王帥趙剛

（1. 山西警察學(xué)院警體部，太原 030401；2. 蘇州大學(xué)體育學(xué)院，江蘇 蘇州 215031）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種以進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)功能障礙為主要臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。 預(yù)計(jì)到2030 年，我國PD 患病人數(shù)將達(dá)494 萬，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)［1］。 因此，尋找能夠預(yù)防PD 發(fā)生或減緩PD 進(jìn)程的新方法是相關(guān)研究關(guān)注的熱點(diǎn)問題［2－4］。

大量研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)保護(hù)作用可以改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能［5］，促進(jìn)神經(jīng)再生［6］。 規(guī)律的運(yùn)動(dòng)鍛煉可明顯降低PD 的患病風(fēng)險(xiǎn)［7－9］。 然而PD發(fā)病比較隱匿，運(yùn)動(dòng)介入方案是保證運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果的重要因素，運(yùn)動(dòng)介入時(shí)間不同導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果存在較大差異［10］。 本研究擬通過單側(cè)注射神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）建立PD 模型大鼠，6-OHDA 進(jìn)入腦組織后可以快速氧化生成超氧自由基，引起DA 合成降低，黑質(zhì)-紋狀體DA 通路功能異常，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生與PD 病理狀態(tài)相類似的運(yùn)動(dòng)功能障礙［11－12］，如身體主動(dòng)運(yùn)動(dòng)減少、患側(cè)偏斜、四肢運(yùn)動(dòng)平衡障礙及協(xié)調(diào)性降低等［13－14］。 基于此，探索早期介入運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)PD 模型大鼠感覺運(yùn)動(dòng)功能和紋狀體DA 水平的影響及時(shí)間累計(jì)效應(yīng)，為進(jìn)一步提高PD 的臨床運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

96 只6 周齡清潔級(jí)健康雄性SD 大鼠，體重230～250 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供【SCXK（京）2019－0008】，飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK（蘇）2021－0065】，實(shí)驗(yàn)大鼠分籠飼養(yǎng)（3 ～4 只／籠），12／12 h 白晝循環(huán)（9：00 ～21：00），自由進(jìn)食飲水，室溫20 ～ 25℃，相對(duì)濕度50 ±10%。 適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，并根據(jù)跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)果剔除不能適應(yīng)運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案的大鼠。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)蘇州大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（SUDA20230522A03）。

1.1.2 主要試劑與儀器

6-羥基多巴胺（氫溴酸鹽）（Sigma，H116），羊抗兔IgG／HRP（中杉金橋，ZDR-5306），L-抗壞血酸（sigma，A5960），冷凍切片包埋劑（SAKURA，4583），PBS 緩沖液（中杉金橋，ZLI-9063），Triton X-100（中杉金橋，ZLI-9308），抗TH 抗體（abcam，ab112），DAB kit（中杉金橋，ZLI-9017），阿撲嗎啡（Sigma，Y0001465），TBS 液（中杉金橋，ZLI-9073），羊抗兔IgG（H ＋L）（中杉金橋，ZB-2301）。

行為學(xué)測(cè)試用網(wǎng)格（自制），行為學(xué)測(cè)試用圓筒（自制），DSPT-202 型動(dòng)物跑臺(tái)（段氏，中國），桌面數(shù)顯腦立體定位儀（瑞沃德，中國），RO-2-10 型超純水過濾系統(tǒng)（愛思泰克，中國），121-2446 型雙垂直電泳儀（六一儀器廠，中國），79-1 型熱力攪拌器（榮華儀器廠，中國），HDR-CX12E 型攝像機(jī)（Sony，日本）， 10 μL 型微量注射器（Hamilton， 美國），Titramax100 型水平搖床（Heidolph，美國），5417R 型離心機(jī)（Eppendor，德國），CM1950 型冰凍切片機(jī)（Leica，德國），DP-72 型顯微鏡（Olympus，日本），MF-5362 型顱骨鉆（Silite Corporation，加拿大）。

1.2 方法

1.2.1 PD 大鼠模型的制備與評(píng)價(jià)

適應(yīng)性喂養(yǎng)后將大鼠隨機(jī)分為：對(duì)照安靜組（SHAM-S；n＝ 24），對(duì)照運(yùn)動(dòng)組（SHAM-E；n＝24），PD 安靜組（PDS；n＝24），PD 運(yùn)動(dòng)組（PDE；n＝24）。 依據(jù)神經(jīng)生化指標(biāo)檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)，在第14天在每組大鼠中隨機(jī)選取12 只（n＝12）進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，剩余大鼠在第28 天進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)（所有實(shí)驗(yàn)流程見圖1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Figure 1 Experimental design

