董志穎,王 巖,郭志林,劉俊平*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.呼和浩特職業(yè)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051)

在獸醫(yī)臨床實(shí)踐中,超聲檢查具有準(zhǔn)確率高、損傷性小、可操作性強(qiáng)的特點(diǎn),因而得到廣泛應(yīng)用[1]。犬妊娠后孕囊是負(fù)責(zé)胚胎發(fā)育的成熟囊胚,B型超聲可以用于監(jiān)測(cè)孕囊的變化,妊娠初期孕囊非常小,直徑只有幾毫米,表現(xiàn)為無(wú)回聲結(jié)構(gòu)(絨毛膜液體),周圍有1層薄的高回聲壁(滋養(yǎng)層)[2]。子宮動(dòng)脈血流阻力指數(shù)(resistance index,RI)和搏動(dòng)指數(shù)(pulsatility index,PI)是監(jiān)測(cè)犬妊娠的有用變量,通過(guò)測(cè)量這些變量可以區(qū)別犬的正常妊娠和異常妊娠[3]。多普勒超聲可以用于檢測(cè)胎兒的血流供應(yīng)情況[4],其獨(dú)特的成像技術(shù)可以通過(guò)監(jiān)測(cè)子宮動(dòng)脈血流情況進(jìn)而來(lái)評(píng)估胎盤血液循環(huán)和預(yù)測(cè)胎兒存活率[5],目前在監(jiān)測(cè)血液流動(dòng)及妊娠胎動(dòng)方面得到廣泛應(yīng)用[6]。

在過(guò)去的10余年中獸醫(yī)工作者將彩色多普勒超聲用于馬[7]、牛[8]、羊[9]、犬[10]、家貓[11]的報(bào)道已有很多,但是多普勒用于犬的妊娠監(jiān)測(cè)和子宮動(dòng)脈血流特征的研究報(bào)道較少[12]。因此,本研究運(yùn)用B型超聲和多普勒超聲探查技術(shù)監(jiān)測(cè)比格犬的早期妊娠和子宮動(dòng)脈血液特征,為犬的早期妊娠診斷、子宮動(dòng)脈血流特征以及胎兒生長(zhǎng)發(fā)育研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)比格犬18只,雌性,2～4歲,體重12±2 kg,健康狀態(tài)良好,購(gòu)自福州振和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,許可證號(hào)SCXK(閩)2018-0001。

1.2 試驗(yàn)器材和試劑

犬孕酮ELISA試劑盒,新啟迪生物科技有限公司;MyLab60型彩色多普勒超聲診斷儀和LA523 4-13 MHz線性傳感器,百勝(深圳)醫(yī)療設(shè)備有限公司;寵物專用保定架;獸用耦合劑,天津市西苑寺制作所;顯微鏡CX21,日本Olympus公司;載玻片,江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司;Dif-Quik染液,北京普博斯生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物繁殖管理 比格犬單獨(dú)或成對(duì)飼養(yǎng)在室內(nèi),日照時(shí)間充足,每天喂2次寶路牌成犬犬糧,并自由飲水。每天對(duì)母犬進(jìn)行外陰部檢查,母犬出現(xiàn)外陰腫脹和陰道血樣分泌物被認(rèn)為是發(fā)情前期的標(biāo)志,一般持續(xù)7～12 d。每天對(duì)母犬進(jìn)行陰道上皮細(xì)胞收集檢查,并在Dif-Quik染液染色后進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查,以建立無(wú)核細(xì)胞指數(shù),發(fā)情前期的第5天開(kāi)始采集血樣,之后每周采集3次血樣,通過(guò)ELISA測(cè)量血漿孕酮濃度,當(dāng)血漿孕酮濃度首次達(dá)到5 μg/L(5 ng/mL)的那天被定義為排卵日,即黃體期的第1天[13]。所有比格母犬在排卵后1或2 d交配,間隔24 h交配第2次,以第2次配種為配種第1天(d1)。

