尚培駿姬乃春楊錦雯趙沅杰拓振杰張曉華

（1. 西安醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，西安 710021；2. 陜西省腦疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／西安醫(yī)學(xué)院運(yùn)動(dòng)健康研究中心，西安 710021；3. 廈門大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所／福建省神經(jīng)退行性疾病及衰老研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005）

動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)為研究大腦認(rèn)知功能、情緒功能和相關(guān)病理生理學(xué)提供重要依據(jù)，現(xiàn)已成為神經(jīng)病理學(xué)理論重要支撐之一［1］。 不同于人類的認(rèn)知功能可通過讀寫等直觀方式反映，動(dòng)物的認(rèn)知功能需要通過測量其學(xué)習(xí)記憶等方面體現(xiàn)進(jìn)行評價(jià)［2］。在眾多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，小鼠等嚙齒類動(dòng)物因其喜歡探索陌生事物和環(huán)境的天性［3］，成為典型動(dòng)物行為學(xué)模型之一。 在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)者可借助實(shí)驗(yàn)器材創(chuàng)造多種合適的刺激點(diǎn)與刺激條件，以便更好地觀測小鼠運(yùn)動(dòng)能力、探索行為、學(xué)習(xí)記憶行為等，進(jìn)而幫助研究基因工程小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、觀察小鼠的用藥反應(yīng)情況、評價(jià)藥物的安全性和可靠性，為研究疾病發(fā)病機(jī)制等提供重要依據(jù)。 目前，學(xué)習(xí)記憶相關(guān)行為已被認(rèn)為是探索人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病最簡單、直接且安全的研究方法［4］。 隨著記憶學(xué)研究的快速發(fā)展，學(xué)習(xí)記憶理論不斷涌現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型發(fā)展道路也在不斷向前，各類型記憶被不斷地發(fā)現(xiàn)、定義，為神經(jīng)生理學(xué)和心理學(xué)提供研究基礎(chǔ)［5］。 目前主要的學(xué)習(xí)記憶相關(guān)行為學(xué)方法包括各種迷宮、曠場實(shí)驗(yàn)、新物體識別實(shí)驗(yàn)、情景恐懼實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)等。 但究竟在何種情況下采用何種實(shí)驗(yàn)方法沒有精確地劃分。

《柳葉刀》2020 年發(fā)布的一項(xiàng)報(bào)告顯示，全球約有5000 萬人患有癡呆癥，預(yù)計(jì)這一數(shù)字到2050 年將增加到1.52 億［6］。 目前65 歲以上老年人患有阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的比例約占11%，85 歲以上的老年人患病比例更是高達(dá)42%。APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠是AD 主要的動(dòng)物模型之一，該小鼠表達(dá)突變的人類早老素（Presenilin1，PS1） （DeltaE9） 和人鼠淀粉樣前蛋白融合體（APPswe）［7］，這兩個(gè)基因的表達(dá)都由小鼠朊病毒蛋白啟動(dòng)子啟動(dòng)［8］。APP基因是AD 病理癥狀之一老年斑成分人淀粉樣蛋白β（Amyloid β，Aβ）的前體蛋白。 人類早老素基因DeltaE9 突變是該基因的第9個(gè)外顯子缺失產(chǎn)生的［9］，此突變會導(dǎo)致早發(fā)性老年癡呆癥［10］。 因此，為了探索學(xué)習(xí)記憶相關(guān)行為學(xué)的特點(diǎn)，本研究通過分析對比APP／PS1 小鼠和野生型小鼠在不同行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)能力、新物體識別能力以及學(xué)習(xí)與記憶能力的表現(xiàn)，綜合各實(shí)驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)和評價(jià)指標(biāo)，闡述各種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)和應(yīng)用特點(diǎn)，為研究者采取合理的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法提供更好的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級C57BL／6J 背景的APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因健康小鼠和野生型C57BL／6J 雄性健康小鼠，3 月齡各60 只、6 月齡各95 只；3 月齡體重22.7 ～25.2 g；6月齡體重29.5 ～34.5 g，購于北京華阜康生物科技有限公司【SCXK（京）2019－0008】，飼養(yǎng)于西安醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK（陜）2022－04】，環(huán)境溫度維持（23 ± 1）℃，12 h 光照循環(huán)。 除T 迷宮實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)行饑餓處理外，小鼠其余時(shí)間均自由采食、飲水。動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)全程在西安醫(yī)學(xué)院SPF 級動(dòng)物行為室進(jìn)行，遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南【GB／T35892－2018】，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會審批（XYLS 2019016）。

