薛玉環(huán),崔恩慧,董志堅,柴學(xué)軍,孫朋浩,朱曉巖,蘇印泉,張智涵,趙善廷*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.西安市高新區(qū)醫(yī)院影像科,陜西 西安 710000;3.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,陜西 西安 720021;4.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

杜仲是中國臨床用中藥,其葉含有豐富的生物活性成分,如綠原酸、杜仲苷、熊果酸、黃酮類物質(zhì)等,除此之外杜仲富含氨基酸、維生素、礦物元素等多種營養(yǎng)成分[1],如礦物元素鎂、鈣、鉀、鐵、磷等,具有增強(qiáng)免疫功能、降血脂、鎮(zhèn)靜抗應(yīng)激、抗菌消炎、強(qiáng)身健骨等多方面作用[2]。中國飼料工業(yè)于20世紀(jì)80年代初就對中草藥進(jìn)行了大量的研發(fā)和應(yīng)用,近幾年有關(guān)中草藥飼料添加劑的產(chǎn)品層出不窮,其中杜仲的各種飼料添加劑以其獨(dú)特的藥理功能和良好的飼養(yǎng)效果受到養(yǎng)殖戶的青睞,尤其是在雞的養(yǎng)殖中較為熱門。研究發(fā)現(xiàn),在日糧中添加杜仲提取物或杜仲粉可以提高肉雞的生長性能、平均日增重、飼料轉(zhuǎn)化率等指標(biāo)[3-5]。也可以提高如海蘭蛋雞等蛋雞的產(chǎn)蛋率[5-8],并且通過改變蛋清蛋白質(zhì)含量、蛋重、蛋黃比例等指標(biāo)改善雞蛋品質(zhì)[6,8-10]?；\養(yǎng)蛋雞在全球范圍內(nèi)都是主流的飼養(yǎng)方式,由于蛋雞在性成熟后結(jié)構(gòu)骨會受到抑制,又因?yàn)榈皻ば纬?0%～40%的鈣需要由髓質(zhì)骨提供,所以蛋雞更容易患骨質(zhì)疏松[11-13]。蛋雞的產(chǎn)蛋量、雞蛋質(zhì)量和蛋殼厚度等產(chǎn)蛋指標(biāo)與本身的骨骼質(zhì)量密切相關(guān)[11,14],因此需要維持蛋雞的骨骼質(zhì)量來保證產(chǎn)蛋性能。另外,中醫(yī)臨床常將杜仲用于治療骨折、骨質(zhì)疏松、骨性關(guān)節(jié)炎等疾病[15-16]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)杜仲的有效化學(xué)成分具有調(diào)節(jié)骨代謝、加速成骨、促進(jìn)骨形成等作用[17-18]?；诙胖僦委煿菗p傷性疾病的功效事實(shí),本試驗(yàn)利用組織學(xué)、形態(tài)計量學(xué)、影像學(xué)、質(zhì)譜等技術(shù)研究了在雞日糧中添加杜仲葉提取物和杜仲葉發(fā)酵物對雞骨骨質(zhì)量及骨內(nèi)微量元素的影響,以初步探討其對骨骼發(fā)育的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

2日齡健康海蘭蛋雞由河南省靈寶市帥華牧業(yè)有限公司提供,所有雞健康狀況良好,體重約40 g。

1.2 儀器及試劑

杜仲葉由河南省靈寶市帥華牧業(yè)有限公司提供,杜仲葉提取物為杜仲葉水提物,杜仲葉發(fā)酵添加物為杜仲葉水提物經(jīng)乳酸桿菌發(fā)酵,制成粉劑。主要試劑有磷酸鹽緩沖液(PB)、酸性脫鈣液、15%EDTA溶液、HE染色液、用磷酸鹽緩沖液配成的4%多聚甲醛、硝酸等。主要儀器有萊卡冰凍切片機(jī)、瓊脂凝膠封片劑、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、水浴鍋、階梯式蛋雞飼養(yǎng)籠、日光燈等。