1.3.2 B型超聲監(jiān)測(cè)孕囊的變化 配種后第20天進(jìn)行超聲檢查。超聲檢查前,對(duì)試驗(yàn)比格犬前界至劍狀軟骨部、右側(cè)至第11肋骨末端、左側(cè)至最后肋骨部、后界為恥骨聯(lián)合部進(jìn)行備皮處理。使用MyLab60 VET機(jī)器和LA523 4-13 MHz線性傳感器進(jìn)行B型超聲和多普勒超聲檢查。按照各器官的解剖位置及相互之間位置關(guān)系,在相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行掃查,可以定位于膀胱或者腎臟,子宮位于膀胱的背側(cè)、直腸的腹側(cè),卵巢位于腎臟后方1～2 cm,以此作為定位點(diǎn)來(lái)掃查子宮[14]。將試驗(yàn)犬置于仰臥位,根據(jù)超聲掃描的需要,將其改為右側(cè)或左側(cè)臥位。利用B型超聲檢查確定是否存在孕囊,如圖1,測(cè)量孕囊的頭臀側(cè)外徑(OLL)、頭臀側(cè)內(nèi)徑(ILL)、背腹側(cè)外徑(ODV)和背腹側(cè)內(nèi)徑(IDV)[15]。每只犬進(jìn)行3次測(cè)量,并確定每個(gè)指標(biāo)的平均值。將聲像圖進(jìn)行保存分析,總結(jié)不同階段聲像圖的規(guī)律。

圖1 比格犬孕囊早期的超聲成像及其直徑的測(cè)量

1.3.3 多普勒超聲監(jiān)測(cè)子宮動(dòng)脈血流的變化 于妊娠第22、25及28天依據(jù)1.3.2的試驗(yàn)方法找到子宮,在子宮旁側(cè)找到與子宮并行的子宮動(dòng)脈,如圖2,用脈沖多普勒測(cè)定子宮動(dòng)脈收縮期峰值流速(PSV)、舒張末期流速(EDV)、搏動(dòng)指數(shù)(PI=[PSV-EDV]/平均流速)和阻力指數(shù)(RI=[PSV-EDV]/PSV)[15]。每只犬進(jìn)行3次測(cè)量,并確定每個(gè)指標(biāo)的平均值。將血流圖進(jìn)行保存分析,總結(jié)不同階段血流圖的規(guī)律。

圖2 多普勒模式下子宮動(dòng)脈血流的測(cè)量

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果

細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。由圖3可知,比格犬發(fā)情初期陰道細(xì)胞多為紅細(xì)胞和脫落的有核上皮細(xì)胞,發(fā)情末期陰道細(xì)胞多為角質(zhì)化上皮細(xì)胞;由圖4可知,角質(zhì)化上皮細(xì)胞在發(fā)情第6～8天迅速增加,在第11天左右達(dá)到峰值,紅細(xì)胞由發(fā)情初期開(kāi)始逐漸減少。

圖3 比格犬發(fā)情期陰道涂片鏡檢

圖4 發(fā)情期陰道細(xì)胞占比

2.2 血漿孕酮含量

比格犬發(fā)情期血漿孕酮含量見(jiàn)表1,孕酮在犬發(fā)情第9天左右達(dá)5 ng/mL。

表1 發(fā)情期血漿孕酮檢測(cè)結(jié)果

2.3 孕囊變化情況

比格犬孕囊變化情況見(jiàn)表2和圖5。由表2可知,OLL在妊娠第20～23天無(wú)顯著差異(P>0.05),第24～25天顯著高于第23天(P<0.05),第26～27天顯著高于第24～25天,顯著低于第28天(P<0.05);ILL在妊娠第23天顯著高于第20、21天(P<0.05),第26～28天顯著高于第23～24天(P<0.05);ODV在妊娠第23天顯著高于第20天(P<0.05),第25天顯著高于第23天,顯著低于第28天(P<0.05);IDV在妊娠第22天顯著高于第20天(P<0.05),第25天顯著高于第22天(P<0.05),第27天顯著高于第25天,顯著低于第28天(P<0.05)。由圖5可知,妊娠時(shí)間對(duì)孕囊各直徑有正向影響。

表2 不同妊娠時(shí)間孕囊直徑

圖5 孕囊直徑與妊娠時(shí)間關(guān)系

2.4 子宮動(dòng)脈血流變化情況

子宮動(dòng)脈血流測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,各診斷日期之間子宮動(dòng)脈血流均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 不同妊娠天數(shù)子宮動(dòng)脈血流

3 討 論

盡早確定犬是否妊娠便于獸醫(yī)盡早干預(yù)計(jì)劃外的妊娠,減小對(duì)母犬的傷害。妊娠檢查也可發(fā)現(xiàn)子宮的生理性或病理性變化,以免造成更大的損害。因此,早期妊娠診斷是犬繁殖中必不可少的一部分。