1.1.2 主要試劑與儀器

APP、PS1 引物 （ 金斯瑞， RP10004CN、RP10009CN），50 × TAE（生工，B548101），瓊脂糖（吉至，9012-36-6），DNA ladder 核酸燃料（碧云天，D0139），4 × Taq Master Mix，8 × DNA 緩沖液（碧云天， D0072）， DL2000 DNA marker （ 賽默飛，SM1391），新潔爾滅（利爾康，30701122），75%乙醇（利爾康，ri5FTXeVtZj5），蒸餾水。 T 迷宮（Noldus，T-Maze）、Y 迷宮（Noldus，Y maze）、新物體識別探索箱（ Noldus， PhenoTyper ）、 曠場箱 （ Noldus，PhenoTyper）、疲勞轉(zhuǎn)棒儀（眾實(shí)科技，ZB ～200），動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)（Noldus EthoVision XT）、小動(dòng)物行為學(xué)視頻記錄與分析系統(tǒng)（Panlab SMART 3.0），攝像頭（SONY，F(xiàn)CB-EW9500H）。

1.2 方法

1.2.1 Y 迷宮

Y 迷宮是基于嚙齒動(dòng)物對新環(huán)境的自發(fā)探索能力而設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)裝置，由三個(gè)完全相同的臂組成、三個(gè)臂之間為120°夾角，呈Y 字形分布（如圖1）。小鼠在前一次的記憶基礎(chǔ)上做出下一次進(jìn)臂選擇，令其不斷進(jìn)出各個(gè)臂［11］，是測量動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的典型方法。 根據(jù)分析小鼠探索進(jìn)入各臂的次數(shù)、順序進(jìn)而反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的瞬時(shí)記憶能力（instantaneous memory）［12］。 相比于其他實(shí)驗(yàn)方法，Y 迷宮更加偏向于工作記憶，在加工存儲短時(shí)間內(nèi)記憶的能力有更為直觀地表現(xiàn)［13］，較為簡便且無需動(dòng)物學(xué)習(xí)任何規(guī)則來進(jìn)行趨利避害［14］，有一定的實(shí)用性。

圖1 Y 迷宮示意圖Figure 1 Schematic diagram of Y maze

實(shí)驗(yàn)選用3 月齡、6 月齡的AD 小鼠與WT 小鼠各20 只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開始隨機(jī)選取一臂為起始臂并將小鼠放置于起始臂末，讓小鼠進(jìn)行自由探索8 min， 記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡與進(jìn)臂次數(shù)N，記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡的自主交替進(jìn)臂數(shù)（alternation，如ABC）：計(jì)算自主交替率，即alternations／（N-2）、在探索結(jié)束一臂后返回上一探索臂的自主返回?cái)?shù)（return，如ABA）以及在兩次連續(xù)探索同一臂的自主重復(fù)數(shù)（repeated）的自主返回率和自主重復(fù)率［15］。

注意事項(xiàng)：（1）Y 迷宮三臂內(nèi)部各有不同標(biāo)記，協(xié)助小鼠分辨三臂。 （2）每組小鼠隨機(jī)從不同的起始臂進(jìn)入，每只小鼠實(shí)驗(yàn)完成后需用乙醇、新潔爾滅、蒸餾水依次擦拭迷宮，消除因上一只小鼠氣味遺留造成的影響。 （3）實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)人員切勿隨意走動(dòng)，切勿移動(dòng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備或發(fā)出噪音。 （4）小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)期間，應(yīng)保持室內(nèi)環(huán)境接近飼養(yǎng)環(huán)境溫度，過高或過低會導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生煩躁或戰(zhàn)栗，使其拒絕探索。 （5）以小鼠尾根進(jìn)入虛線位置（見圖1虛線）為進(jìn)臂標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 T 迷宮

T 迷宮由一起始臂以及兩對稱的目標(biāo)臂構(gòu)成，起始臂（start arm）和目標(biāo)臂（goal arm）夾角90°。 相較于其他實(shí)驗(yàn)，T 迷宮利用動(dòng)物覓食行為和對周圍環(huán)境探索的習(xí)性［16］，在測定動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶能力中的長時(shí)記憶方面擁有更高的準(zhǔn)確性［17］。 實(shí)驗(yàn)以小鼠是否選擇正確目標(biāo)臂為標(biāo)準(zhǔn)，對小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力進(jìn)行評判［18］。 T 迷宮通常用來研究動(dòng)物的空間工作記憶（spatial working memory），即測定動(dòng)物在一定規(guī)則下對有用的信息的記憶存儲及提取。經(jīng)改進(jìn)后的T 迷宮實(shí)驗(yàn)方法也可用來評價(jià)參考記憶（reference memory），即小鼠自己與記憶產(chǎn)生聯(lián)系后，探究小鼠行為與記憶之間的相互影響［19］。 常見的T 迷宮有誘導(dǎo)探索型實(shí)驗(yàn)（Ⅰ型T 迷宮）與懲罰型實(shí)驗(yàn)（Ⅱ型T 迷宮）兩種。

