惠嫣然,董 菲,賈文浩,肖華麗,余林波,黃麗君,毛天詩,林 謙,周 鹍

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;2.北京市宣武中醫(yī)醫(yī)院,北京 100050;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京 100029;4.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院新疆兵團(tuán)阿拉爾醫(yī)院,新疆 阿拉爾 843300;5.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700;6.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院,北京 100078)

2018年我國18歲以上的居民高血壓加權(quán)患病率達(dá)到27.5%,估計(jì)中國高血壓病患病人數(shù)已接近3億,且患病率總體呈增高趨勢[1]。高血壓病患者血壓長期升高常造成心肌損傷,心肌損傷后過度代償修復(fù)可導(dǎo)致心肌纖維化(Myocardial fibrosis,MF)。MF可進(jìn)一步導(dǎo)致心臟舒張功能下降[2],是各種心血管疾病走向心力衰竭的主要途徑[3]。MF的病理基礎(chǔ)為心臟組織中心肌成纖維細(xì)胞(Cardiac fibroblasts,CFBs)的病理性增多及細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的過度沉積[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)是調(diào)節(jié)ECM動態(tài)平衡的關(guān)鍵酶[5]。轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smads(TGF-β/Smads)信號通路是促進(jìn)MF的重要通路[6],能夠調(diào)節(jié)MMP/TIMPs的平衡,促進(jìn)ECM的產(chǎn)生和增殖,導(dǎo)致MF的發(fā)展[7]。

芪參六味方是北京中醫(yī)藥大學(xué)林謙教授立足于氣血理論而擬定的經(jīng)驗(yàn)方,具有益氣活血,補(bǔ)益肝腎的功效。課題組所在團(tuán)隊(duì)前期已進(jìn)行多項(xiàng)臨床研究[8-10],研究結(jié)果均表明芪參六味方治療高血壓舒張功能障礙療效顯著,且安全可靠。在此基礎(chǔ)上,本研究旨在進(jìn)一步探討芪參六味方是否通過調(diào)控TGF-β1/Smad2/3通路改善MF,從而改善心臟舒張功能,為臨床提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 20周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats,SHR),同齡雄性魏-凱二氏大鼠(Wistar-kyoto rats,WKY),SPF級,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物房,恒溫恒濕,專人喂養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 芪參六味方配方顆粒,其原方組成為:生黃芪、丹參、川芎、葛根各30 g,熟地黃、澤瀉、益母草各15 g,三七、山茱萸、茯苓、夏枯草各10 g。按比例提取為配方顆粒,應(yīng)用時(shí)使用無菌蒸餾水配制灌胃液進(jìn)行灌胃。氯沙坦鉀片(國藥準(zhǔn)字J20180054),使用時(shí)無菌蒸餾水溶解。

30%丙烯酰胺(北京索萊寶生物科技有限公司)、1 mol/L Tris-HCL(pH6.8)(北京索萊寶生物科技有限公司)、1.5 mol/L Tris-HCL(pH8.8)(北京索萊寶生物科技有限公司)、4×蛋白上樣緩沖液(北京索萊寶生物科技有限公司)、PCR引物(北京Invitrogen公司)、預(yù)染蛋白marker(美國thermo公司)、PVDF膜(美國MILLPORE公司)、Masson染色試劑盒、天狼猩紅染色試劑盒、增強(qiáng)型ECL試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)、一抗GAPDH(美國bioworld公司)、二抗(美國KPL公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 小動物超聲心動檢測儀(美國Visual Sonics公司)、凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)、渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、電泳儀、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽(北京六一儀器廠)、分光光度計(jì)(美國Therno scientific公司)。

1.4 分組與給藥 將15只20周齡雄性SHR大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥組、氯沙坦鉀組,每組5只,5只同齡雄性WKY大鼠作為對照組;適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,各組給予相應(yīng)藥物灌胃,共干預(yù)12周。具體方案如下:①中藥組劑量為34.16 g/(kg·d),相當(dāng)于臨床常用劑量;②氯沙坦鉀組劑量為8.33 g/(kg·d),相當(dāng)于臨床劑量50 mg/d;③對照組與模型組予等量無菌蒸餾水。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 超聲心動檢測:使用Vevo770型小動物超聲心動檢測儀檢測大鼠心臟功能。大鼠脫毛后,使用2%異氟烷持續(xù)吸入待角膜反射消失。在左室短軸位的乳頭肌水平,測量并計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)與左室短軸縮短率(LVFS);心尖四腔心切面,測量舒張?jiān)缙诳缍獍暄魉俣?E)與舒張?jiān)缙诙獍戥h(huán)運(yùn)動幅度(E’),計(jì)算E/E’值。每個(gè)參數(shù)均在同一部位重復(fù)測量3次,取平均值。

