鄧宇揚 汪 珩 詹育純 李 燁 謝詩勝 李 勝 王文策 朱勇文* 楊 琳*

(1.華南農業(yè)大學動物科學學院廣東省動物營養(yǎng)調控重點實驗室,廣州 510642;2.金錢飼料(東莞)有限公司,東莞 523147)

膽堿又名膽素,最早是Strecker在1849年從動物膽汁中分離得到,廣泛分布在植物和動物細胞中,以游離態(tài)或復合物的形式存在,如磷酸膽堿、甘油磷酸膽堿、鞘磷脂或者是卵磷脂[1]。由于膽堿在體內具有作為神經遞質乙酰膽堿的前體、細胞膜磷脂的結構成分以及提供甲基等多種功能,是畜禽以及水產動物生長發(fā)育必需的維生素[1]。膽堿缺乏時,家禽主要表現為生長速度和飼料轉化率下降、易患脂肪肝等[2-3]。飼糧添加膽堿可提高家禽生產性能和營養(yǎng)物質利用率,降低料重比(F/G)[4]。此外,膽堿在調節(jié)脂質代謝方面發(fā)揮著重要作用。研究表明,在29～48周齡肉種雞飼糧中添加760 mg/kg膽堿可顯著降低肝臟脂質含量和血清甘油三酯(TG)含量[5]。聞治國[6]通過肉鴨平均日增重(ADG)擬合膽堿需要量,推薦1～21日齡北京鴨的飼糧膽堿含量為1 300 mg/kg,而21～42日齡時則是1 150 mg/kg?，F今關于膽堿在家禽方面的研究主要集中在雞、鴨上,而對于肉鵝膽堿需要量的研究相對缺乏。張文旭等[7]綜合生長性能、屠宰性能和養(yǎng)分利用率,推薦1～4周齡青農灰鵝飼糧膽堿添加量為1 800 mg/kg。NRC(2004)推薦4～8周齡肉鵝的膽堿需要量為1 000 mg/kg。然而,該數據是借鑒肉雞的數據得出的,且年代較為久遠。因此。本試驗以馬岡鵝為研究對象,研究不同膽堿添加水平對28～70馬岡鵝生長性能、屠宰性能、血清生化與脂質代謝指標及肝臟脂質代謝的影響,以期確定馬岡鵝生長中后期飼糧中膽堿的適宜添加水平,為完善我國肉鵝營養(yǎng)需要標準及合理配制馬岡鵝飼糧提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼糧配制

選用432只同批出雛、體重相近且健康的28日齡馬岡鵝公鵝,采用單因素隨機分組試驗設計分為6組,以12只試驗鵝為1個重復,每組設有6個重復。對照組飼喂不添加膽堿的基礎飼糧(膽堿含量為385 mg/kg,離子色譜法測得),其余5個試驗組在基礎飼糧中分別添加300、600、900、1 200、1 500 mg/kg的膽堿,膽堿是通過等量取代預混料中的膨潤土載體加入到基礎飼糧中。試驗所用基礎飼糧以NRC(1994)[8]中的家禽營養(yǎng)需要推薦量為參考,并考慮現今我國馬岡鵝生產實際進行配制,為玉米-玉米淀粉-玉米蛋白粉型半純合飼糧,其組成及營養(yǎng)水平見表1。飼養(yǎng)試驗在揭陽市惠來縣華南農大·金錢飼料科研合作基地中開展。試驗鵝采用籠養(yǎng)方式,自由采食和飲水。試驗期為43 d(28～70日齡)。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.2 樣品采集與制備

70日齡試驗結束時,每個重復選取1只試驗鵝,頸靜脈采血10 mL,靜置30 min后,3 000 r/min離心10 min分離血清,-20 ℃保存,用于血清生化和脂質代謝指標的測定。將采血后的試驗鵝屠宰,分離出部分肝臟,放入凍存管并迅速置于液氮,樣品保存在-80 ℃冰箱,用于后續(xù)肝臟相關指標的測定。剪取 0.1 g肝臟組織,在4 ℃生理鹽水中漂洗后用濾紙吸干,稱重后加入9倍重量體積的冰生理鹽水,利用勻漿機研磨充分,3 000 r/min離心10 min,分離上清液并分裝,置于-80 ℃冰箱保存,用于部分肝臟脂質代謝指標的測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生長性能