Ⅰ型T 迷宮，通過借助食餌，誘導(dǎo)小鼠探索迷宮［20］。 誘導(dǎo)探索階段，在迷宮各臂放置2 ～3 個(gè)食餌，誘導(dǎo)小鼠探索迷宮3 min，適應(yīng)3 d。 待小鼠完全適應(yīng)迷宮之后，在兩目標(biāo)臂末端放置食餌后隨機(jī)關(guān)閉一臂（如圖2 單虛線）。 實(shí)驗(yàn)選用6 月齡AD 小鼠和WT 小鼠各10 只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開始將小鼠放于起始臂末端開始計(jì)時(shí)，讓小鼠自由覓食，直至小鼠接觸食餌，停止計(jì)時(shí)，此段時(shí)間記為訓(xùn)練時(shí)間；待小鼠離開食餌區(qū)域，將小鼠帶離迷宮，一段時(shí)間后（適應(yīng)階段間隔5 s，實(shí)驗(yàn)階段第1 次間隔20 s、第2 次間隔1 min 重復(fù)實(shí)驗(yàn)）將小鼠重新放回起始臂，打開封閉臂閘門，讓小鼠自由探索，在新的、有食餌的臂（即原封閉臂）和舊的、無食餌的臂進(jìn)行選擇，以第1 次進(jìn)入目標(biāo)臂為評判標(biāo)準(zhǔn)，若進(jìn)入原封閉臂記得分為1，反之為0；在接觸食餌后停止計(jì)時(shí)，記為記憶時(shí)間。 1 h 后再測試一輪［21］。

圖2 T 迷宮示意圖Figure 2 Schematic diagram of T maze

Ⅱ型T 迷宮實(shí)驗(yàn)存在特殊的懲罰機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)適應(yīng)階段，讓小鼠在T 迷宮內(nèi)自由探索3 d，每天3 min。 在小鼠熟悉迷宮之后，第4 天讓每只小鼠自主探索T 迷宮3 ～5 次，記錄進(jìn)入次數(shù)多的一側(cè)，并記為偏好臂［22］。 選用6 月齡AD 小鼠和WT 小鼠各15 只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開始，將各小鼠對應(yīng)偏好臂閘門關(guān)閉，迷宮另一臂末端放置食餌。 第一步將小鼠放于起始臂末端讓小鼠自由探索且開始計(jì)時(shí)，直至小鼠接觸食餌［23］，停止計(jì)時(shí)并記此段時(shí)間為學(xué)習(xí)時(shí)間；間隔10 s 后，將小鼠重新放回起始臂末端，打開偏好臂閘門并開始計(jì)時(shí)，若小鼠進(jìn)入非偏好臂（放置食餌的臂）則計(jì)得分為1，若小鼠進(jìn)入偏好臂，計(jì)得分為0，并且關(guān)閉偏好臂閘門懲罰小鼠，10 s 后打開閘門并繼續(xù)記錄進(jìn)入非偏好臂次數(shù)，直至再次觸碰非偏好臂食餌［24］停止計(jì)時(shí)，記此時(shí)間段為記憶時(shí)間。

注意事項(xiàng)：（1）誘導(dǎo)時(shí)應(yīng)選擇氣味較小的食餌，避免小鼠以嗅覺取代記憶引起實(shí)驗(yàn)誤差。 （2）食餌體積不宜過小，擱置在每臂中央，便于小鼠發(fā)現(xiàn)食餌。 （3）Ⅱ型T 迷宮中小鼠3 min 內(nèi)未探索或Ⅰ型T 迷宮小鼠5 min 內(nèi)未探索則排除此次實(shí)驗(yàn)。 （4）每組實(shí)驗(yàn)完成后，待小鼠停止進(jìn)食后再將小鼠取出，避免小鼠受到驚嚇造成后續(xù)實(shí)驗(yàn)誤差，每只小鼠做完一輪實(shí)驗(yàn)要采用新潔爾滅、乙醇和水分別擦拭迷宮。 （5）以小鼠尾根部為標(biāo)準(zhǔn)評判是否進(jìn)臂。