1.3 飼養(yǎng)管理及試驗(yàn)設(shè)計

1.3.1 試驗(yàn)雞分組及飼養(yǎng)管理 2日齡的健康海蘭蛋雞30只,飼養(yǎng)于四川廣安某養(yǎng)雞場,試驗(yàn)時間為2019年9月1日-2019年11月6日,相同條件下飼喂1周后,隨機(jī)分為3組:對照組(飼喂基礎(chǔ)日糧)、杜仲葉提取物組(每千克基礎(chǔ)飼糧添加6 g杜仲葉提取物)、杜仲葉發(fā)酵組(每千克基礎(chǔ)糧添加10 g杜仲葉提取發(fā)酵物)。每組10只,所有試驗(yàn)雞均飼喂在階梯式產(chǎn)蛋籠內(nèi),每籠1只,每只每天飼喂2次總質(zhì)量為0.110 kg,分別在9:00(飼喂量的65%)和18:00(飼喂量的35%)進(jìn)行投食,提供自由飲水,每天平均光照16 h,所有組相同條件下飼喂60 d。

1.3.2 杜仲葉提取方法 干燥杜仲葉揉碎浸潤30 min后,用80 ℃的水加熱浸泡1 h,倒出液體;再將杜仲葉加入80 ℃的水加熱浸泡30 min后倒出液體,2次液體合并后過濾,烘干后即得到杜仲葉提取物。

1.3.3 杜仲葉發(fā)酵方法

1.3.3.1 制菌 用杜仲基液按照營養(yǎng)培養(yǎng)基比例配方做出營養(yǎng)基平板,接種復(fù)合益生菌液,38 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,選出形態(tài)好活力佳的益生菌群,即得到杜仲益生菌種。

1.3.3.2 發(fā)酵 1級發(fā)酵:從營養(yǎng)培養(yǎng)基平板中取2個杜仲益生菌群接種于10 mL杜仲基液中,38 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,即得到1級菌液;2級發(fā)酵:將1級菌液接種于250 mL的杜仲基液中,38 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,即得到2級發(fā)酵液;3級發(fā)酵:將2級發(fā)酵液接種于1 500 mL杜仲基液中,38 ℃恒溫培養(yǎng)18 h,即得到3級發(fā)酵液;4級發(fā)酵:將3級發(fā)酵液1 500 mL接種于30 L杜仲基液中,38 ℃恒溫培養(yǎng)18 h,即得到4級發(fā)酵液;5級發(fā)酵:將4級發(fā)酵液接種于150 kg干燥杜仲葉粉中,攪拌均勻,于38 ℃恒溫培養(yǎng)罐中恒溫發(fā)酵48 h,即得到杜仲益生發(fā)酵濕粉。干燥:將杜仲益生發(fā)酵濕粉置于鼓風(fēng)干燥倉中,以35～38 ℃鼓風(fēng)干燥6 h,即得到干燥的杜仲葉發(fā)酵物,便于長期儲存。

1.4 雞骨的CT檢測

CT可以分辨組織密度的輕微差別,所采用的標(biāo)準(zhǔn)就是各種組織對X線的線性吸收系數(shù),稱之為CT值,而HU(hounsfiled unit)值就是CT測定組織或器官密度大小的一種計量單位。隨機(jī)挑選6只雞的左腿脛骨使用飛利浦16排螺旋CT(型號MX16)進(jìn)行CT掃描,掃描范圍是左腿脛骨全長橫斷面,每只重復(fù)掃描3次。掃描工作由陜西省咸陽市楊凌示范區(qū)醫(yī)院完成,記錄保存相關(guān)數(shù)據(jù)。

掃描參數(shù):電壓120 kV,每層260 mAs,圖像層厚0.75 mm,重建間隔0.75 mm,視野200 mm,窗寬4000,窗中心600,使用原機(jī)工作站處理圖像,并測量骨皮質(zhì)、髓腔平均HU值(即CT值)。

1.5 雞骨形態(tài)學(xué)的測定及顯微結(jié)構(gòu)的觀察

每組隨機(jī)抽取3只雞,剔除左腿脛骨的肉,取脛骨0.5 cm,做好標(biāo)記,將清洗好的雞骨放入用PB溶液配成的4%多聚甲醛中常溫固定24 h,PB溶液浸洗10 min,清洗3次,酸性脫鈣液脫鈣2 h,15%EDTA液脫鈣24 h,自來水沖洗24 h,20%蔗糖溶液8 h,30%蔗糖溶液24 h,OCT包埋,進(jìn)行冰凍切片,切片厚度為10 μm,每只雞隨機(jī)挑選3張切片,PB溶液浸洗切片10 min,清洗3次,用勾線筆將切片裱至載玻片上,烘箱50 ℃ 約30 min,HE染色,流水沖洗1 min,瓊脂凝膠封片,顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化,拍照記錄。

