李麗琴,張 鼎,袁 莉,向軍軍,陳 煒,胡躍強

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530001;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530001)

缺血性中風(fēng)(Ischemic stroke,IS)作為臨床常見的一種因大腦血流中斷或受阻,從而引發(fā)的以神經(jīng)功能缺損為主要表現(xiàn)的腦血管疾病[1-2]。本病的發(fā)病機制較為復(fù)雜,近年來,線粒體鐵死亡(Ferroptosis,FPT)儼然成為了缺血性中風(fēng)疾病的研究新熱點。線粒體鐵死亡是一種受鐵調(diào)控的非凋亡細胞死亡形式,其發(fā)展過程以脂質(zhì)活性氧物質(zhì)在神經(jīng)細胞的大量堆積,最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生以及神經(jīng)元凋亡[3-4]。因此,靶向調(diào)控線粒體鐵死亡通路相關(guān)蛋白可能為治療缺血性中風(fēng)提供一種全新的策略。

近年來,miRNA作為一種存在于各種疾病病理過程的調(diào)節(jié)劑,逐漸映入學(xué)者眼簾[5]。多項研究顯示,miR-137可通過谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1(GLT-1)負性調(diào)節(jié)細胞鐵穩(wěn)態(tài)[6],但其能否通過調(diào)控鐵代謝相關(guān)蛋白,從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用尚不明確。此外,大量事實證據(jù)表明,中醫(yī)學(xué)可以間接性地調(diào)控相關(guān)小分子,從而靶向通路蛋白和mRNA的上調(diào)或下調(diào),而以“陽虛為本”的溫陽復(fù)元方正是基于這一特性。故本研究以miR-137為立足點,通過聯(lián)合溫陽復(fù)元方,進而調(diào)控鐵通路相關(guān)蛋白的表達,從而為本方的基礎(chǔ)研究提供客觀科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD老齡大鼠75只,12月齡,體重250～300 g,由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2019-0014。本實驗方案通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號:DW20211204-195)。

1.2 實驗藥物 溫陽復(fù)元方組成:白附片、黃芪、黨參各30 g,石菖蒲20 g,淫羊藿、田三七各15 g,干姜10 g,炙甘草6 g。以上藥物均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一采購,要求同一批次(批號:20190701)、同一質(zhì)量、同一產(chǎn)地。所有藥物浸泡30 min,白附片先煎1 h,后加入其他藥物,分兩次煎煮;再大火濃縮至含原生藥濃度1.0 g/ml的藥液。根據(jù)成人(70 kg)與大鼠體表面積換算,確定大鼠灌胃劑量為14.04 g/kg。

1.3 主要試劑和儀器

1.3.1 實驗試劑:miR-137模擬腺相關(guān)病毒(上海吉滿生物科技有限公司),Trizol Reagent(美國Ambion公司,批號:284909),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海新貝生物科技有限公司):mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:F2967),miR-137逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:F3528);擴增試劑盒(上海新貝生物科技有限公司):mRNA擴增試劑盒(批號:F2967),miR-137擴增試劑盒(貨號:F3528);一抗(北京Affinity Biosciences公司):TFR(貨號AF5343,1∶2000);BCRP(貨號 AF5177,1∶2000);二抗:山羊抗兔HRP-IgG(北京Biosharp公司,貨號 BL003A,1∶20000);ECL化學(xué)發(fā)光物測試盒,DEPC水,Marker,GAPDH抗體(北京Biosharp公司,貨號分別是:BL523A,BL510A,BL712A,BL0068)。

