李東光,于 波,李笑瑩,曹 靜,王 禹

(佳木斯市中醫(yī)醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154002)

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤,多發(fā)于青少年,發(fā)病率高峰對應(yīng)于骨骼快速生長期[1]。隨著外科手術(shù)和各種化療方案的發(fā)展和進(jìn)步,骨肉瘤的五年總生存率有了顯著提高,但依然存在預(yù)后較差的問題[2],因此迫切需要探究骨肉瘤發(fā)展的潛在機(jī)制,以開發(fā)更有效的骨肉瘤治療方法。從病理學(xué)角度分析,大多數(shù)腫瘤患者的免疫系統(tǒng)低下,免疫細(xì)胞活性被抑制,促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞生長,因此研究改善其免疫系統(tǒng)的藥物有利于抑制腫瘤生長[3]。骨肉瘤在中醫(yī)學(xué)中可歸屬“癌病”范疇,現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為其病因病機(jī)多與“虛、寒、痰、瘀、毒”有關(guān),此外,邪毒與骨肉瘤的發(fā)病也密切相關(guān),中醫(yī)藥治療骨肉瘤能夠起到增效減毒,培補(bǔ)正氣之功效。中藥以其獨(dú)特的治療優(yōu)勢,通過多種生物活性成分、多通路、多靶點(diǎn)的途徑,可提高腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性[4-5]。中藥有效成分通過相關(guān)信號通路干預(yù)骨肉瘤轉(zhuǎn)移已成為研究熱點(diǎn),通過抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的STAT3、PI3K/Akt、NF-κB、MAPKs、Wnt/β-Catenin多種信號通路活性,在抑制骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。刺五加是一種應(yīng)用廣泛的中藥材,明代李時(shí)珍《本草綱目》記載其辛、微苦,溫,歸脾、腎、心經(jīng);《中國藥典》記載其具有健脾益氣、補(bǔ)腎安神的功效。近年來的研究證明,刺五加的活性成分對多種癌細(xì)胞類型表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用。刺五加多糖(Acanthopanax senticosus polysaccharide,ASPS)主要由水溶性多糖與堿溶性多糖組成,對機(jī)體的免疫功能具有重要調(diào)節(jié)作用。研究指出,ASPS能夠調(diào)節(jié)小鼠耳、足趾腫脹等模型小鼠血清中IL-6和TNF-α水平,參與免疫功能調(diào)節(jié)[6]。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)ASPS可明顯抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H520的增殖和轉(zhuǎn)移能力[7],但ASPS對骨肉瘤的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在探討ASPS對骨肉瘤小鼠的抑瘤作用及免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5周大的清潔級BALB/c小鼠(18～22 g),購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司,許可證號:SCXK(豫)2020-0005,動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,期間隨意提供標(biāo)準(zhǔn)的食物和水,飼養(yǎng)環(huán)境為溫度23～25 ℃,濕度為50%～60%,12 h明/暗交替,該研究已獲得動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 美國ATCC公司提供人成骨肉瘤MG63細(xì)胞株,將細(xì)胞與含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5%二氧化碳恒溫箱中孵育,2 d更換1次培養(yǎng)基,待細(xì)胞融合至90%后,經(jīng)消化、離心后用于構(gòu)建骨肉瘤小鼠模型。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 西安小草植物科技有限公司提供ASPS;江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司提供順鉑;美國R&D公司提供白細(xì)胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒;上海碧云天公司提供RIPA裂解緩沖液;北京博奧森生物工程有限公司提供HE試劑盒;Milipore公司提供化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒;Abcam公司提供CD4+、CD8+、程序性死亡因子1(PD-1)及配體(PD-L1)單克隆抗體。賽默飛世爾科技公司提供Attune NxT流式細(xì)胞儀;北京普天新橋技術(shù)有限公司提供PTW-1000多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠骨肉瘤模型的構(gòu)建及干預(yù):將適應(yīng)1周的小鼠,通過前肢后內(nèi)側(cè)注射100 μl腫瘤細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/ml)制備骨肉瘤小鼠模型,當(dāng)小鼠長出皮下腫瘤直徑約1 cm,標(biāo)記為成功造模[8],共50只小鼠建模成功,隨機(jī)分為模型組、刺五加多糖低、中、高劑量組、順鉑組,并以正常小鼠為對照組,每組10只;刺五加多糖低劑量組、刺五加多糖中劑量組、刺五加多糖高劑量組分別給予36.25、72.5、145 mg/kg ASPS灌胃干預(yù),并給予腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉溶液[9];順鉑組給予腹腔注射25 mg/kg順鉑,并給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃[10];模型組和對照組灌胃并腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液,每日1次,連續(xù)2周。