在28日齡時正式開始試驗,試驗期間以重復為單位稱量、記錄各組鵝的耗料重,若有死鵝、病鵝,及時淘汰并記錄,在70日齡試驗結束時對每一欄舍試驗鵝稱重,之后計算ADG、平均日采食量(ADFI)和F/G。

1.3.2 屠宰性能

在70日齡試驗結束時,從每個重復選取1只試驗鵝,頸靜脈放血致死,濕法拔毛瀝水后稱重,測定其屠宰性能,包括屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率和腹脂率。試驗操作及指標的測定方法參照《家禽生產性能名詞術語和度量統(tǒng)計方法》(NY/T 823—2020)進行。

1.3.3 血清生化與脂質代謝指標以及肝臟脂質代謝指標

參考南京建成生物工程研究所試劑盒操作說明書檢測血清、肝臟的如下全部或部分指標:葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、游離脂肪酸(FFA)含量及谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)活性。

肝臟總脂質含量:肝臟總脂質含量的測定參照Folch等[9]的方法,并略有改動。稱取肝臟樣品1 g左右,加入體積比為2∶1的氯仿-甲醇溶液和50 μL抗氧化劑丁基羥基甲苯,在冰浴下勻漿,靜置過濾,濾紙用氯仿-甲醇溶液充分沖洗,然后在濾液中加入10 mL 1.6%的氯化鈣(CaCl2),搖勻靜置1 h;離心后吸走上清液,將下層液體轉入已經稱重的容器中,在液氮下干燥至恒重,稱重。

肝臟總磷脂含量:將上述脂質重新溶于10 mL氯仿-甲醇溶液中,取4 mL液體,參考Rizki等[10]的操作,采用抗壞血酸-鉬藍比色法測定肝臟總磷脂含量。

1.3.4 肝臟脂質代謝相關基因的表達

依據Trizol法,采用EZB試劑盒從肝臟樣品中提取總RNA,然后使用核酸濃度分析儀(ND-2000,Gene Company,美國)測定RNA的濃度,并檢測其在260和280 nm處的吸光度比值(OD260 nm/OD280 nm)。按照TaKaRa PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser Kit提供的方法進行逆轉錄,合成cDNA。

以β-肌動蛋白(β-actin)作為內參基因,引物由上海生工生物技術有限公司合成,引物序列見表2。使用Quantifast ST-BR Green PCR Kit,采用SYBR Green Ⅰ染料法,在Bio-Rad CFX-96型熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR。每個實時熒光定量PCR設2個重復。PCR反應體系為10 μL:SYBR Green Master Mix(2×)5 μL,上、下游引物各0.2 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 3.6 μL。PCR反應程序為:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性10 s,56 ℃退火延伸30 s,總計40個循環(huán)。反應結束后采用2-ΔΔCt法計算目的基因乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、過氧化物酶增殖物激活受體α(PPARα)和肉堿棕櫚酰轉移酶1-A(CPT1-A)mRNA相對表達量。

表2 引物序列

1.4 數據統(tǒng)計及分析

數據使用Excel 2013進行初步處理,后續(xù)使用SAS 9.2軟件對試驗數據進行單因素方差分析,差異顯著時采用Duncan氏法進行組間多重比較,基因表達所得數據使用Graph Prism 8.0進行柱形圖的繪制。試驗結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示,以P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 膽堿添加水平對28～70日齡馬岡鵝生長性能的影響

由表3可知,膽堿添加水平對28～70日齡馬岡鵝的平均末重、ADG和ADFI均沒有顯著影響(P>0.05);300 mg/kg添加組的F/G顯著低于1 200和1 500 mg/kg添加組(P<0.05)。

表3 膽堿添加水平對28～70日齡馬岡鵝生長性能的影響

2.2 膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝屠宰性能的影響

由表4可知,膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腿肌率、腹脂率均無顯著影響(P>0.05);300 mg/kg添加組的胸肌率顯著高于對照組和1 200 mg/kg添加組(P<0.05)。