1.2.3 新物體識別

新物體識別實(shí)驗(yàn)是基于人類患有失憶癥時(shí)識別環(huán)境的差異而發(fā)展起來的，用于評價(jià)嚙齒動(dòng)物的新物體識別記憶能力與識物記憶。 本實(shí)驗(yàn)基于小鼠在新環(huán)境下自由探索的習(xí)性和對新物體的好奇心［25］。 該實(shí)驗(yàn)無需像迷宮實(shí)驗(yàn)，以食物為介控制小鼠，也不需要像轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)一樣強(qiáng)制小鼠運(yùn)動(dòng)，完全依靠小鼠在密閉空間下的自由探索能力，發(fā)現(xiàn)周圍環(huán)境變化。 在小鼠自由記憶的情況下，更能模擬人類學(xué)習(xí)、記憶的行為，借此用來評估改善記憶藥物的效果［26］。

實(shí)驗(yàn)選用3 月齡、6 月齡AD 和WT 小鼠各25只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)階段和測試階段。 在適應(yīng)階段之前，需進(jìn)行3 d 的熟悉過程。 實(shí)驗(yàn)人員每天將小鼠放到手上撫觸5 min，借此消除小鼠緊張恐懼感，并熟悉實(shí)驗(yàn)者氣味。 實(shí)驗(yàn)開始前，剔除活動(dòng)異常小鼠（活動(dòng)過少、活動(dòng)過多、轉(zhuǎn)圈等），符合標(biāo)準(zhǔn)的小鼠在無物體箱體中每天自由探索3 min，待3 d后小鼠熟悉實(shí)驗(yàn)箱體內(nèi)環(huán)境［27］，正式開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟如下。 實(shí)驗(yàn)開始：T1 階段，分別在箱體底板對角放置兩完全相同的物體A、B，將小鼠放入密閉環(huán)境的箱體中，讓小鼠在A、B 兩物體周圍探索時(shí)間累計(jì)25 s（以鼻尖湊近物體約2 ～3 cm 為標(biāo)準(zhǔn)），或3 min 內(nèi)探索時(shí)間還不到25 s 則停止探索，將小鼠放回飼養(yǎng)籠，停止T1 階段。 1 h、24 h 后分別開始短期、長期T2 階段測試，將其中一個(gè)物體換成新的物體b，物體放置位置不變，再次將小鼠放入箱體進(jìn)行探索，當(dāng)小鼠在A、b 兩物體周圍探索時(shí)間累計(jì)15 s，或5 min 內(nèi)探索時(shí)間還不到15 s 則停止探索，將小鼠放回飼養(yǎng)籠，停止T2 階段，見圖3。

圖3 新物體識別實(shí)驗(yàn)示意圖Figure 3 Schematic diagram of new object recognition test

注意事項(xiàng)：（1）探索物體的時(shí)間需要根據(jù)小鼠的學(xué)習(xí)能力摸索，與年齡和基因型密切相關(guān)［28］。（2）物體可以選擇不同材質(zhì)、形狀和顏色［29］；具有一定重量，防止小鼠推翻；應(yīng)保證新舊物體存在差異；避免選擇太過鮮艷的顏色，如橙色。 （3）每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完成后需擦拭糞便尿液，因?qū)嶒?yàn)在密閉空間內(nèi)進(jìn)行，在清潔箱體時(shí)切勿用乙醇等刺激性試劑擦拭［30］。 （4）每組實(shí)驗(yàn)完畢后，先取出物體，后取出小鼠，減少對動(dòng)物的刺激。

1.2.4 曠場實(shí)驗(yàn)

曠場實(shí)驗(yàn)常用于檢測嚙齒動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力、探索能力、活躍性以及對曠場的畏懼程度。 自20 世紀(jì)40 年代被學(xué)者發(fā)明以來，曠場實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到神經(jīng)生物學(xué)研究與生物節(jié)律當(dāng)中。 曠場實(shí)驗(yàn)一方面利用了動(dòng)物畏懼空曠場地的天性，激發(fā)動(dòng)物趨利避害的內(nèi)在特點(diǎn)［31］，用來評價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)和情緒行為。 另一方面，利用小鼠在好奇心的驅(qū)使下探索新環(huán)境，曠場也為新物體識別實(shí)驗(yàn)的建立提供一定的前提基礎(chǔ)［32］。

選用6 月齡AD 小鼠和WT 小鼠各15 只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開始前，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)消除小鼠的恐懼。實(shí)驗(yàn)開始將小鼠放入箱體3 min，攝像頭記錄行動(dòng)軌跡。 通過軟件分析其在中央?yún)^(qū)與周邊區(qū)逗留時(shí)間、速度和運(yùn)動(dòng)距離，以及直立次數(shù)和理毛行為等，見圖4。

