李曉斌劉博文李峰蘇曉鵬胡世平*

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518172）

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種非細(xì)胞病變的DNA 病毒，基因組長(zhǎng)約3.2 kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。 HBV 通過(guò)肝細(xì)胞膜上的鈉離子-?；悄懰釁f(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入肝細(xì)胞，在受感染肝細(xì)胞的細(xì)胞核中產(chǎn)生共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）［1］，接著轉(zhuǎn)錄成前基因組RNA（逆轉(zhuǎn)錄為HBV DNA 的模板）和mRNA 以翻譯成HBV 蛋白。 cccDNA 是HBV 難以根除和實(shí)現(xiàn)免疫抑制后HBV 重新激活的主要原因［2］。 HBV DNA 可以整合到宿主基因組中，并且可以是HBsAg 的來(lái)源，也是肝癌發(fā)生的促成因素［3］。 目前全球有超過(guò)2.5 億人為慢性HBV 感染者（定義為HBsAg 陽(yáng)性）［4］，其中未經(jīng)治療的患者約40%發(fā)展為肝硬化，且存在進(jìn)展至失代償性肝硬化和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)［5－7］。 目前慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的治療以干擾素和核苷類似物為主，但無(wú)法清除肝內(nèi)的cccDNA 以達(dá)到功能性治愈，故深入開展CHB 發(fā)病機(jī)制及各種干預(yù)過(guò)程的有效性研究，對(duì)根除肝內(nèi)的cccDNA 具有重要意義。

有效動(dòng)物模型的建立對(duì)于機(jī)制研究及新藥研發(fā)至關(guān)重要，本研究檢索近10 年來(lái)HBV 感染相關(guān)的文獻(xiàn)，篩選出國(guó)內(nèi)外期刊公開發(fā)表的涉及HBV 感染動(dòng)物模型的論文，對(duì)HBV 感染動(dòng)物模型的動(dòng)物種類、造模方法、檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行闡述，為今后HBV 感染建模研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)、維普中文期刊服務(wù)平臺(tái)及PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)，收集從2012 年1 月1 日至2022 年12 月31 日發(fā)表的研究，檢索方法均為高級(jí)檢索，中文數(shù)據(jù)庫(kù)以“HBV”、“乙型肝炎病毒”、“動(dòng)物模型”為主題詞檢索，英文數(shù)據(jù)庫(kù)以“HBV”、“hepatitis B virus”、“animal model”為主題詞檢索。

1.2 文獻(xiàn)篩選標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）涉及HBV 感染動(dòng)物模型且全部造模成功的實(shí)驗(yàn)類文獻(xiàn)；（2）模型資料完備（動(dòng)物種類、造模方式、成模標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)指標(biāo)等明確）；（3）可獲得全文，語(yǔ)種不限。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）無(wú)法獲取造模方式、造模藥物、檢測(cè)方法、檢測(cè)指標(biāo)等詳細(xì)的資料；（2）重復(fù)文獻(xiàn)僅選取發(fā)表時(shí)間最早的一篇；（3）會(huì)議、學(xué)位論文、報(bào)紙、綜述、理論研究。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將收集的文獻(xiàn)中涉及的動(dòng)物種類、造模方法、檢測(cè)指標(biāo)等以統(tǒng)一格式錄入Microsoft Excel 2013，采取雙人錄入的方法以確保信息的質(zhì)量控制，整理并建立HBV 感染動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2013 對(duì)HBV 感染動(dòng)物模型數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，歸納造模要素［8］。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

共檢索出1216 篇文獻(xiàn)，包括中國(guó)知網(wǎng)311 篇、萬(wàn)方524 篇、維普56 篇、PubMed 325 篇，剔除重復(fù)文獻(xiàn)677 篇，閱讀題目與摘要后剔除綜述、理論研究、會(huì)議類、學(xué)位論文及無(wú)關(guān)文獻(xiàn)共257 篇，閱讀全文剔除不符合1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)，最終納入文獻(xiàn)59 篇。 其中英文文獻(xiàn)17 篇，中文文獻(xiàn)42 篇。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類

將59 篇納入文獻(xiàn)中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，主要包括6 類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，即小鼠、大鼠、鴨、土撥鼠、猴、樹鼩。 如表1 所示，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類按照頻數(shù)進(jìn)行排序，其中使用頻數(shù)最高為C57BL／6小鼠（23 次，32.38%） 和BALB／c 小鼠（13 次，18.30%），其次較為常用的有鴨、土撥鼠等。 造模動(dòng)物的性別以雄性為主，分布見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類頻數(shù)分布Table 1 Frequency distribution of experimental animal species

