合用于離體心臟缺血再灌注損傷的研究。

9 停灌和再灌時間

停灌和再灌注時間直接影響到造模成功與否，在國內(nèi)樊官偉團隊研究發(fā)現(xiàn)，在恒壓模式下（65 mmHg），缺血20 min 時對大鼠離體心臟再灌注即可造成損傷，然而40 min 缺血后，再灌注造成的損傷較為嚴重，綜合考慮到模型建立的成功、損傷后可恢復的程度和藥物的干預性，建議停灌30 min。 對于再灌注時間，樊官偉團隊研究發(fā)現(xiàn)60 min 足夠造成心臟血流動力學和心肌梗死面積等指標的改變［37］。 另外一個研究在80 mmHg 的恒定壓力下，KHB 中加入了丙酮酸鹽，對小鼠心臟分別缺血5、15和20 min，再灌注45 min 后，心功能可以恢復至長期保持灌注的心功能狀態(tài)；而在缺血25、30、45 和60 min 后，CK 的釋放顯著增加，并且隨著45 min 再灌注結束后，心肌發(fā)生廣泛的損傷。 與樊官偉團隊的研究結果一致，缺血60 min 后，心臟LV dP／dt max 的恢復降低至接近0，表明可能已達到最大程度的損傷［26］。 結合以上文獻大鼠離體心臟建議停灌30 min，再灌注60 min。 但是不同實驗室條件可能還需要結合實際，確定最佳合適時間。

10 肝素的應用

筆者實驗時發(fā)現(xiàn)，未使用肝素的大鼠心臟在不改變灌流速度時，灌流后期灌注壓會持續(xù)增高，甚至可以升高至130 ～140 mmHg。 這可能是冠狀動脈系統(tǒng)中殘留的血液逐漸凝固，形成微血栓堵塞血管，使得灌流液通過冠脈阻力增大。 使用肝素后，這種情況得到很大程度的改善。 對于肝素的應用，多數(shù)研究者是對大鼠麻醉前15 ～20 min 通過腹腔注射肝素（1000 U／kg）［38］；另有研究者對大鼠開胸后，利用含肝素的KHB 沖洗心臟，再摘取心臟［39］。

11 結語

隨著缺血性心臟病的高發(fā)病率和針對其治療如介入和溶栓等手術方式的廣泛應用，使得心臟缺血再灌注損傷疾病成為研究的重點。 因此這樣的研究離不開利用動物構建心肌缺血再灌注損傷模型。 Langendorff 離體心臟灌流技術得以延續(xù)百年之久，離不開該技術的可重復性、成模率高和技術要求低等特點。 目前利用該技術的研究越來越多，但是該技術變量較多，包括動物的選擇、灌流液的配制和缺血的方式等，每個步驟基本都可能影響實驗的成敗。 因此，雖然各個條件各有優(yōu)缺點，研究者需結合自身實驗設計摸索出最佳的實驗條件。

Langendorff 原理采用逆灌的方式實現(xiàn)，與心臟的自然工作狀態(tài)不同。 此外，測定心室發(fā)展壓需要手動放置球囊，但這個過程以及球囊在心室內(nèi)的位置都可能對心臟造成損傷。 相比之下，Working heart 系統(tǒng)通過模擬心臟血液流動進行灌注，左心房和主動脈由恒定速度的泵提供動力。 Working heart系統(tǒng)能夠保持心臟的天然心律和心室壁張力，在測定心室壓時無需插入球囊。 盡管如此，由于操作簡單，Langendorff 技術一直受到研究者的青睞。 相對于Working heart 系統(tǒng)，Langendorff 技術更容易操作，無需復雜的動物手術和灌注系統(tǒng)。 這使得許多實驗室，尤其是初學者或資源有限的實驗室，普遍采用Langendorff 技術。 盡管Langendorff 已應用上百年，但是隨著科學技術的發(fā)展，越來越多（如光學映射和多極陣列等［30］） 高端先進技術能夠與Langendorff 技術相結合，使得Langendorff 灌流技術歷久彌新。