用Image-J圖像分析軟件對骨組織相關(guān)參數(shù)進(jìn)行測定和統(tǒng)計。主要參數(shù)包括:骨小梁面積占比(trabecular bone area,%Tb.Ar)即測量區(qū)域內(nèi)所有骨小梁的面積占測量區(qū)域的百分比;骨小梁間距(trabecular separation,Tb.Sp)指骨小梁之間的平均距離,用來描述骨小梁結(jié)構(gòu)形態(tài),分離度越大,骨小梁之間的距離越大,骨的結(jié)構(gòu)越不好。

1.6 雞骨微量元素的檢測

每組隨機(jī)抽取3只雞,剔除左腿脛骨的肌肉,取0.1 g骨組織加入1 mL優(yōu)級純濃HNO3、1滴H2O2,60 ℃進(jìn)行消解,待消解完全后定容至50 mL、過濾,采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS,ICAP Qc)測定溶液中的Mg、Ca、Fe、Cu、Zn等元素。

工作參數(shù):功率1 548 W,冷卻氣流量14 dm3/min,輔助氣流量0.8 dm3/min,霧化氣流量1.08 dm3/min,霧化室溫度2.7 ℃,計數(shù)檢測器電壓1 212 V,模擬檢測器電壓1 869 V。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,各組參數(shù)差異性采用One-way ANOVA分析,組間兩兩比較選用Duncan's檢驗(yàn),P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長期雞骨CT值

如圖1所示,將掃描CT的記錄數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物添加組的骨CT值與對照組相比極顯著升高(P<0.05);杜仲葉發(fā)酵物添加組與對照組相比顯著升高(P<0.05)。說明日糧中添加杜仲葉提取物和杜仲葉提取發(fā)酵物均可以顯著提高骨密度,且杜仲葉提取物比杜仲葉提取發(fā)酵物在骨密度提升方面的效果更為顯著。

圖1 生長期雞骨CT檢查結(jié)果

2.2 雞骨組織顯微結(jié)構(gòu)

雞骨組織顯微結(jié)構(gòu)見圖2。對照組雞脛骨的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性較差,疏松多孔,骨小梁稀疏,間隙增寬,髓腔相對擴(kuò)大,脂肪空泡增多,部分出現(xiàn)斷裂的現(xiàn)象,游離端較多,有較多大小不等的吸收腔。與對照組相比,杜仲葉提取物添加組和杜仲葉發(fā)酵物添加組的骨結(jié)構(gòu)致密,吸收腔較小;骨髓腔內(nèi)的骨小梁間距變小,且大都相互連接,脂肪空泡大量減少。添加杜仲葉發(fā)酵物添加組脛骨的結(jié)構(gòu)更加良好,骨小梁間隙小,骨髓腔小,排列緊密,連接成網(wǎng)。

圖2 雞骨組織顯微結(jié)構(gòu)(400×)

2.3 雞骨組織形態(tài)

對3組雞骨組織進(jìn)行切片染色,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,杜仲葉提取物添加組、杜仲葉發(fā)酵物添加組的骨小梁面積占比均顯著升高(P<0.001),杜仲葉發(fā)酵物添加組的骨小梁面積占比與杜仲葉提取物組相比顯著升高(P<0.05);杜仲葉提取物添加組、杜仲葉發(fā)酵物添加組的骨小梁分間距與對照組相比顯著降低(P<0.001)(圖3)。說明杜仲葉提取物添加、杜仲葉發(fā)酵物添加對雛雞雞骨的顯微結(jié)構(gòu)有很好的改善作用。

圖3 雞骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.4 雞骨微量元素含量

雞骨微量元素含量測定結(jié)果見表1。與對照組相比2個試驗(yàn)組脛骨中的Mg、Ca、Zn水平顯著增高(P<0.05);杜仲葉發(fā)酵物添加組脛骨中的Cu與對照組相比顯著升高(P<0.05);2個試驗(yàn)組Fe的含量與對照組相比有下降趨勢(P>0.05)。表明添加杜仲葉提取物和杜仲葉發(fā)酵物對雛雞雞骨微量元素的含量有很好的改善作用。