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性別及頻次Table 2 Sex and frequency of functional dyspepsia model animals

2.3 造模方式

將文獻(xiàn)中的造模方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類，歸納為6種。 最常用的為水動(dòng)力高壓注射法（28 次，47.46%），其次為靜脈注射（注射部位涉及頸靜脈、脛靜脈及頸外靜脈等）、腹腔注射重組腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體介導(dǎo)的HBV 感染、轉(zhuǎn)基因、皮下注射及先天感染。 每一種造模方式的分布及原理見表3。

表3 造模方式分布Table 3 Distribution of modeling methods

2.4 模型給藥時(shí)間及陽(yáng)性對(duì)照藥

共20 項(xiàng)研究涉及藥物干預(yù)，其中13 項(xiàng)研究設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照藥物。 經(jīng)統(tǒng)計(jì)，給藥時(shí)間多為14 d（7 次， 35.00%），其次為28 d（3 次，15.00%）。 陽(yáng)性對(duì)照藥均為抗病毒藥物，包括拉米夫定（9 次，69.23%）、阿昔洛韋（3 次，23.08%）及恩替卡韋（1 次， 7.69%）。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)

對(duì)本研究中涉及的全部檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，若同一組織被用于檢測(cè)不同的指標(biāo)，如肝組織既做病理檢測(cè)又做免疫組化，則分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果表明檢測(cè)指標(biāo)主要包括HBV 相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)、轉(zhuǎn)氨酶、肝組織病理、肝組織免疫組化等。 其中，檢測(cè)前3 位的指標(biāo)包括血清HBsAg（46 次，18.18 %）、血清HBV-DNA（43 次，17.00 %）、血清HBeAg（35次，13.83 %）。 檢測(cè)指標(biāo)的頻數(shù)分布見表4。

表4 檢測(cè)指標(biāo)頻數(shù)分布Table 4 Frequency distribution of detection indicators

3 討論

目前CHB 的治療尚未實(shí)現(xiàn)功能性治愈，達(dá)到這一目標(biāo)需要滿足多個(gè)步驟：完全抑制HBV DNA 復(fù)制及HBsAg 產(chǎn)生，恢復(fù)先天性和HBV 特異性免疫應(yīng)答［9］，因此靶向HBV 復(fù)制生命周期不同階段的藥物及免疫調(diào)節(jié)劑仍是目前的研究熱點(diǎn)。 基礎(chǔ)研究中選擇合適的動(dòng)物模型至關(guān)重要。

3.1 常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

理想的臨床前動(dòng)物模型既需要模型中有較高的HBV 病毒含量，也需要相應(yīng)的免疫環(huán)境［10］。 目前用于制備HBV 感染模型的動(dòng)物主要有鼠、鴨、土撥鼠、樹鼩、食蟹猴等，其中以小鼠最常用。 HBV 感染具有極強(qiáng)的種屬特異性，僅黑猩猩和食蟹猴存在HBV 的自然感染，感染后的宿主反應(yīng)與人類相似，是研究分子機(jī)制、評(píng)估疫苗功效和抗病毒藥物等的首選［11］。 但受動(dòng)物倫理的限制和高昂成本的影響，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院逐漸限制非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在生物醫(yī)學(xué)上的研究應(yīng)用。 Fan 等［12］研究發(fā)現(xiàn)樹鼩是靈長(zhǎng)動(dòng)物的近緣旁系群，并創(chuàng)建了樹鼩基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。 樹鼩在基因組和免疫學(xué)特性等諸多方面與人類相似，在新生兒感染時(shí)表現(xiàn)出慢性感染傾向，肝組織病理學(xué)變化接近人類感染HBV 后的改變，可通過(guò)感染人HBV 建立慢性感染模型，成為除靈長(zhǎng)類動(dòng)物外可天然感染人HBV 的動(dòng)物，但遺傳穩(wěn)定性不足、個(gè)體差異大、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性較差［13］，在應(yīng)用上受到極大限制。 而土撥鼠肝炎病毒（woodchuck hepatits virus，WHV）和鴨肝炎病毒（duck hepatits virus，DHBV）與人HBV 具有相似的復(fù)制周期和感染相應(yīng)宿主的特性，可作為研究人HBV 的替代病毒，故土撥鼠肝炎模型和鴨乙型肝炎模型在研究中較為常用。 但WHV 與DHBV 均與人HBV 的同源性差，也不能充分體現(xiàn)人HBV 感染的全過(guò)程。