表4 膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝屠宰性能的影響

2.3 膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝血清生化與脂質代謝指標的影響

由表5可知,膽堿添加水平對血清GLU含量、ALT活性無顯著影響(P>0.05);300、600、900和1 200 mg/kg添加組血清AST活性顯著低于對照組(P<0.05)。對于脂質代謝指標,膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝血清T-CHO含量無顯著影響(P>0.05);900 mg/kg添加組血清TG含量顯著低于對照組(P<0.05);600 mg/kg添加組血清HDL-C含量顯著高于其余各組(P<0.05);300 mg/kg添加組血清FFA含量顯著高于對照組(P<0.05)。

表5 膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝血清生化與脂質代謝指標的影響

2.4 膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝肝臟脂質代謝指標的影響

由表6可知,膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝肝臟總磷脂含量無顯著影響(P>0.05);1 500 mg/kg添加組肝臟總脂質含量顯著低于對照組和1 200 mg/kg添加組(P<0.05);900 mg/kg添加組肝臟TG含量顯著低于除1500mg/kg添加組外的其余各組(P<0.05);300、900 mg/kg添加組肝臟T-CHO含量顯著低于1 200 mg/kg添加組(P<0.05);600 mg/kg膽堿添加組肝臟HDL-C含量顯著低于對照組和300 mg/kg添加組(P<0.05),而LDL-C含量顯著高于對照組和300 mg/kg膽堿組(P<0.05)。

表6 膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝肝臟脂質代謝指標的影響

2.5 膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝肝臟脂質代謝相關基因表達的影響

由圖1可知,膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝肝臟中ACC、CPT1-A和PPARαmRNA相對表達量均有顯著影響(P<0.05),其中900 mg/kg添加組肝臟ACCmRNA相對表達量顯著低于對照組和1 200 mg/kg添加組(P<0.05),PPARαmRNA相對表達量顯著高于對照組和300、1 500 mg/kg添加組(P<0.05),而CPT1-AmRNA相對表達量則顯著高于其余各組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 飼糧膽堿添加水平對28～70日齡馬岡鵝生長性能和屠宰性能的影響

膽堿能夠促進機體生長發(fā)育,在豬、反芻動物和水產動物上均已得到了證實[11-13]。Workel等[14]的研究表明,飼糧中添加800 mg/kg膽堿顯著提高了肉雞的ADG,降低了F/G。Rahnama等[15]也得出了相似的結果。蔣雪櫻等[16]研究表明,在22～42日齡肉雞飼糧添加500 mg/kg甜菜堿顯著提高了愛拔益加(AA)肉雞的胸肌和腿肌的重量。本試驗結果顯示,飼糧添加300 mg/kg膽堿顯著降低了28～70日齡馬岡鵝的F/G,而膽堿添加水平對28～70日齡馬岡鵝的ADG、ADFI和平均末重均無顯著影響。在屠宰性能方面,本試驗發(fā)現膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝的屠宰率、半凈膛率和全凈膛率均無顯著影響。而張文旭等[7]的研究發(fā)現,在15周齡青農灰鵝飼糧中添加1 800 mg/kg膽堿能夠顯著提高肉鵝的屠宰率和全凈膛率,與本試驗結果不一致,這可能是鵝的品種與生長階段不同所導致。此外,添加300 mg/kg膽堿顯著提高了70日齡馬岡鵝的胸肌率,與蔣雪櫻等[16]的結果一致,這可能是由于膽堿在體內為蛋氨酸合成提供甲基,并提高了其有效利用率,使馬岡鵝生長速度加快,提高了蛋白質的周轉沉積[17]。

3.2 飼糧膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝血清生化與脂質代謝指標以及肝臟脂質代謝的影響