圖4 曠場實(shí)驗(yàn)示意圖Figure 4 Schematic diagram of open-field

1.2.5 轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)為檢測嚙齒動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能、抗疲勞能力和晝夜節(jié)律提供了方法，主要用于運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性、平衡感測試、抗疲勞藥物篩選和鑒定，也可間接反映動(dòng)物的晝夜節(jié)律［33］。 實(shí)驗(yàn)期間，當(dāng)動(dòng)物被放置在滾筒中央的轉(zhuǎn)棒上時(shí)，為避免滑落，需調(diào)整平衡，隨轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)動(dòng)而跑動(dòng)。 通過測量動(dòng)物在滾筒上行走的時(shí)間來評定實(shí)驗(yàn)對象的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?4］。

轉(zhuǎn)棒疲勞儀以動(dòng)物運(yùn)動(dòng)時(shí)間作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，若動(dòng)物掉落，儀器將自動(dòng)記錄動(dòng)物在轉(zhuǎn)棒上的堅(jiān)持時(shí)間以及滑落瞬間轉(zhuǎn)棒的速度。 因小鼠的協(xié)調(diào)性由小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)決定，協(xié)調(diào)性越差的小鼠會在越短時(shí)間內(nèi)從轉(zhuǎn)棒下掉落［35］。 轉(zhuǎn)棒疲勞儀運(yùn)動(dòng)能力在帕金森病、酒精依賴、亨廷頓病、智力發(fā)育、運(yùn)動(dòng)失調(diào)和阿爾茨海默病的藥物評價(jià)等研究上，被認(rèn)為是非常重要的檢測指標(biāo)［36］。 實(shí)驗(yàn)選用3 月齡、6 月齡AD 和WT 小鼠各15 只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)適應(yīng)階段分為三個(gè)階段，三個(gè)階段間無時(shí)間間隙：T1 階段，轉(zhuǎn)棒以加速度5 r／min2從靜止開始勻加速至速度為5 r／min；T2 階段，更改加速度為10 r／min2，加速至15 r／min 后勻速轉(zhuǎn)動(dòng)2 min；T3 階段，繼續(xù)以加速度10 r／min2加速至20 r／min 后繼續(xù)勻速2 min。 若小鼠在測試過程中掉落，記錄掉落時(shí)間［37］，待20 min 后重新對掉落小鼠開始實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒上持續(xù)的時(shí)間。 小鼠在進(jìn)行適應(yīng)實(shí)驗(yàn)期間訓(xùn)練小鼠體力，加強(qiáng)小鼠協(xié)調(diào)能力。 正式實(shí)驗(yàn)階段，T1、T2、T3 各階段加速度不變，結(jié)束時(shí)勻速速度分別達(dá)到5 r／min、 15 r／min、18 r／min， 記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒持續(xù)時(shí)間。

注意事項(xiàng)：（1）測試期間，舍棄連續(xù)3 次以上實(shí)驗(yàn)失敗的小鼠。 （2）待小鼠穩(wěn)定站立在轉(zhuǎn)棒上時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。 （3）選擇擁有高摩擦系數(shù)的轉(zhuǎn)棒材質(zhì)。

1.2.6APP／PS1 小鼠的培育

實(shí)驗(yàn)所用APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠品系為APPswe／PSEN1dE9（C57BL／6J），該小鼠攜帶小鼠朊病毒蛋白啟動(dòng)子啟動(dòng)下的突變的人早老素基因PSEN1（DeltaE9）和人鼠淀粉樣前蛋白（APPswe）融合體，其中PSEN1 的DeltaE9 突變是該基因的第9個(gè)外顯子缺失產(chǎn)生的，此突變會導(dǎo)致早發(fā)性老年癡呆癥。 設(shè)計(jì)了APP和PSEN1 的引物，序列如表1，進(jìn)行基因鑒定。 該小鼠在大約4 個(gè)月皮層開始出現(xiàn)淀粉樣斑塊，在大約6 個(gè)月時(shí)海馬中出現(xiàn)淀粉樣斑塊，并且隨著年齡的增長而增加大小和數(shù)量。

表1 APP／PS1 小鼠引物序列Table 1 APP／PS1 mouse primer sequences

1.2.7APP／PS1 基因鑒定

實(shí)驗(yàn)用APP、PS1，兩種引物對小鼠的基因型進(jìn)行鑒定，當(dāng)小鼠共同表達(dá)APP／PS1 基因時(shí)，鑒定為APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因。 小鼠使用雙面耳標(biāo)進(jìn)行序列編號，以鼠尾為標(biāo)本提取DNA。