1.4.2 ELISA檢測血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平:末次給藥結(jié)束后,麻醉并處死小鼠,經(jīng)眼球取血,離心后收集血清,按照試劑盒要求檢測血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+細(xì)胞比例:經(jīng)腹部主動(dòng)脈取血,在37 ℃下在消化緩沖液(2.5 mg/ml膠原酶Ⅱ、2.5 mg/ml膠原酶Ⅳ和0.5 mg/ml脫氧核糖核酸酶Ⅰ)中孵育13～15 min,按照密度梯度離心法提取淋巴細(xì)胞分離液,以氬離子為光源,488 nm為激光波長,采用流式細(xì)胞儀分析CD4+、CD8+細(xì)胞比例。

1.4.4 瘤體重量及抑瘤率計(jì)算:分離各組腫瘤組織,利用電子天平稱取瘤體重量并計(jì)算抑瘤率。

1.4.5 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù):摘取小鼠脾臟和胸腺,稱重后計(jì)算脾臟及胸腺指數(shù),脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)重量(mg)/體重(g)×10。

1.4.6 HE檢測腫瘤組織病理學(xué)變化:將部分腫瘤組織經(jīng)固定、石蠟包埋后制備石蠟切片,行蘇木精、伊紅染色,顯微鏡下觀察病理變化。

1.4.7 Western blot檢測腫瘤組織PD-1、PD-L1蛋白表達(dá):RIPA裂解液提取腫瘤組織總蛋白,SDS-PAGE分離等量蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜,將膜封閉后,與PD-1、PD-L1一抗體在4 ℃下免疫印跡過夜,在通過使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒可視化之前,將膜在室溫下與二抗孵育1 h,采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平比較 見表1。與對照組相比,模型組IL-2、IFN-γ、TNF-α水平均顯著增加(P<0.05);與模型組相比,刺五加多糖低、中、高劑量組IL-2、IFN-γ、TNF-α水平均顯著降低,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但順鉑組與刺五加多糖高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平比較

2.2 各組小鼠外周血中CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比較 見表2。與對照組相比,模型組小鼠外周血中CD8+顯著增加,CD4+及CD4+/CD8+顯著降低(P<0.05);與模型組相比,刺五加多糖低、中、高劑量組小鼠外周血中CD8+顯著降低,CD4+及CD4+/CD8+顯著增加,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但順鉑組與刺五加多糖高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組小鼠外周血中CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比較

2.3 各組小鼠瘤重及抑瘤率比較 見表3。與對照組相比,模型組瘤體重量顯著增加(P<0.05);與模型組相比,刺五加多糖低、中、高劑量組瘤體重量顯著降低,抑瘤率顯著增加,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但順鉑組與刺五加多糖高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠瘤重及抑瘤率比較

2.4 各組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)比較 見表4。與對照組相比,模型組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.05);與模型組相比,刺五加多糖低、中、高劑量組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著增加,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但順鉑組與刺五加多糖高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 各組小鼠腫瘤組織病理學(xué)變化 模型組腫瘤細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞核較大,核膜完整;刺五加多糖低、中、高劑量組、順鉑組干預(yù)后,細(xì)胞染色逐漸變淺,部分細(xì)胞核分裂,腫瘤細(xì)胞減少,其中以刺五加多糖高劑量組、順鉑組變化較為明顯(圖1)。

2.6 各組小鼠腫瘤組織PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)比較 見表5(圖2)。與對照組相比,模型組PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05);與模型組相比,刺五加多糖低、中、高劑量組PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)顯著降低,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但順鉑組與刺五加多糖高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