1.3.2 實驗儀器:Stero Drive立體定位系統(tǒng);多功能酶標(biāo)儀(M200PRO型/瑞士TECAN公司); PCR儀(Light Cycler 96型/瑞士Roche公司);光學(xué)顯微鏡(Olympus型/CX41-12 C02)低溫離心機(Centrifuge 5418型/德國Eppendorf公司);電泳儀(Power Pac Basic型/美國BIO-RAD公司);凝膠成像系統(tǒng)(Chemi Doc XRS型/美國BIO-RAD公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠分組及處理:75只SD大鼠分為五組,分別是假手術(shù)組、模型組、溫陽復(fù)元方組、miR-137模擬組以及miR-137模擬對照組(n=15),每組按照再灌注時間點24 h、7 d、14 d分為三個亞組(n=5)。在Longa線栓法[10]的基礎(chǔ)上加以改良制備大鼠腦右側(cè)CIRI模型,正常的大鼠腦組織呈現(xiàn)為紅色,而I/R損傷的大鼠腦組織呈現(xiàn)為白色,為明顯的腦梗死,證明I/R損傷大鼠模型制作成功(圖1)。各組分別作如下處理。假手術(shù)組:僅暴露大鼠右側(cè)大腦頸動脈并縫合。模型組:線栓插入大鼠頸內(nèi)動脈17 mm并結(jié)扎,2 h后拔出線栓造成I/R,造模后正常飼養(yǎng);溫陽復(fù)元方組:在制作I/R模型前30 min給予溫陽復(fù)元方灌胃,待大鼠麻醉清醒2 h后,每天上、下午各1次繼續(xù)予該方灌胃。miR-137模擬組和miR-137模擬對照組:顱內(nèi)缺血側(cè)大腦中動脈(MCA)區(qū)分別注射miR-137 模擬劑及miR-137空載體,注射7 d后制備I/R模型,余步驟同溫陽復(fù)元方組。

圖1 成模后大鼠TTC染色(24 h)

1.4.2 腦立體定位注射相關(guān)病毒:使用0.3%戊巴比妥鈉以10 ml/kg的劑量麻醉大鼠后,將其固定在腦立體定位儀框架中,參照大鼠腦立體定位圖譜,將注射器移至大腦MCA附近并標(biāo)記(以前囟點為0點,向后3.5 mm,向右2.5 mm),用顱骨鉆在標(biāo)記點垂直鉆一小孔,將注射器自顱骨表面垂直進針3 mm,分別將腺相關(guān)病毒miR-137 mimic和miR-137空載體以0.4 μl/min的速度緩慢注射到miR-137模擬組和miR-137模擬對照組的大鼠腦內(nèi),注射完成后留針5 min,將微量注射器緩慢拔出。

1.4.3 神經(jīng)功能缺損評分:采用Zea-Longa 5級評分法[7]對清醒后的大鼠進行神經(jīng)功能評分。1級(0分):大鼠無神經(jīng)功能缺損;2級(1分):大鼠無法充分伸展左爪,為輕度神經(jīng)功能損傷;3級(2分):大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)圈,為中度神經(jīng)功能損傷;4級(3分):大鼠不斷向左側(cè)傾斜,為重度神經(jīng)功能損傷;5級(4分):大鼠已基本無意識。剔除4分大鼠,選擇造模成功的大鼠進入實驗。

1.4.4 TTC染色:造模結(jié)束后,選取模型組大鼠進行麻醉后直接斷頭取腦,應(yīng)當(dāng)保持大腦的完整性,-20 ℃冷凍20 min后進行切片,然后切成2 mm厚的冠狀切片(5～6片),將切片置于濃度為2%氯化三苯四氮唑(TTC)中,在37 ℃下孵育30 min,將每段在4%多聚甲醛中浸泡24 h,然后拍照,觀察腦梗死病變。

1.4.5 RT-qPCR 檢測缺血側(cè)相關(guān)因子mRNA的表達:使用 Trizol試劑提取大鼠總RNA。提取后,測定RNA 的濃度和純度,使用mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在37 ℃下15 min和 85 ℃下5 s進行逆轉(zhuǎn)錄,得到在RNA各個位置逆轉(zhuǎn)錄效率均一的cDNA,最后進行擴增,過程如下:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,使用全自動實時熒光定量儀器進行 PCR 產(chǎn)物的檢測。所用引物序列見表1。實驗所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計算分析。