1.5.2 左室心肌病理染色及膠原含量測定:將大鼠斷頸處死后迅速取左室心肌組織,4%甲醛溶液中固定48 h后,石蠟包埋切片。進(jìn)行Masson染色及苦味酸-天狼猩紅染色。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察膠原纖維含量及分布,Masson染色下膠原纖維呈藍(lán)色,苦味酸-天狼猩紅染色下膠原纖維呈粉紅色;在偏光顯微鏡下觀察Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ含量及分布。利用Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件測量兩種膠原纖維的面積,并計(jì)算Collagen Ⅰ/Collagen Ⅲ比值。

1.5.3 Western blot法測定各組大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白的表達(dá):采用Western blot法檢測。心肌組織研磨后加入RIPA細(xì)胞裂解液充分裂解,離心提取蛋白,制備SDS-PAGE凝膠,電泳;將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,室溫下封閉1 h,加入一抗工作液,在4 ℃條件下反應(yīng)過夜;TBST洗膜后加入二抗工作液,室溫孵育1 h,再次洗膜;加入ECL發(fā)光液顯影。完成后使用UVP凝膠成像分析系統(tǒng),采圖并分析灰度值。

1.5.4 RT-PCR法檢測各組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá):采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)法檢測。按照Trizol試劑說明書提取心肌組織中的總RNA,用分光光度計(jì)檢測純度及含量;參照Real-Time PCR試劑盒說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,加入相應(yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增,引物如下(購自北京Invitrogen公司)。GAPDH:上游5’-CTGACTTCAACAGCGACACCCA-3’,下游5’-CCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’;TGF-β1:上游5’- TTCCTGGCGATACCTCAGCAACC-3’,下游5’- TCAATTTCCCCTCCACGGCTCA-3’;Smad2:上游5’- TCATGCCAACAGAAAACTTCGAG-3’,下游5’- TTCCTTAGACTGTGGGATGC-3’;Smad3:上游5’- AGGGCTGCTCTCCAATGTCA-3’,下游5’- CGAAGACCTCCCCTCCGAT-3’;目的基因和內(nèi)參分別進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。每個(gè)樣本檢測3個(gè)復(fù)孔。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)資料均為計(jì)量資料,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異比較用單因素方差分析;P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心臟收縮與舒張功能比較 見表1。與對照組比較,模型組大鼠LVEF、LVFS均明顯降低(P<0.05),E/E’明顯升高(P<0.05);與模型組比較,中藥組與氯沙坦鉀組E/E’顯著下降(P<0.01)。結(jié)果表明,芪參六味方可顯著改善SHR大鼠的左室舒張功能。

表1 各組大鼠心臟收縮與舒張功能比較

2.2 Masson染色及各組大鼠心肌膠原纖維面積比較 Masson染色結(jié)果顯示,對照組大鼠心肌肌束間有少量的藍(lán)色膠原纖維,排列均勻。與對照組比較,模型組藍(lán)色區(qū)域明顯擴(kuò)大,心肌肌束間隙增寬,在心肌細(xì)胞間質(zhì)中可見明顯的纖維化改變,且伴有較多膠原沉積。與模型組比較,中藥組與氯沙坦鉀組MF程度較輕,膠原含量較少,排列較均勻。見圖1。

圖1 大鼠心肌組織膠原纖維分布圖(Masson染色,×400)

心肌膠原纖維面積百分比比較顯示,與對照組(0.06±0.06)%相比,模型組膠原纖維面積百分比(4.12±3.72)%顯著升高(P<0.01);與模型組比較,中藥組(0.45±0.57)%、氯沙坦鉀組(0.34±0.52)%膠原纖維面積顯著縮小(P<0.01)。