··A:對照組;B:模型組;C:刺五加多糖低劑量組;D:刺五加多糖中劑量組;E:刺五加多糖高劑量組;F:順鉑組

表5 各組小鼠腫瘤組織PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)比較

3 討 論

骨肉瘤是一種罕見的惡性腫瘤,主要影響兒童和青少年,化療是目前治療骨肉瘤患者的主要方式,但該疾病的惡性程度及病死率依然較高,嚴(yán)重影響患者生存期[11-12]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)化療可加重中晚期骨肉瘤患者免疫功能紊亂,不利于改善疾病癥狀,因此需要研究新的方案治療骨肉瘤[13]。中醫(yī)藥治療骨肉瘤已成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn),可提高骨肉瘤患者生存期,降低骨肉瘤病死率,減少化療藥物的不良反應(yīng),增效減毒,在骨肉瘤的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

骨肉瘤在中醫(yī)歸為“癭瘤、骨瘤、脂瘤、石瘤”等,《備急千金要方》中首次提到“骨瘤”“肉瘤”的病名,《普濟(jì)方》中提到:“氣血流行,不失其常……瘤所以生”。骨肉瘤發(fā)生的重要病因病機(jī)與氣血不和密切相關(guān)。刺五加具有補(bǔ)氣血、健脾養(yǎng)胃、活血化瘀等作用?，F(xiàn)代藥理研究顯示,刺五加及其活性成分不僅具有免疫刺激作用,還具有抗腫瘤作用。刺五加多糖是五加科植物中的有效成分,主要由水溶性多糖和堿溶性多糖組成,具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降低血糖以及抗氧化等多種生物學(xué)活性,其作用機(jī)制可能與免疫功能有關(guān),如腫瘤生長過程中,ASPS通過提高淋巴細(xì)胞增殖以及T細(xì)胞殺傷活性等抑制腫瘤生長[14]。如ASPS可以通過影響PD-L1及凋亡因子的表達(dá)抑制喉癌干細(xì)胞的增殖[15]。在腫瘤免疫反應(yīng)的過程中,脾臟是免疫反應(yīng)的啟動(dòng)部位,而胸腺是T淋巴細(xì)胞分化的重要組織器官,兩者均在其中發(fā)揮重要作用[16]。此外,細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等以及CD4+分子和CD8+分子可通過調(diào)節(jié)免疫功能在免疫應(yīng)答中起著非常關(guān)鍵的作用,CD4+/CD8+比值變化可反映機(jī)體免疫狀態(tài)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤小鼠中腫瘤細(xì)胞排列緊密,小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平、外周血中CD8+顯著增加,脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、CD4+及CD4+/CD8+顯著降低,表明骨肉瘤小鼠免疫功能降低,促進(jìn)了腫瘤生長。當(dāng)ASPS干預(yù)后,降低了小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平、外周血中CD8+比例以及瘤體重量,提高了脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、CD4+及CD4+/CD8+細(xì)胞比例,表明ASPS可抑制腫瘤生長,改善腫瘤微環(huán)境,提高小鼠免疫功能。

腫瘤免疫治療中,對腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞或其受體的靶向治療逐漸被研究者們所重視,并已在不同腫瘤治療中,取得了較為理想的療效[18-19]。PD-1/PD-L1是腫瘤免疫抑制的重要組成部分,被認(rèn)為是免疫治療研究中的關(guān)鍵[20]。既往研究顯示,PD-1/PD-L1過表達(dá)與患者腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤病死率成正相關(guān)[21],此外,PD-1、PD-L1可介導(dǎo)免疫逃逸[22]。當(dāng)ASPS干預(yù)后,腫瘤組織中PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)顯著降低,提示ASPS可能抑制PD-1/PD-L1實(shí)現(xiàn)腫瘤生長抑制以及免疫功能的改善[23-25]。

綜上所述,ASPS可抑制骨肉瘤小鼠腫瘤生長,改善小鼠免疫功能,可能與PD-1/PD-L1信號通路改變有關(guān),為臨床骨肉瘤藥物治療提供理論支持,但其作用機(jī)制還有待完善。