表1 基因擴增引物信息

1.4.6 Western blot檢測缺血側(cè)相關(guān)因子蛋白表達:從-80 ℃冰箱取出保存的大鼠腦組織,剪下適量,放進配制好的細胞裂解液(PMSF:高效RIPA組織細胞裂解液)中,各試管總量加500～600 μl,使用高速低溫組織研磨機研磨均勻,后在離心機中4 ℃,12000 r/min離心10 min,取上清液,加入5倍蛋白質(zhì)上樣緩沖液,然后高溫水煮6～8 min,變性、置冷,-20 ℃保存,根據(jù)目的蛋白分子量大小配制10%的分離膠和5%的濃縮膠,將準(zhǔn)備好的樣品上樣,恒壓80 V,電泳結(jié)束后,將 PAGE膠從玻板上卸下,轉(zhuǎn)膜,在濕式轉(zhuǎn)印槽中恒流200 mA轉(zhuǎn)1 h,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,取1 g 5%脫脂奶粉加進4 ml的PBST溶液中配成封閉液備用,將膜與一抗在4 ℃下封閉孵育過夜;用PBST洗膜3次,每次10 min;用二抗液稀釋二抗,室溫下孵育二抗1 h。用1×PBST洗膜3次,每次10 min;按1∶1比例混合ECL化學(xué)發(fā)光物測試盒中的A液和B液用以顯示條帶,進行圖像采集,圖像處理軟件(Image J)用于圖像分析蛋白相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多個樣本間的比較采用單因素方差分析,組間比較方差齊者,則用LSD-t檢驗,方差不齊者,則用非參數(shù)檢驗(Tamhane’sT2檢驗);P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 見表2。假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能損傷癥狀;與假手術(shù)組相比,模型組大鼠有明顯的神經(jīng)功能損傷,神經(jīng)功能評分顯著升高(P<0.01);與模型組比較,其余各組神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.01,P<0.05),且miR-137模擬組得分最低。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(分)

2.2 各組大鼠腦組織miR-137表達量比較 見表3。與假手術(shù)組相比,模型組miR-137的mRNA表達顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,溫陽復(fù)元方組和miR-137模擬組中miR-137的表達量明顯升高(P<0.01),以miR-137模擬組最為顯著;與miR-137模擬對照組相比,miR-137模擬組其表達明顯升高(P<0.01),于7 d時達最高峰(P<0.01)。

表3 各組大鼠miR-137表達量比較

2.3 各組大鼠腦組織TFR、BCRP mRNA的表達比較 見表4。與假手術(shù)組相比,模型組TFR mRNA表達量明顯升高(P<0.01),BCRP mRNA表達量在各時間點均顯著降低(P<0.01);與模型組比較,溫陽復(fù)元方組和miR-137模擬組中TFR mRNA表達量顯著降低,BCRP mRNA表達量明顯升高(P<0.01),以miR-137模擬組最為顯著;與miR-137模擬對照組相比,miR-137模擬組TFR mRNA表達量明顯降低,BCRP mRNA表達量明顯升高(P<0.01),于7 d表達量最為顯著。

表4 各組大鼠腦組織TFR、BCRP mRNA表達比較

2.4 各組大鼠腦組織TFR、BCRP蛋白相對表達量比較 見表5(圖2)。與假手術(shù)組相比,模型組TFR 蛋白表達量顯著升高,BCRP蛋白表達量顯著降低(P<0.01);與模型組比較,溫陽復(fù)元方組和miR-137模擬組中TFR 蛋白表達量顯著降低(P<0.01),BCRP 蛋白表達量顯著升高(P<0.01),其中miR-137模擬組較為顯著;與miR-137模擬對照組相比,miR-137模擬組TFR蛋白表達量顯著降低,BCRP 蛋白表達量明顯升高(P<0.01),于7 d表達量最為顯著。

表5 各組大鼠腦組織TFR、BCRP蛋白相對表達量比較

圖2 各組大鼠TFR(左)、BCRP(右)蛋白表達電泳圖

3 討 論

扶陽學(xué)派認為中風(fēng)的基本病機為元陽虧虛,臟腑溫煦功能失調(diào),陰寒內(nèi)生,導(dǎo)致寒凝血瘀;痰瘀阻滯又進一步阻遏陽氣的化生,導(dǎo)致肝風(fēng)夾痰上蒙清竅,發(fā)為中風(fēng)?；凇瓣柼摓楸尽钡暮诵牟C,創(chuàng)制溫陽復(fù)元方治療本病。本方是由白附片、黃芪、黨參、石菖蒲、淫羊藿、田三七、干姜、炙甘草等藥物組成,方中白附片可溫陽行水,大補少陰之腎陽為君藥。臣以黃芪補氣升陽,大補脾胃之氣,氣行則血行,有行滯通絡(luò)之效;黨參助黃芪補脾肺之氣;辛熱之干姜溫中散寒,助附子溫脾胃之陽。淫羊藿引陽入陰,通達內(nèi)外;石菖蒲化痰通竅;田三七活血散瘀通絡(luò);上三藥為佐藥,炙甘草為使藥。諸藥合用,共奏溫陽益氣、化痰通絡(luò)之功。課題組前期大樣本多中心的臨床試驗研究發(fā)現(xiàn),本方能明顯改善缺血性中風(fēng)患者的神經(jīng)功能和日常生活能力,這也為本方在臨床和基礎(chǔ)實驗研究方面奠定了重要基礎(chǔ)[8-11]。