（1）組織的消化

將Protease Plus 與Buffer L 按1 ∶50 配制，充分混合后向含有樣本的EP 管內(nèi)加入100 μL 新鮮消化液，55℃金屬?。》磻?yīng)30 min（確保鼠尾完全浸入消化液中），后將樣本在95℃金屬?。≈蟹跤? min 以滅活反應(yīng)蛋白酶。 以12 000 r／min 離心5 min 后取含有DNA 的上清液為PCR 模板。

（2）PCR 的擴(kuò)增

反應(yīng)體系在配置過程中，最好處于低溫情況下，以確保PCR 擴(kuò)增的效率以及特異性。 配置比例（見表2）。 將上述配置好的樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，程序?yàn)椋ㄒ妶D5）：①94℃預(yù)變性5 min（1 次循環(huán)）；②94℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s（35 次循環(huán)）；③72℃充分延伸5 min（1 次循環(huán)）；④擴(kuò)增結(jié)束4℃保持。

表2 反應(yīng)體系的配置Table 2 Configuration of reaction system

圖5 PCR 擴(kuò)增程序Figure 5 PCR amplification procedure

（3）瓊脂糖凝膠電泳

在1 × TAE 溶液中加入2%瓊脂糖，微波加熱充分溶解后，待冷卻至50℃時(shí)加入核酸染料，充分混勻后倒入模具。 凝固后浸入含有1 × TAE 溶液的電解槽中待用；DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物與DNA 緩沖液混合后以8～10 μL 每孔上樣，上樣完畢后以120 V 恒壓電泳25 min。

以上各種實(shí)驗(yàn)方法的設(shè)備、評價(jià)指標(biāo)、應(yīng)用特點(diǎn)的比較見表3，各種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較見表4。

表4 不同行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 4 Comparison of the advantages and disadvantages of different behavior tests

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)誤差（±s）表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 軟件，數(shù)據(jù)通過t檢驗(yàn)（或mann-whitney 非參數(shù)檢驗(yàn)），當(dāng)P＜0.05 為具有顯著性差異，作圖采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件。

2 結(jié)果

2.1 APP／PS1 小鼠基因鑒定

裂解鼠尾提取DNA，經(jīng)PCR 和瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型，核酸凝膠成像結(jié)果顯示，GAPDH內(nèi)參條帶在391 bp，APP基因條帶在344 bp，PS1 基因條帶在608 bp，結(jié)果見圖6 ～8，可以看到編號為288、289、290、292、293、294、296、297、298、352、353、363、365、366、368、371、373、374、375、376、378 和380 小鼠為APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠，其余為野生型小鼠。

圖6 GAPDH 鑒定結(jié)果Figure 6 GAPDH identification results

圖8 PS1 基因型鑒定結(jié)果Figure 8 PS1 genotype identification results

2.2 APP／PS1 和WT 小鼠的工作記憶存在差異且均隨月齡增大呈下降趨勢

Y 迷宮可以測試小鼠的工作記憶能力。 6 月齡APP／PS1 小鼠相比于WT 小鼠在自主返回率更高，有顯著性差異性（P＜0.05，圖9），說明同月齡APP／PS1 小鼠工作記憶能力較WT 小鼠差；此外，6 月齡APP／PS1 小鼠的自主交替率較3 月齡小鼠顯著降低（P＜0.05，圖9），自主返回率頻率顯著增加（P＜0.001，圖9），WT 小鼠的自主交替率頻率也隨月齡增加而減少，自主重復(fù)率頻率隨月齡增加而增加，但無顯著性差異，見圖9。 以上結(jié)果表明，六月齡APP／PS1 和WT 小鼠工作記憶能力有差異，且APP／PS1 小鼠隨月齡增加工作記憶下降更為明顯。

圖9 3 月齡和6 月齡APP／PS1 小鼠和WT 小鼠Y 迷宮差異比較Figure 9 Comparison of the differences in Y maze of APP／PS1 mice and WT mice at 3 and 6 months of age