而小鼠與人類具有相似的遺傳背景，且體型小、易獲得、易飼養(yǎng)管理，已被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。 小鼠無(wú)法自然感染HBV，多通過(guò)高壓水動(dòng)力注射法、重組AAV 載體介導(dǎo)法、轉(zhuǎn)基因法等制備HBV感染模型。

3.2 常用造模方法

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠中最常用的造模方法為水動(dòng)力高壓注射法和重組AAV 載體介導(dǎo)的HBV感染。 水動(dòng)力高壓注射法（hydrodynamic injection，HDI）是指將含有HBV DNA 質(zhì)粒的溶液通過(guò)小鼠尾靜脈快速注射進(jìn)小鼠體內(nèi)。 由于高壓下血循環(huán)的沖擊，使輸入的DNA 片段可以進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄前基因組RNA 和其他HBV mRNA 啟動(dòng)HBV復(fù)制，形成HBV 復(fù)制中間體并表達(dá)HBV 蛋白［14］。HDI 的標(biāo)準(zhǔn)程序需要在8 ～10 s 內(nèi)快速注入相當(dāng)于12 ～13%小鼠重量（g）的液體［15］。 HDI HBV 小鼠模型可用于建立瞬時(shí)或持續(xù)性HBV 復(fù)制，外周血中HBsAg 陽(yáng)性的持續(xù)時(shí)間從1 周～6 個(gè)月。 該模型中HBV 的持久性由不同因素決定，包括小鼠品系的遺傳背景、年齡、性別、質(zhì)粒骨架和質(zhì)粒劑量［16－23］。HDI 模型廣泛應(yīng)用于HBV 相關(guān)免疫應(yīng)答機(jī)制及抗病毒藥物的研究，還可通過(guò)構(gòu)建不同HBV 基因型和變異或突變體的質(zhì)粒來(lái)測(cè)試藥物對(duì)突變HBV 的抗病毒作用［23］，并探索不同HBV 基因組株對(duì)HBV 感染持久性的影響及其潛在機(jī)制［17，24］。 但該模型仍存在很大的局限性：首先，HDI 的高壓注射會(huì)造成嚴(yán)重的肝損傷；其次，質(zhì)粒骨架引起的非HBV 免疫應(yīng)答可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果；最后，小鼠肝細(xì)胞在從rcDNA 形成cccDNA 方面效率極低，導(dǎo)致cccDNA 普遍缺失且肝內(nèi)轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)低于HBV 感染患者。

重組AAV 載體介導(dǎo)的HBV 感染小鼠模型是將攜帶HBV 基因組的重組腺相關(guān)病毒（AAV-HBV）注射入小鼠體內(nèi)（一般采取尾靜脈注射），建立持續(xù)感染的HBV 小鼠模型。 AAV 屬嗜肝病毒，具有低致病性和低免疫原性［25］，不同的HBV 基因型或突變體插入AAV 載體中可感染不同遺傳背景的小鼠品系，故重組AAV 載體介導(dǎo)的HBV 感染小鼠模型在研究中應(yīng)用廣泛。 與HDI 相比，AAV-HBV 轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠模型能夠?qū)崿F(xiàn)更持續(xù)的HBV 感染，注射后12周約60%的肝細(xì)胞表達(dá)HBcAg［26］，且AAV-HBV 小鼠的血清HBsAg 即使在3 或4 個(gè)月內(nèi)也保持在相對(duì)較高的水平［26－27］，因此該模型被優(yōu)選用于評(píng)估慢性感染的治療性疫苗和Toll 樣受體激動(dòng)劑的抗病毒作用［28］。 然而，AAV-HBV 是否通過(guò)rcDNA 在小鼠肝細(xì)胞中產(chǎn)生cccDNA 仍不確定。