大鼠術(shù)前禁食24 h，自由飲水，氣體麻醉（5%異氟烷，0.8 L／min）。 將動(dòng)物固定在立體定位儀上，于右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束［15］（MFB）（AP：－4.3 mm，R： ＋1.5 mm，H：－7.6 ～7.8 mm），以1 μL／min 的速度注射6-OHDA（2 μg／μL）4 μL，完成注射后留針3 ～5 min 后退針并縫合傷口。 對(duì)照組注射4 μL 0.9%生理鹽水。 術(shù)后第14、28 天腹腔注射阿撲嗎啡（apomorphine，APO）誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)于安靜環(huán)境中進(jìn)行，按照0.1 mg／100 g 劑量將APO 溶液注射于大鼠頸部皮下，計(jì)數(shù)30 min 內(nèi)旋轉(zhuǎn)次數(shù)，結(jié)果以向健側(cè)旋轉(zhuǎn)（用逆時(shí)針向旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減去順時(shí)針向旋轉(zhuǎn)圈數(shù)） ≥210 r／30 min 者視為成功模型。

1.2.2 跑臺(tái)訓(xùn)練方案

采用勻速跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)［16］（11 m／min，30 min／d，連續(xù)每周5 d，共4 周），訓(xùn)練于22：00 ～00：00 進(jìn)行。運(yùn)動(dòng)組于術(shù)后24 h 開始運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)訓(xùn)練，對(duì)于無法進(jìn)行奔跑的大鼠使用刷子驅(qū)趕或適當(dāng)用手托扶其軀干，以使其完成訓(xùn)練。 在此期間，安靜對(duì)照組大鼠置于跑臺(tái)旁側(cè)。

1.2.3 PD 大鼠的感覺運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試

圓筒測(cè)試（cylinder test）在手術(shù)后第1、4、7、11、14、21、28 天進(jìn)行，測(cè)試環(huán)境要求光強(qiáng)度20 Lux、無背景噪音室內(nèi)，記錄大鼠在玻璃圓筒內(nèi)的活動(dòng)情況。 根據(jù)大鼠觸壁情況計(jì)算圓筒測(cè)試得分＝健側(cè)前肢碰壁次數(shù)／前肢碰壁總次數(shù)［17］。

網(wǎng)格測(cè)試（grid-walking test）在手術(shù)后第1、4、7、11、14、21、28 天進(jìn)行，測(cè)試環(huán)境要求聲音安靜、光線昏暗的室內(nèi)。 將數(shù)碼攝像機(jī)固定于攝像機(jī)以置于金屬網(wǎng)格下方，記錄3 min 內(nèi)大鼠在網(wǎng)格上的活動(dòng)情況。 統(tǒng)計(jì)指標(biāo)：（1）四肢滑落次數(shù)，滑落行為包括：爪子完全滑落橫格、肢體落入網(wǎng)格間、爪子正確的放在橫格上，但是當(dāng)承受身體重量時(shí)滑落；（2）總步數(shù)；（3）行進(jìn)格數(shù)。

1.2.4 大鼠紋狀體酪氨酸羥化酶免疫組織化學(xué)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)第14、28 天運(yùn)動(dòng)干預(yù)后24 h 內(nèi)，大鼠氣體麻醉（5%異氟烷，0.8 L／min），由心主動(dòng)脈灌注37℃生理鹽水（0.9%）200 mL，灌流結(jié)束后迅速取出腦組織置于4%的多聚甲醛溶液中固定（24 h）。將腦組織取出后脫水后修塊、包埋處理，將腦組織按冠狀面修整并連續(xù)冠狀切片，片厚30 μm。 將切好的腦片放在PBS 緩沖液中展開，然后進(jìn)行染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)各組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。 TH 數(shù)據(jù)各組間比較采用單因素方差分析，各組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)酪氨酸羥化酶陽性免疫細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

顯微鏡下選取1 個(gè)視野進(jìn)行觀察，SHAM 組大鼠右側(cè)Str 可見大量TH-ir 細(xì)胞，胞質(zhì)呈棕黃色，與此相比，PD 組大鼠右側(cè)Str 內(nèi)TH 細(xì)胞顯著減少，透光性增強(qiáng)。 半定量分析結(jié)果顯示：SHAM-S 組與SHAM-E 組大鼠右側(cè)Str 內(nèi)TH-ir 細(xì)胞數(shù)量差異無顯著性（P＞0.05）；術(shù)后第14、28 天，與SHAM-S 組相比，PDS 組TH 細(xì)胞分別減少約70%、80%，且差異均具有顯著性（P＜0.05）；術(shù)后第14、28 天，與SHAM-E 組相比，PDE 組TH 細(xì)胞分別減少約60%、62%，且差異均具有顯著性（P＜0.05）；術(shù)后第14、28 天，與PDS 組相比，PDE 組TH 細(xì)胞存有節(jié)余且差異均具有顯著性（P＜0.05）（見圖2）。 配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析比較PDS 組第14、28 天右側(cè)Str 內(nèi)TH 細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移TH 細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；而分析比較PDE 組第14、28 天右側(cè)Str 內(nèi)TH 細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移TH 細(xì)胞數(shù)量差異不具有顯著性（P＞0.05）。