2.3 苦味酸-天狼猩紅染色及各組大鼠Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ分布比較 在普通光鏡下,苦味酸-天狼猩紅染色淡黃色區(qū)域代表心肌細(xì)胞,粉紅色區(qū)域代表膠原纖維。對照組心肌間質(zhì)中膠原纖維含量較少,排列均勻;與對照組比較,模型組膠原含量明顯增多,排列紊亂;與模型組比較,中藥組及氯沙坦鉀組膠原含量均減少,排列較均勻,其中中藥組膠原纖維含量最少,排列均勻,與對照組差異較小。

在偏光顯微鏡下觀察經(jīng)苦味酸-天狼猩紅染色左心室心肌組織切片,可以清晰顯示Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ,Collagen Ⅰ纖維排列緊密,呈橙黃色或亮紅色,Collagen Ⅲ分布在Collagen Ⅰ周邊,呈綠色。對照組心肌膠原分布均勻,含量較少;與之比較,模型組可見膠原纖維數(shù)量增多,排列紊亂,以Collagen Ⅰ增多為主;與模型組比較,中藥組及氯沙坦鉀組膠原纖維面積減小,以Collagen Ⅰ減少為主,排列紊亂較輕。見圖2。

圖2 普通光鏡及偏光顯微鏡下大鼠心肌組織膠原纖維分布圖(苦味酸-天狼猩紅染色,×400)

偏光顯微鏡下計(jì)算大鼠左室心肌組織Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ面積比值百分比,結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組比值顯著增大(P<0.01);與模型組比較,中藥組、氯沙坦鉀組比值明顯減小(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠CollagenⅠ與Collagen Ⅲ面積比值比較(%)

2.4 各組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)水平比較 見表3(圖3)。Western blot結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01);與模型組比較,中藥組與氯沙坦鉀組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.01)。與對照組比較,模型組MMP-9蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01),TIMP-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01);與模型組比較,中藥組MMP-9蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。結(jié)果表明,芪參六味方可以調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1的平衡,降低SHR大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá),減輕MF程度。

圖3 各組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)水平比較

2.5 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平比較 見表4(圖4)。與對照組比較,模型組TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.01);與模型組比較,中藥組TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.01),氯沙坦鉀組Smad2、Smad3蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果表明,芪參六味方可能通過調(diào)控TGF-β1/Smad2/3通路相關(guān)蛋白的表達(dá),改善SHR大鼠MF。

表4 各組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平比較

2.6 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)水平比較 見表5。與對照組比較,模型組TGF-β1、Smad2 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01),Smad3 mRNA表達(dá)水平有升高趨勢;與模型組比較,中藥組TGF-β1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),中藥組、氯沙坦鉀組Smad2 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)果表明,芪參六味方可能通過調(diào)控TGF-β/Smads通路TGF-β1、Smad2 mRNA的表達(dá),改善SHR大鼠MF。

表5 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

高血壓歸屬于“眩暈”范疇,臨床應(yīng)用較為廣泛,另外“頭痛”“脈脹”“肝風(fēng)”等臨床中也常有應(yīng)用。《素問》言:“諸風(fēng)掉眩,皆屬于肝?！备沃魇栊?若肝氣郁滯,則疏泄失職,肝郁日久化火則肝火亢盛,陰傷無以潛陽,則肝陽上亢,肝腎同源,虛損及腎,則肝腎虧虛,因此臨床多從肝腎論治高血壓。隨著病情的進(jìn)展,高血壓心肌纖維化患者可能出現(xiàn)心悸、氣喘、胸悶、胸痛等癥狀,因此根據(jù)患者臨床特點(diǎn),常將心肌纖維化歸屬于“胸痹心痛”“心悸”和“喘證”等范疇。也有學(xué)者將高血壓心肌纖維化命名為“風(fēng)眩合并心脹”[11]。周明龍等[12]基于“久病入絡(luò)”理論,認(rèn)為“血瘀”是高血壓心肌纖維化的基本病機(jī),治療當(dāng)以活血化瘀為主。吳美芳等[13]認(rèn)為本病病性為本虛標(biāo)實(shí),陽虛為本,痰濁、瘀血為標(biāo),治療以益氣溫陽、活血祛痰為法。王奇林等[14]認(rèn)為本病以心、肝、腎陰虛陽亢為主,長期心陰不足導(dǎo)致水濕、血瘀內(nèi)停,治療當(dāng)以滋陰潛陽為法,兼以祛濕化瘀。蔣嘉燁等[15]認(rèn)為本病屬痰濕壅盛,治療以化痰息風(fēng)、健脾祛濕為法。基于長期的臨床觀察和團(tuán)隊(duì)前期的一項(xiàng)橫斷面調(diào)查發(fā)現(xiàn),高血壓合并舒張功能障礙患者表現(xiàn)為“肝腎不足,氣虛血瘀”的證候特點(diǎn)[16]?！夺t(yī)學(xué)真?zhèn)鳌费?“人之一身,皆氣血之所循行,氣非血不和,血非氣不運(yùn)”?！皻鉃檠畮?血為氣之母”,心主血脈,心氣可推動血液運(yùn)行,濡養(yǎng)周身,肝腎不足日久心氣亦虛,心氣虛則血液運(yùn)行無力,而致心脈瘀阻。血瘀進(jìn)一步又阻礙氣機(jī),進(jìn)而加重氣虛,最終導(dǎo)致心肌纖維化。由此可見,肝腎不足、氣虛血瘀是高血壓心肌纖維化的核心病機(jī),治療當(dāng)以益氣活血、補(bǔ)益肝腎為主。