AST、ALT與動物肝臟功能密切相關,其活性可反映肝臟功能是否正常[18]。當肝臟功能衰退時,ALT和AST進入血液中增加,血液中這2種酶的活性也隨之升高。因此,肝臟功能正常與否與可以通過測定血液中AST和ALT的活性進行評估。而肝臟出現脂肪性病變時,脂質增加會導致血糖水平升高[19]。本試驗中,飼糧添加膽堿可降低血清AST活性,表明膽堿可能對肝臟功能有一定的改善作用。Yusuf等[20]在21～42日齡肉雞飼糧中添加3 g/kg甜菜堿也得出同樣的結果。在北京鴨的研究也表明,膽堿缺乏顯著提高了血清中AST和ALT的活性,而對GLU含量無顯著影響[6]。TG、T-CHO、LDL-C和HDL-C是體內脂質水平的重要標志,其含量反映了體內脂質的吸收和代謝。HDL-C能促進肝外膽固醇轉運到肝臟代謝,維持膽固醇穩(wěn)定,而LDL-C是TG的主要運輸者,禽類脂肪沉積主要取決于血清TG含量。聞治國[6]的研究表明,飼糧膽堿含量對21日齡北京鴨血清T-CHO和HDL-C含量無顯著影響,而飼糧膽堿含量為1 414 mg/kg時顯著提高了血清FFA和LDL-C含量。Song等[21]研究表明,飼糧添加2 955 mg/kg膽堿顯著升高了蛋鴨血清高密度脂蛋白(HDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)和TG含量。本試驗中,飼糧膽堿添加水平對70日齡馬岡鵝血清T-CHO含量無顯著影響,600 mg/kg膽堿添加水平顯著降低了血清TG含量,300 mg/kg膽堿添加水平顯著提高了血清HDL-C和FFA含量,這與前人研究結果大致相同。血清中TG和T-CHO含量下降說明機體脂肪分解代謝增強,這與本試驗前文關于腹脂率降低的研究結果一致。

肝臟是脂質代謝的主要場所,在調節(jié)脂質代謝和維持機體脂質穩(wěn)定方面有著重要作用[22]。肝臟總脂質和TG含量隨飼糧膽堿添加水平的升高呈現逐漸下降的趨勢,這在小鼠[10]和肉雞[23]的研究中己經證實。本試驗結果表明,添加900 mg/kg膽堿顯著降低了70日齡馬岡鵝肝臟中TG含量,而添加600 mg/kg膽堿顯著降低了肝臟HDL-C含量和升高了肝臟LDL-C含量。這可能是因為膽堿磷酸化促進了肝臟中VLDL和HDL的合成,VLDL從脂肪組織和脂蛋白中動員TG以降低血清TG含量。TG的降解增加了血清FFA的含量。此外,HDL與膽固醇結合形成HDL-C,降低T-CHO含量,從而減少或重新分配體內脂肪。

除FFA和TG攝取外,肝臟脂質代謝還涉及脂肪酸的從頭合成和氧化。ACC是催化脂肪酸合成反應的限速酶,調控脂肪合成[22],CPT1-A和PPARα在脂肪酸β氧化中起關鍵作用,前者是該過程的關鍵酶,后者則是促進脂肪酸β氧化的靶基因[23]。本試驗結果表明,對照組肝臟中ACCmRNA相對表達量顯著高于1 200 mg/kg添加組,與El Sayed等[24]和姚宏等[25]分別在肉鴨和肉雞上報道的甜菜堿能降低肝臟ACC基因表達的結果一致。由此可知,膽堿通過下調ACC的表達抑制機體脂肪合成。隨著飼糧中膽堿添加水平的增加,肝臟中PPARαmRNA相對表達量呈現先增加后下降的趨勢,且900 mg/kg添加組肝臟中PPARαmRNA相對表達量顯著高于對照組和300、1 500 mg/kg添加組。而900 mg/kg添加組肝臟中CPT1-AmRNA相對表達量顯著高于各組。張彩霞[26]報道,飼糧中添加0.06%膽堿顯著提高了獺兔肝臟中CPT1-AmRNA相對表達量。PPARα和CPT1-A的表達上調可促進脂肪酸氧化反應,降低肝臟TG和膽固醇含量,調節(jié)脂質代謝。研究表明,膽堿代謝產生甲基供體可通過降低PPARα啟動子甲基化上調PPARα及其靶基因CPT1-A表達,降低肝臟TG累積[27]。

4 結 論

本試驗條件下,在玉米-玉米淀粉-玉米蛋白粉型半純合飼糧(膽堿含量385 mg/kg)中添加300 mg/kg膽堿可降低28～70日齡的馬岡鵝F/G,提高70日齡馬岡鵝的胸肌率;添加900 mg/kg膽堿可降低70日齡馬岡鵝血清和肝臟中TG含量,提高肝臟中PPARα和CPT1-AmRNA相對表達量。若考慮生產性能,建議28～70日齡馬岡鵝飼糧中膽堿添加量為300 mg/kg(實際含量為685 mg/kg)。