除此以外，HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠模型在CHB 的發(fā)病機(jī)制及抗病毒藥物篩選方面應(yīng)用較多。 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠可選擇性表達(dá)HBV 蛋白（包括HBsAg、HBeAg、HBcAg 或HBX）及全HBV 基因組，前者可用于研究不同HBV 蛋白的病毒學(xué)和致癌潛力，后者支持HBV 在體內(nèi)復(fù)制的完整生命周期，已被廣泛用于評(píng)估抗病毒藥物的療效［29］。 但迄今為止產(chǎn)生的所有HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠譜系對(duì)病毒抗原具有免疫耐受性，不會(huì)發(fā)展為急性或慢性肝炎，并且這些全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠中缺乏cccDNA，這些可能限制此類模型的應(yīng)用［30］。

3.3 高頻檢測(cè)指標(biāo)分析

本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中最常用的檢測(cè)指標(biāo)為HBsAg，其次為HBV-DNA 和HBeAg。 血清HBsAg來(lái)源于cccDNA 轉(zhuǎn)錄的mRNA 或整合人宿主基因組的HBV DNA 序列，HBsAg 陽(yáng)性表示HBV 感染。 目前，HBsAg 的定量檢測(cè)已在臨床中被廣泛應(yīng)用，其水平可反映疾病分期與疾病的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)［31］。HBeAg 是具有免疫調(diào)節(jié)作用的可溶性蛋白，目前已被證實(shí)與HBV 感染后宿主免疫功能的紊亂密切相關(guān)［32］。 HBeAg 陽(yáng)性一般表示宿主具有較強(qiáng)的傳染性。 對(duì)于接受NAs 治療的HBeAg 陽(yáng)性CHB 患者，HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換與宿主產(chǎn)生部分免疫控制相關(guān)，故臨床將其作為評(píng)價(jià)抗病毒療效的重要指標(biāo)［33］。血清HBV DNA 的水平可直接反映病毒復(fù)制情況，是HBV 感染后相對(duì)特異且靈敏的觀測(cè)指標(biāo)，也是在臨床上被用作判斷是否啟動(dòng)抗病毒治療、預(yù)測(cè)療效及預(yù)后的重要指標(biāo)之一［34］。 以上指標(biāo)均可反應(yīng)宿主HBV DNA 的復(fù)制情況，在判斷造模成功及藥物療效評(píng)價(jià)等方面均具有重要的意義，是實(shí)驗(yàn)中的常用檢測(cè)指標(biāo)。

3.4 結(jié)語(yǔ)

目前CHB 的治療仍無(wú)法達(dá)到功能性治愈，CHB的生物學(xué)機(jī)制探討和新藥研發(fā)都離不開動(dòng)物模型的支持。 構(gòu)建理想的動(dòng)物模型有利于產(chǎn)生更加嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)的研究結(jié)果。 目前關(guān)于HBV 感染動(dòng)物模型的選擇尚無(wú)統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，且國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)多以綜述的形式列舉動(dòng)物模型的種類及各自的優(yōu)缺點(diǎn)，尚無(wú)科學(xué)、客觀的數(shù)據(jù)支持。 本研究應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘的方法，通過(guò)構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)，將數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入的整合與分析，客觀地展示了實(shí)際研究中HBV 感染動(dòng)物模型的應(yīng)用情況，供研究者參考。

本研究通過(guò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)目前HBV 感染的動(dòng)物模型多選擇C57BL／6 小鼠和BALB／c 小鼠，其次為鴨和土撥鼠，造模方法以小鼠高壓水動(dòng)力注射和AAV-HBV 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染為主，鴨和土撥鼠HBV 感染的模型構(gòu)建方法多選擇靜脈或腹腔注射HBV 強(qiáng)陽(yáng)性血清。 檢測(cè)指標(biāo)以HBV 相關(guān)血清病毒學(xué)指標(biāo)為主，主要為HBsAg、HBV-DNA 和HBeAg，部分研究結(jié)合了肝組織病理檢查及轉(zhuǎn)氨酶水平來(lái)評(píng)估HBV感染后肝的疾病進(jìn)展。

HBV 感染的動(dòng)物模型造模方法多種多樣，單一動(dòng)物模型無(wú)法代表疾病的各個(gè)階段，因此研究者應(yīng)充分了解不同模型的優(yōu)劣及適用場(chǎng)景，根據(jù)研究目的選擇合適的動(dòng)物模型，確保研究結(jié)果的科學(xué)性。由于HBV 的特殊性，目前常用的動(dòng)物模型無(wú)法完全重現(xiàn)人體感染HBV 后的真實(shí)過(guò)程，因此建立與臨床病理過(guò)程高度一致的動(dòng)物模型是后續(xù)研究的關(guān)鍵。