芪參六味方立足于氣血理論而創(chuàng)立,具有“益氣活血、補(bǔ)益肝腎”的功效。前期團(tuán)隊(duì)基礎(chǔ)研究證實(shí),黃芪、黨參、丹參等益氣活血藥物可以改善舒張性心力衰竭大鼠的心室舒張功能[17]。采用黃芪、丹參干預(yù)受Ang Ⅱ刺激后肥大的心肌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)可顯著降低心肌細(xì)胞總蛋白含量的代償性表達(dá),抑制心室重構(gòu)[18],且能通過調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)改善肥大心肌細(xì)胞的舒縮功能[19]。課題組所在團(tuán)隊(duì)前期已進(jìn)行了多項(xiàng)隨機(jī)對照臨床研究,其中一項(xiàng)隨機(jī)、對照、雙盲臨床試驗(yàn)研究納入了104例高血壓舒張功能障礙患者,結(jié)果發(fā)現(xiàn),芪參六味方干預(yù)8周后,治療組中醫(yī)證候積分和主要癥狀積分降低,癥狀改善明顯,左室舒張功能及左室舒張末內(nèi)徑均較對照組有顯著改善[8]。

MF是高血壓出現(xiàn)心臟舒張功能障礙的病理基礎(chǔ)和必經(jīng)環(huán)節(jié)。MF可使心肌的僵硬度增高,進(jìn)而導(dǎo)致心肌順應(yīng)性下降[20]。E/E’是判斷心臟舒張功能的重要指標(biāo),E/E’≥8提示存在舒張功能障礙[21]。高血壓MF最終可導(dǎo)致心力衰竭,且與心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)直接相關(guān)[22],因此MF的防治至關(guān)重要。中醫(yī)藥在改善高血壓癥狀及心臟功能、抑制或逆轉(zhuǎn)MF等方面具有一定優(yōu)勢。丁秀婷等[23]發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B可抑制SHR大鼠心肌纖維化。朱力權(quán)[24]采用益氣活血補(bǔ)腎法治療高血壓左室舒張功能障礙,發(fā)現(xiàn)相較于傳統(tǒng)西藥治療,益氣活血補(bǔ)腎法可有效改善臨床癥狀,并有助于控制血壓和改善心臟舒張功能。宋曉龍等[25]采用補(bǔ)虛瀉實(shí)、活血化瘀法治療冠心病心力衰竭,發(fā)現(xiàn)利心水方在改善冠心病心衰患者心肌重構(gòu)方面功效顯著,可一定程度上改善心肌纖維化。芪參六味方臨床已應(yīng)用多年,療效顯著,但仍缺乏相應(yīng)的基礎(chǔ)研究證據(jù),因此本研究采用SHR大鼠模型,通過對比中藥組與模型組心臟的收縮與舒張功能、心肌組織纖維化病理改變、纖維化及TGF-β1/Smad2/3信號通路相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)水平,證實(shí)芪參六味方可以通過TGF-β1/Smad2/3通路改善SHR大鼠MF。