圖2 大鼠Str（右側(cè)）TH 陽性細(xì)胞占比Figure 2 Str （right） density ratio of TH-ir fibers

2.2 各組大鼠圓筒測(cè)試結(jié)果

SHAM-S 組與SHAM-E 組在第1、4、7、11、14、21、28 天的測(cè)試得分均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與SHAM-S 組相比，PDS 組在第1、4、7、11、14、21、28 天的測(cè)試得分均顯著增加（P＜0.05），有較明顯的前肢活動(dòng)不對(duì)稱現(xiàn)象存在。 與SHAM-E 組相比，PDE 組在第1、4、7、11、14、21 天的測(cè)試得分均顯著增加（P＜0.05），有較明顯的前肢活動(dòng)不對(duì)稱現(xiàn)象存在，但是二者在第28 天的得分無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 與PDS 組相比，PDE 組在第1、4、7、11、14天的測(cè)試得分無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是PDE組在第21、28 天的得分顯著減少（P＜0.05），有較明顯的左前肢活動(dòng)恢復(fù)現(xiàn)象存在（見圖3）。

圖3 圓筒測(cè)試得分值比較（ ± s）Figure 3 Comparison of cylinder test scores（ ± s）

2.3 各組大鼠網(wǎng)格測(cè)試結(jié)果

SHAM-S 組與SHAM-E 組在第1、4、7、11、14、21、28 天的左側(cè)前肢滑落次數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 與SHAM-S 組相比，PDS 組在第1、4、7、11、14、21、28 天的左側(cè)前肢滑落次數(shù)均顯著增加（P＜0.05）。 與SHAM-E 組相比，PDE 組在第1、4、7、11天的左側(cè)前肢滑落次數(shù)均顯著增加（P＜0.05），但二者在第14、21、28 天的左側(cè)前肢滑落次數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PDE 組的左側(cè)前肢滑落次數(shù)有明顯減少的現(xiàn)象存在。 與PDS 相比，PDE 組在第1、4 天的左側(cè)前肢滑落次數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但在第7、11、14、21、28 天的左側(cè)前肢滑落次數(shù)均顯著減少（P＜0.05）（見圖4）。

圖4 網(wǎng)格測(cè)試左側(cè)前肢滑落次數(shù)比較（ ± s）Figure 4 Comparison of left forelimb slips in grid test（ ± s）

與SHAM-S 組相比，SHAM-E 組在第1、4、7、11、14、21、28 天的左側(cè)后肢滑落次數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 與SHAM-S 相比，PDS 組在第1、7、11、14、21、28 天的左側(cè)后肢滑落次數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但在第4 天PDS 組的左側(cè)后肢滑落次數(shù)顯著增加（P＜0.05）。 與SHAM-E 相比，PDE組在第1、4、7 天的左側(cè)后肢滑落次數(shù)均顯著增加（P＜0.05），但二者在第11、14、21、28 天的左側(cè)后肢滑落次數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 與PDS組相比，PDE 組在第1、4、7、11、14、21、28 天的左側(cè)后肢滑落次數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖5）。

圖5 網(wǎng)格測(cè)試左側(cè)后肢滑落次數(shù)比較（ ± s）Figure 5 Comparison of left hindlimb slips in grid test（ ± s）

與SHAM-S 組相比，SHAM-E 組在第1、4、7、11、14、21、28 天的總步數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與SHAM-S 組相比，PDS 組在第1、4、7、11、14、21、28 天的總步數(shù)均顯著減少（P＜0.05）。 與SHAME 組相比，PDE 組在第1、4、7、11、14、21、28 天的總步數(shù)均顯著減少（P＜0.05）。 與PDS 組相比，PDE組在第1 天的總步數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在第4、7、11、14、21、28 天的總步數(shù)均顯著增加（P＜0.05）（見圖6）。

圖6 網(wǎng)格測(cè)試總步數(shù)比較（ ± s）Figure 6 Comparison of total steps in grid test（ ± s）

與SHAM-S 組相比，SHAM-E 組在第1、4、7、11、14、21、28 天的行進(jìn)格數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 與SHAM-S 組相比，PDS 組在第1、4、7、11、14、21、28 天的行進(jìn)格數(shù)均顯著減少（P＜0.05）。與SHAM-E 組相比，PDE 組在第1、4、7、11、14、21、28 天的行進(jìn)格數(shù)均顯著減少（P＜0.05）。 與PDS組相比，PDE 組在第1 天的行進(jìn)格數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但PDE 組在第4、7、11、14、21、28 天的行進(jìn)格數(shù)均顯著增加（P＜0.05）（見圖7）。