表1 雞骨微量元素含量

3 討 論

杜仲是中國特有樹種,其藥用歷史悠久,在古醫(yī)書中便有記載:“足脛之酸非杜仲不能去,腰膝之(疼)非杜仲不能(除)”[19-20],其減少骨吸收的作用較為明顯[21],采用含有杜仲的中藥合劑治療骨質(zhì)疏松療效顯著[22],具有很高的藥用和經(jīng)濟(jì)價值。而且杜仲是杜仲科杜仲屬僅存的孑遺植物,對于研究被子植物系統(tǒng)演化以及中國植物區(qū)系的起源等諸多方面都具有極為重要的科學(xué)價值。近年來,一些學(xué)者從分子水平來解釋杜仲對脂肪干細(xì)胞的作用、促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成和對破骨細(xì)胞分化的影響[18,23-24]。

目前,由于大規(guī)模集約化養(yǎng)殖,動物活動空間非常狹小,嚴(yán)重影響了飼養(yǎng)動物骨骼的發(fā)育。關(guān)于飼料添加杜仲葉提取物和杜仲葉發(fā)酵物提高家禽骨質(zhì)的研究鮮有報道,因此,此研究為預(yù)防禽類骨質(zhì)疾病提供了可靠依據(jù)。

本試驗(yàn)采用2日齡的雛雞,這一時期的雞生長發(fā)育比較迅速,是骨骼生長發(fā)育的主要階段。骨密度與CT值顯著相關(guān)[25-26],本試驗(yàn)中的對照組CT檢測雞脛骨骨干骨密度較低,變得疏松多孔,骨小梁密度較低,成骨細(xì)胞數(shù)量少而破骨細(xì)胞數(shù)量多,吸收腔內(nèi)有大量破骨細(xì)胞,骨吸收大于骨形成。這一現(xiàn)象說明在禽類日糧中鈣缺乏時,血液鈣含量降低,促進(jìn)甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)的釋放,刺激骨吸收加劇,機(jī)體補(bǔ)充血鈣[27-28]。為維持骨量的恒定,其結(jié)構(gòu)受到破壞,骨的皮質(zhì)厚度較薄密度較低,進(jìn)而引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生。同樣飼養(yǎng)環(huán)境下,杜仲葉提取物組和杜仲葉發(fā)酵物組飼喂60 d后,這種情況有明顯改善,與對照組相比這2組的骨結(jié)構(gòu)致密,骨密度明顯增高,吸收腔較小,成骨細(xì)胞數(shù)量多,破骨細(xì)胞數(shù)量較少。

顯微鏡下觀察杜仲葉添加組和杜仲葉發(fā)酵添加組的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),髓腔內(nèi)的骨小梁較粗,面積大,間距小,且大都相互連接,說明在飼料中添加杜仲葉提取物和杜仲葉發(fā)酵物可以有效地預(yù)防青年蛋雞骨強(qiáng)度的下降。