FPT是一種鐵依賴形式的調(diào)節(jié)性壞死,通過影響鐵代謝或脂質(zhì)過氧化在IS的發(fā)展中起著重要作用。多項證據(jù)研究證實[12-13],抑制線粒體鐵死亡通路可以有效改善缺血性腦損傷,減輕神經(jīng)缺損功能障礙。最新研究顯示[14],轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)可以介導(dǎo)鐵蛋白從細胞外進入細胞,是一種通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合參與控制細胞鐵供應(yīng)的膜受體,機體中血清Fe3+可以通過TFR還原為Fe2+,再經(jīng)二價金屬離子轉(zhuǎn)運體DMT1轉(zhuǎn)入內(nèi)皮細胞質(zhì),而在缺血缺氧狀態(tài)下TFR的高表達加速誘導(dǎo)鐵死亡[15-16]。因此,TFR被認為是鐵死亡發(fā)生的標(biāo)志蛋白之一;而胸腺癌抵抗蛋白(BCRP)作為一種血紅素鐵輸出蛋白,可以代謝過量的卟啉和血紅素,維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[17]。同時,當(dāng)機體發(fā)生缺血缺氧后,兩種蛋白的功能和轉(zhuǎn)化形式進一步發(fā)生改變,從而導(dǎo)致血腦屏障的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)發(fā)生紊亂,最后發(fā)生腦組織損傷。因此,調(diào)控鐵死亡通路上相關(guān)蛋白表達可能更好地發(fā)揮腦保護作用[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)干細胞中的BCRP表達通過防止導(dǎo)致線粒體死亡的血紅素積累來保護造血干細胞免受缺氧環(huán)境的影響,提高細胞在缺氧狀態(tài)下的存活率。此外,大鼠腦缺血后海馬CA2區(qū)BCRP的表達量減少,可以進一步通過藥物干預(yù)增加其表達效應(yīng),發(fā)揮神經(jīng)保護作用[20]。

MicroRNA作為微小RNA,是一種負調(diào)控基因表達的小非編碼RNA分子[21-22],已經(jīng)成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷新的治療靶點。同時,miR-137作為腦特異性的 miRNA,已經(jīng)被證實可以通過其過表達抑制氧-葡萄糖剝奪和再氧合(OGD/R)模型下相關(guān)因子的上調(diào)或下調(diào),從而進一步有效改善局灶性腦缺血后的損傷[23]。miR-137還可能通過抑制炎癥標(biāo)志物的釋放來減少腦梗死體積,改善MCAO大鼠的認知功能[24]。

本次研究顯示,大鼠腦缺血后TFR表達顯著增加,而miR-137和BCRP表達明顯下降,其直接結(jié)果導(dǎo)致鐵離子內(nèi)流增加,而外輸減少,致使神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)破壞而鐵死亡發(fā)生。外源性行miR-137過表達后發(fā)現(xiàn),miR-137可上調(diào)BCRP表達,抑制TFR的表達,促進細胞內(nèi)鐵外排,減少神經(jīng)元損傷。此外,我們進一步發(fā)現(xiàn),溫陽復(fù)元方聯(lián)合miR-137可進一步調(diào)控線粒體鐵死亡通路上相關(guān)蛋白和mRNA的表達效量,從而減少神經(jīng)細胞過度損傷,發(fā)揮腦保護作用。溫陽復(fù)元方的不同劑量可能有著不同程度上的治療效果,因此在后續(xù)研究中,我們將繼續(xù)完善實驗分組設(shè)計。