ECM主要由Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ組成,膠原纖維可維持心肌纖維排列[26],影響心室僵硬度[27]。ECM的過度沉積是MF的主要病理特征之一,主要表現(xiàn)為膠原空間結(jié)構(gòu)排列紊亂、膠原蛋白的大量沉積及Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ比例失調(diào)等[4],從而導(dǎo)致心肌順應(yīng)性下降,影響心臟舒張功能。本研究采用SHR大鼠MF模型,干預(yù)12周后檢測大鼠的心臟舒縮功能,結(jié)果顯示,模型組大鼠LVEF、LVFS均明顯低于對照組,E/E’明顯升高,說明模型組大鼠心臟收縮、舒張功能出現(xiàn)障礙;取大鼠心肌組織進(jìn)行觀察,相較于對照組,模型組心肌細(xì)胞間質(zhì)中纖維化改變明顯,膠原大量沉積,Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ比例失調(diào),以Collagen Ⅰ增多為主。相較于模型組,中藥組E/E’明顯降低,心臟舒張功能明顯改善,鏡下可見膠原沉積減少,膠原纖維排列結(jié)構(gòu)均勻,且主要以降低Collagen Ⅰ為主。氯沙坦鉀組以上結(jié)果與中藥組相似。說明芪參六味方可通過改善ECM的沉積,抑制或逆轉(zhuǎn)MF,改善SHR大鼠的舒張功能,且效果不劣于氯沙坦鉀。

MMP/TIMPs比值失衡在MF中起著至關(guān)重要的作用,常作為MF的生物標(biāo)志物,MMP可誘導(dǎo)ECM中包括膠原纖維在內(nèi)的各種蛋白質(zhì)的降解,TIMPs是MMP的內(nèi)源性特異性抑制酶[5]。MF發(fā)展過程中,TIMP-1持續(xù)上調(diào),MMP-9對ECM的調(diào)節(jié)與TGF-β/Smads信號通路有關(guān)[28],且與MF呈正相關(guān)[29]。MMP/TIMPs之間的平衡對于心肌組織中ECM的重建至關(guān)重要,因此本研究對大鼠心肌組織中MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)模型組MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著升高,TIMP-1蛋白表達(dá)水平顯著降低;相較于模型組,中藥組主要降低了MMP-9蛋白表達(dá)水平,一定程度上改善了MMP/TIMPs比值失衡,從而減輕ECM的異常沉積,促進(jìn)ECM重建,抑制甚至逆轉(zhuǎn)MF進(jìn)程。

高血壓病血壓升高導(dǎo)致的心肌組織壓力負(fù)荷升高及RAAS系統(tǒng)的激活是造成MF的主要原因之一[30]。TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子,參與成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和遷移的調(diào)節(jié),以及ECM的產(chǎn)生[31]。高血壓可通過血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)上調(diào)TGF-β1的表達(dá)和釋放[32],TGF-β1是調(diào)節(jié)MF的重要因子,其上調(diào)或激活是導(dǎo)致MF的多種機(jī)制的共同途徑和中間橋梁[33],且其表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度可能存在一定相關(guān)性[34]。TGF-β/Smads信號通路是導(dǎo)致MF最經(jīng)典的一條通路。通路激活時(shí),Samd2/3被大量磷酸化,誘導(dǎo)TGF-β1蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo),介導(dǎo)后續(xù)信號通路的傳遞[6],影響MMP/TIMPs之間的平衡[7],進(jìn)而造成ECM的異常沉積。本研究對大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測定,模型組大鼠TGF-β1與Smad2蛋白及mRNA表達(dá)水平、Smad3蛋白表達(dá)水平均明顯升高,提示TGF-β1/Smad2/3通路調(diào)控本研究MF模型的發(fā)生發(fā)展。相較于模型組,中藥組TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平顯著降低,表明芪參六味方可以通過抑制TGF-β1/Smad2/3通路的過度激活,調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1之間的平衡,減輕細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,抑制或逆轉(zhuǎn)MF,改善SHR大鼠左室舒張功能。

綜上所述,MF是高血壓發(fā)展到心臟舒張功能障礙的病理基礎(chǔ),TGF-β1/Smad2/3通路是促進(jìn)MF的一條經(jīng)典通路。本研究針對高血壓MF肝腎不足,氣虛血瘀的基本病機(jī),采用芪參六味方干預(yù)SRH大鼠MF模型,證實(shí)芪參六味方可通過抑制TGF-β1/Smad2/3通路的過度激活,調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1之間的平衡,抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá),其中以抑制Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)為主,減輕細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,抑制或逆轉(zhuǎn)SHR大鼠心肌纖維化,改善SHR大鼠左室舒張功能,且芪參六味方治療高血壓MF療效不劣于氯沙坦鉀。