骨組織形態(tài)計量學(xué)和CT的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物添加組和杜仲葉發(fā)酵組的骨小梁以及骨密度各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于對照組,說明杜仲葉提取物和杜仲葉發(fā)酵物可以在蛋雞生長發(fā)育階段有效地促進(jìn)骨骼發(fā)育。綜上所述,在雞日糧中添加杜仲葉提取物和杜仲葉發(fā)酵物均可以有效地改善青年籠養(yǎng)雞的骨代謝,使骨重建活動增加,一定程度上改善骨質(zhì)疏松的癥狀。為了驗(yàn)證上述結(jié)果,本研究對脛骨進(jìn)行了微量元素的檢測。Mg、Ca、Zn、Cu是體內(nèi)重要的微量元素,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些微量元素含量升高,表明微量元素對籠養(yǎng)雛雞雞骨的生長發(fā)育有特殊意義,微量元素不僅是各種絡(luò)合性藥物的作用核心,更是骨代謝各種酶的活性中心。其中Ca直接參與骨的組成,與骨骼強(qiáng)度直接相關(guān),并且骨Ca在蛋雞中參與蛋殼的形成。Mg會影響骨的生長、修復(fù)以及骨中Ca、P的代謝。Zn、Cu、Fe則間接參與骨代謝的過程。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,2個試驗(yàn)組脛骨中的Mg、Ca、Zn等與骨結(jié)構(gòu)和功能密切有關(guān)的金屬離子水平顯著增高,充分證明杜仲葉提取物和杜仲發(fā)酵物的添加確實(shí)可以提高骨質(zhì)內(nèi)的微量元素,這與本試驗(yàn)中CT掃描和染色的結(jié)果相符,骨密度和骨骼結(jié)構(gòu)都得到了改善。這一結(jié)果可能是因?yàn)槎胖偃~本身含有豐富的礦物元素,在飼料中添加可以有效提高雞骨中的礦物元素,或是杜仲中含有可以促進(jìn)骨骼吸收礦物元素的有效成分,而這些礦物元素的升高則促進(jìn)了骨骼的發(fā)育和代謝。以前的研究表明成骨細(xì)胞外的鐵離子濃度與成骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度成反比,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2個試驗(yàn)組與對照組相比,微量元素Fe均有下降的趨勢,可能由于2個試驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高導(dǎo)致細(xì)胞外鐵離子濃度減少所致,說明可能是鈣離子的攝入不足導(dǎo)致鐵離子的異常,而過量的鐵沉積會影響正常的骨代謝[29-30],是鈣離子不足條件下的一種補(bǔ)償效應(yīng),添加了杜仲葉提取物和杜仲發(fā)酵物可以緩解這一現(xiàn)象。

本試驗(yàn)在雞日糧中添加杜仲葉提取物和杜仲葉發(fā)酵物均可以改善雞的骨發(fā)育和骨代謝,提高雞骨內(nèi)微量元素含量,使骨重建活動增加,一定程度上改善雞的健康狀況。目前蛋雞主要采取籠養(yǎng)的飼養(yǎng)方式,即便是會定期給予一定量的運(yùn)動,整體而言仍然運(yùn)動不足。又由于在性成熟后,在雌激素刺激的條件下,雞的結(jié)構(gòu)骨生長受到抑制,蛋殼形成需要骨Ca的參與,導(dǎo)致鈣負(fù)平衡,易出現(xiàn)籠養(yǎng)蛋雞疲勞綜合征,并且表現(xiàn)為產(chǎn)蛋性能大幅降低,蛋品質(zhì)降低[31]。而對于肉雞來說,也可能會因?yàn)楣趋揽焖偕L而出現(xiàn)腿部骨骼問題[32]。在早期通過飲食或其他方式給予較為大量的Ca沒有觀察到顯著的副作用,并且可以減少后期結(jié)構(gòu)骨的損失[33]。

本試驗(yàn)的結(jié)果表明,使用杜仲提取物以及杜仲發(fā)酵物可以使骨密度更加致密,減少吸收腔,改善骨骼結(jié)構(gòu),增強(qiáng)骨骼硬度。這可能是杜仲通過改善骨骼對礦物元素的吸收代謝而改善的,或是通過激活骨生長的相關(guān)信號通路而實(shí)現(xiàn)的[34]。此外,大量的研究證實(shí),與西藥相比,杜仲皮提取物可以有效地抗骨質(zhì)疏松,還降低了西藥的毒副作用[35],因此我們猜測使用杜仲來預(yù)防人體骨質(zhì)疏松也有較好的作用。Hussain等[36]研究表明,杜仲葉和杜仲皮所含活性成分比較相似,都含有豐富黃酮類、木質(zhì)素類,本試驗(yàn)結(jié)果表明杜仲葉提取物和杜仲葉提取物發(fā)酵物與杜仲皮提取物中在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松方面具有相似的作用,因?yàn)槎胖偃~比杜仲皮的采集更為便捷,對樹的損傷更小,成本更低,所以應(yīng)用前景更為廣闊。將杜仲葉提取物和杜仲葉提取發(fā)酵物用于人類老年性骨質(zhì)疏松和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松防治具有重要意義。

4 結(jié) 論

在雞日糧中添加杜仲葉提取物和杜仲葉發(fā)酵物均可以改善雞的骨發(fā)育和骨代謝,提高雞骨內(nèi)Mg、Ca、Fe、Cu、Zn等微量元素含量,對預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松具有積極作用。