在人早期妊娠的研究中顯示,孕囊的平均直徑每周可以增加約5 mm,可以根據(jù)孕囊的平均直徑來(lái)推測(cè)孕齡及胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育情況[16]。本研究中絕大多數(shù)比格犬孕囊出現(xiàn)的時(shí)間是配種后第20天,其中1只比格犬在配種后的第18天檢測(cè)到孕囊的存在,早期孕囊很小,直徑只有幾毫米,受腸內(nèi)氣體的影響易被忽略,檢查時(shí)需要細(xì)心觀察,且檢查過(guò)程中易受到腸管及血管的干擾,檢查時(shí)可以90°轉(zhuǎn)動(dòng)探頭、調(diào)換到多普勒模式下并根據(jù)分層情況進(jìn)行區(qū)分。隨著胚胎的發(fā)育,卵圓形的孕囊逐漸變大,OLL、ODV、IDV均在第23天開(kāi)始迅速增長(zhǎng),ILL在第22天迅速增長(zhǎng),且在結(jié)果中可以看出孕囊頭臀側(cè)徑和背腹側(cè)徑增長(zhǎng)速度不一,原因可能與孕囊的生長(zhǎng)方向有關(guān),檢查結(jié)果總體顯示孕囊在妊娠早期生長(zhǎng)迅速。

子宮動(dòng)脈作為母胎循環(huán)的主要供應(yīng)源與運(yùn)輸通道,直接關(guān)系到早期妊娠的成敗。通過(guò)多普勒模式測(cè)量子宮動(dòng)脈血流情況對(duì)于早期妊娠診斷和監(jiān)測(cè)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義[17]。本研究中,妊娠母犬子宮收縮期峰值速度均值為23.26±1.89 cm/s、舒張末期速度均值為5.78±1.05 cm/s,因其受到母犬產(chǎn)仔數(shù)的影響,產(chǎn)仔數(shù)越大其數(shù)值越高[18],所以沒(méi)有具體范圍,且在正常妊娠過(guò)程中,隨著胎齡的增加,數(shù)值也逐漸升高;搏動(dòng)指數(shù)均值為1.73±0.23;血管阻力指數(shù)均值為0.75±0.05,符合Batista等[18]研究結(jié)果中所給出的參考范圍(0.64～0.79),且在測(cè)定期內(nèi)所監(jiān)測(cè)的子宮動(dòng)脈血流搏動(dòng)指數(shù)和血管阻力指數(shù)變化不明顯,同Miranda等[15]研究的結(jié)果相符。在正常妊娠中后期,子宮動(dòng)脈RI和PI隨胎齡的增加逐漸降低,反映子宮動(dòng)脈灌注量增加,與胎兒的不斷增長(zhǎng)有關(guān),不受產(chǎn)仔數(shù)的影響,所有多普勒參數(shù)均不受年齡、體重或胎次的影響[19]。在人和犬的妊娠過(guò)程中,子宮動(dòng)脈RI無(wú)下降趨勢(shì)則提示與產(chǎn)科疾病相關(guān),且這種異常的血流模式先于其他超聲改變出現(xiàn)[19]。

超聲能夠?qū)θ焉镌缙谠心疫M(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè),從而直觀地反應(yīng)胚胎的發(fā)育情況,也有助于對(duì)胚胎血液供應(yīng)情況及阻力指數(shù)等變化進(jìn)行分析[20]。妊娠早期胚胎的發(fā)育對(duì)子宮血流的灌注具有較強(qiáng)的依賴,若有子宮血流灌注不足的情況會(huì)對(duì)胚胎的發(fā)育及繼續(xù)妊娠產(chǎn)生不利的影響[21],因?yàn)樽訉m動(dòng)脈血流限制了胎盤的氧氣和營(yíng)養(yǎng),會(huì)直接影響胎盤功能和胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育[22]。

4 結(jié) 論

利用超聲探查技術(shù)成功地監(jiān)測(cè)到比格犬妊娠早期孕囊OLL、ILL、ODV、IDV隨著妊娠時(shí)間增加而快速增長(zhǎng),且妊娠時(shí)間對(duì)其有正向影響;子宮動(dòng)脈血流在測(cè)定期內(nèi)變化不明顯;檢測(cè)結(jié)果顯示妊娠情況良好、胎兒發(fā)育正常。