圖7 網(wǎng)格測(cè)試行進(jìn)格數(shù)比較（ ± s）Figure 7 Comparison of progress girds in grid test（ ± s）

3 討論

PD 是以運(yùn)動(dòng)功能障礙為主要臨床特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)徐緩、肌肉僵直、姿勢(shì)步態(tài)異常、靜止性震顫及動(dòng)作協(xié)調(diào)模式轉(zhuǎn)換能力降低等［18－21］。 PD 患者DA 能神經(jīng)元丟失發(fā)生比較隱匿，因此，臨床將運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分作為判斷PD 患者DA 能神經(jīng)元存活率的參考依據(jù)。

感覺運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)由感覺聯(lián)合皮質(zhì)、第二運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、主運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、小腦、基底神經(jīng)節(jié)、感覺運(yùn)動(dòng)脊髓環(huán)路共同構(gòu)成，按其結(jié)構(gòu)等級(jí)可劃分為上級(jí)的皮質(zhì)聯(lián)合及下級(jí)聯(lián)合。 感覺運(yùn)動(dòng)發(fā)起于皮質(zhì)聯(lián)合，執(zhí)行過程中感覺傳入持續(xù)監(jiān)測(cè)并反饋運(yùn)動(dòng)的發(fā)出是其主要特征［22］。 實(shí)驗(yàn)中，損傷動(dòng)物一側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、紋狀體或黑質(zhì)-紋狀體通路均可引起對(duì)側(cè)軀體感覺運(yùn)動(dòng)功能的減少或同側(cè)功能的增進(jìn)［23］，即感覺運(yùn)動(dòng)出現(xiàn)不對(duì)稱性現(xiàn)象。 利用這一特性，本研究分別使用圓筒測(cè)試、網(wǎng)格測(cè)試對(duì)PD 模型大鼠的感覺運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行測(cè)評(píng)。 大量研究證實(shí)自發(fā)性運(yùn)動(dòng)與強(qiáng)迫性運(yùn)動(dòng)均有助于PD 模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙的改善及恢復(fù)。 本研究發(fā)現(xiàn)：伴隨6-OHDA 注射后運(yùn)動(dòng)的早期介入，PDE 組大鼠的圓筒測(cè)試得分曲線呈現(xiàn)平穩(wěn)下降趨勢(shì)，而PDS 組呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)。 伴隨運(yùn)動(dòng)干預(yù)的介入與持續(xù)，左側(cè)前肢的受損狀態(tài)逐漸改善，雙側(cè)前肢的使用程度逐漸趨近于平衡，PD 大鼠在運(yùn)動(dòng)介入初期便可使其受損的感覺運(yùn)動(dòng)功能受到保護(hù)與修復(fù)，提示早期進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)可能更有助于PD 模型大鼠感覺運(yùn)動(dòng)功能損傷癥狀的減輕以及病程的改善。

運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用是指在PD 模型損傷前、損傷即刻介入運(yùn)動(dòng)所誘發(fā)的針對(duì)DA 能神經(jīng)元凋亡的保護(hù)效應(yīng)。 大量研究已經(jīng)證實(shí)，運(yùn)動(dòng)有利于治療PD：跑步機(jī)訓(xùn)練以及游泳等有氧運(yùn)動(dòng)有助于PD 患者步態(tài)和平衡能力的恢復(fù)［24－25］，拳擊操、太極拳等運(yùn)動(dòng)可以顯著改善PD 患者精細(xì)運(yùn)動(dòng)的功能障礙［26］。 當(dāng)前研究認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的DAT 及VMAT-2水平下調(diào)是誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用的主要因素［27］，而運(yùn)動(dòng)干預(yù)介入時(shí)間及造模病毒注射滴度是影響神經(jīng)保護(hù)作用的重要因素［28］。 本研究發(fā)現(xiàn)建模后即刻介入運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以顯著減緩黑質(zhì)-紋狀體DA 通路Str 內(nèi)TH 含量的降低，提示早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以有效延緩PD 模型大鼠黑質(zhì)-紋狀體通路DA 能神經(jīng)元壞死。 其機(jī)制可能與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的神經(jīng)再生，降低DAT的表達(dá)，減少DA 的清除率，增加DA 囊泡釋放有關(guān)［29－31］。

綜上所述，本研究探索了早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)PD大鼠模型感覺運(yùn)動(dòng)功能的影響，研究結(jié)果提示早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以有效抑制黑質(zhì)-紋狀體通路DA 含量的下降，改善PD 模型大鼠的感覺運(yùn)動(dòng)功能障礙，并且運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果隨干預(yù)時(shí)間的延長增強(qiáng)。