2.3 APP／PS1 和WT 小鼠的記憶存儲和提取能力具有顯著性差異

T 迷宮可以同時(shí)測試小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，能夠反映記憶的存儲和提取。 基于Ⅰ型T 迷宮實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)6 月齡APP／PS1 小鼠在學(xué)習(xí)階段的第1 天記憶時(shí)間顯著長于WT 小鼠（P＜0.05，圖10A）；在測試階段，第1 天記憶時(shí)間顯著長于WT 小鼠（P＜0.05，圖10D），說明小鼠在第1 次學(xué)習(xí)和記憶環(huán)境下更敏感。 2 d 的測試階段，APP／PS1 小鼠在得分率方面均顯著低于WT 小鼠（P＜0.01，P＜0.05，圖10F，10G）。 說明APP／PS1 和WT 小鼠在學(xué)習(xí)與記憶時(shí)間和準(zhǔn)確率之間存在差異，APP／PS1 小鼠記憶提取能力顯著低于WT 小鼠。 基于Ⅱ型T 迷宮，APP／PS1 和WT 兩種小鼠在記憶時(shí)間方面未出現(xiàn)顯著性差異，但學(xué)習(xí)方面，APP／PS1 小鼠學(xué)習(xí)時(shí)間長于WT 小鼠（P＜0.001，圖10H，10I）；APP／PS1和WT 小鼠在得分率無明顯差別，見圖10。 綜上，APP／PS1 和WT 小鼠在記憶的存儲和提取方面存在差異，APP／PS1 小鼠較WT 小鼠記憶存儲時(shí)間顯著增加，記憶提取時(shí)間增加，記憶準(zhǔn)確率降低。

圖10 T 迷宮內(nèi)學(xué)習(xí)時(shí)間、記憶時(shí)間與得分Figure 10 Learning and memory duration and scores in T maze

2.4 APP／PS1 和WT 小鼠的新物體識別能力與識物記憶無明顯差異

新物體識別實(shí)驗(yàn)可以測試小鼠的識物記憶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是3 月齡還是6 月齡小鼠，APP／PS1和WT 小鼠對新物體識別記憶均無顯著性差異（P＞0.05），見圖11。 這與文獻(xiàn)報(bào)告不同［38］，可能是因?yàn)閷W(xué)習(xí)階段時(shí)長過短或者學(xué)習(xí)階段和測試階段的時(shí)間間隔不同引起的。

圖11 3 月齡和6 月齡APP／PS1 和WT 新物體識別實(shí)驗(yàn)識別參數(shù)Figure 11 Recognition index in the new object recognition test of APP／PS1 and WT mice at 3 and 6 month of age

2.5 APP／PS1 和WT 小鼠的運(yùn)動(dòng)能力、探索能力、活躍性以及對曠場的畏懼程度均存在差異

曠場實(shí)驗(yàn)著重于研究小鼠在密閉空間內(nèi)的運(yùn)動(dòng)能力、探索能力、活躍性以及對曠場的畏懼程度。實(shí)驗(yàn)表明：APP／PS1 小鼠的運(yùn)動(dòng)能力比同月齡WT小鼠弱，表現(xiàn)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離顯著低于WT 小鼠（P＜0.01，圖12A）；因兩種小鼠移動(dòng)速度也存在顯著性差異（P＜0.01，圖12B），所以說明APP／PS1 小鼠活躍性也比同月齡WT 小鼠的低；與WT 小鼠比較，APP／PS1 小鼠進(jìn)入中心曠場的次數(shù)同顯著降低（P＜0.01，圖12E），且APP／PS1 小鼠待在曠場中央?yún)^(qū)時(shí)間與周圍區(qū)域時(shí)間比顯著低于WT 小鼠（P＜0.01，圖12K），可得出結(jié)論，APP／PS1小鼠對曠場的畏懼程度高于WT 小鼠。 另外，APP／PS1 小鼠的直立次數(shù)顯著低于WT 小鼠（P＜0.001，圖12J），說明APP／PS1 小鼠較WT 小鼠的探索能力更弱，更容易對曠場產(chǎn)生畏懼和焦慮，見圖12。 綜上所述，APP／PS1 小鼠的的運(yùn)動(dòng)能力、探索能力、活躍性較WT 小鼠更差。

圖12 6 月齡APP／PPS1 和WT 小鼠在曠場實(shí)驗(yàn)的表現(xiàn)Figure 12 Performance of 6-month-old APP／PS1 and WT mice in the open field test

2.6 APP／PS1 和WT 小鼠中樞協(xié)調(diào)能力無明顯差異

轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)主要檢測小鼠的中樞協(xié)調(diào)能力，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，并未發(fā)現(xiàn)APP／PS1 和WT 小鼠在轉(zhuǎn)棒掉落時(shí)間方面的差異，說明中樞協(xié)調(diào)能力無顯著性差異（P＞0.05）， 見圖13。 這可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)棒疲勞儀更適用于檢測小鼠的與運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病如亨廷頓舞蹈癥和帕金森病，在學(xué)習(xí)與記憶方面僅可能作為輔助或參考指標(biāo)。

圖13 轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)掉落時(shí)間Figure 13 Dlatency to fall of rotarod test

3 討論

動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在藥理學(xué)中已被視為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法，同時(shí)也越來越多的被應(yīng)用在精神生理學(xué)及精神病理學(xué)的基礎(chǔ)研究中，如在帕金森病癥、酒精依賴綜合征、亨廷頓病、智力發(fā)育、運(yùn)動(dòng)失調(diào)［39］和阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用［40］。因此，了解和總結(jié)各種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)和適用范圍非常關(guān)鍵，能夠幫助研究者選擇更科學(xué)和精準(zhǔn)的方法觀察小鼠的行為學(xué)。 本文作者采用APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠兩種動(dòng)物，比較驗(yàn)證學(xué)習(xí)記憶相關(guān)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)、優(yōu)缺點(diǎn)、注意事項(xiàng)和應(yīng)用。 采用Y 迷宮、T 迷宮、新物體識別、曠場實(shí)驗(yàn)以及轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)對兩種小鼠進(jìn)行全面的對比分析。 5 種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)各有測試偏重，Y 迷宮測試工作記憶［41］，T 迷宮可以測試學(xué)習(xí)與記憶能力，特別能夠反映記憶的存儲和提取，新物體識別測試小鼠的新物體識別能力與識物記憶，曠場測試運(yùn)動(dòng)能力、探索能力、活躍性以及對曠場的畏懼程度，轉(zhuǎn)棒疲勞測試中樞協(xié)調(diào)能力。 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠因受雌激素影響，在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常表現(xiàn)出異常的行為，如潛伏期過長、易焦慮等情況，通常情況下，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)選擇雄性小鼠會使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定［42］。

基于APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠與WT 小鼠實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，在Y 迷宮中，同月齡的APP／PS1 小鼠與WT 小鼠的工作記憶能力有明顯差異，APP／PS1 小鼠較WT 小鼠自主交替率顯著降低，以及自主返回率顯著增加。 對比不同月齡的同類型小鼠發(fā)現(xiàn)，兩種小鼠的工作記憶能力均隨月齡增加而下降，且APP／PS1 小鼠相比于WT 小鼠下降更明顯。 說明APP／PS1 小鼠工作記憶能力顯著低于WT 小鼠。在T 迷宮中，APP／PS1 小鼠相比于WT 小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力差，表現(xiàn)為記憶的存儲和提取較慢，提取的準(zhǔn)確率較差，這與以往的報(bào)道是一致的［43］。 在新物體識別實(shí)驗(yàn)中，對比兩種小鼠的新物體識別能力，通過對比兩種小鼠的短時(shí)識物記憶和長時(shí)識物記憶兩個(gè)方面，并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，這與文獻(xiàn)報(bào)道不一致，這可能與學(xué)習(xí)和測試階段的間隔時(shí)長存在密切關(guān)系［44］，測試和訓(xùn)練階段間隔24 h，可能兩種小鼠的都遺忘了對舊物體的識別記憶。 在曠場實(shí)驗(yàn)中，WT 小鼠的運(yùn)動(dòng)能力、探索能力和活躍性均顯著高于APP／PS1 小鼠，對曠場的畏懼程度和焦慮程度低于APP／PS1 小鼠，也存在顯著差異性。 在轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)中，APP／PS1 小鼠與WT 小鼠的中樞協(xié)調(diào)能力無顯著差異性。

現(xiàn)如今，越來越多的動(dòng)物行為學(xué)模型被廣泛應(yīng)用到神經(jīng)系統(tǒng)疾病和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中［45］，這些模型都盡可能去貼合小鼠生性習(xí)慣，對多種動(dòng)物的研究和藥品應(yīng)用提供路徑。 研究對比了5 種學(xué)習(xí)記憶相關(guān)行為學(xué)的特點(diǎn)、優(yōu)缺點(diǎn)、注意事項(xiàng)和應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)Y 迷宮反映小鼠自發(fā)的探索行為，是工作記憶的最佳和最便捷的檢測方法［46］；T 迷宮對學(xué)習(xí)記憶的檢測更為敏感和細(xì)致，能反映記憶的存儲和提取；新物體識別實(shí)驗(yàn)可能需要更好的摸索學(xué)習(xí)和測試階段的時(shí)間間隔，并且需要精確的跟蹤和識別系統(tǒng)；曠場實(shí)驗(yàn)可以作為學(xué)習(xí)記憶、運(yùn)動(dòng)能力、畏懼焦慮行為的綜合指標(biāo)，可以放在一系列行為學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最開始階段，便于觀察者對動(dòng)物行為有大致的了解；轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)更適合與運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?7］，如帕金森?。?8］、亨廷頓?。?9］等。 綜上，為有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的選擇提供了理論基礎(chǔ)、方法借鑒和參考標(biāo)準(zhǔn)。