薛海燕, 張 磊, 周 妍, 馬 軍, 賀寶元, 孟 毅

(1.陜西科技大學 食品科學與工程學院, 陜西 西安 710021; 2.陜西科技大學 輕工科學與工程學院, 陜西 西安 710021; 3.陜西金牛乳業(yè)有限公司, 陜西 渭南 714000)

0 引言

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)是乳中主要過敏原之一[1],其相對分子量約為18.3 kDa.圖1、圖2為牛、山羊β-Lg三維立體結構,兩者單體都是由162個氨基酸殘基組成的.在pH為5～9時,羊乳的乳球蛋白比牛乳的乳球蛋白少3個負電荷,多一個正電荷殘基,這也說明了二者結構的不同[2].

圖1 牛β-Lg 三維立體結構

圖2 山羊β-Lg 三維立體結構

關于羊乳的研究目前僅局限于羊乳摻入牛乳的檢測方法[3]、羊乳貯存時間[4]與風味影響[5]等.張光艷等[6]研究了不同來源牛乳酪蛋白的過敏原性,結果表明酶法酪蛋白和膠束酪蛋白具有更高的過敏原性.白娜等[7]研究了不同乳樣的過敏免疫原性,表明駝乳的致敏性明顯低于牛乳,且與人乳相似.姜玉池等[8]在牛乳配方乳粉與山羊乳配方乳粉之間比較中,得出結論山羊乳配方乳粉的致敏性較弱,可作為牛乳的替代品,確定了羊乳與牛乳致敏性存在差異.盡管羊乳蛋白和牛乳蛋白組成極為相似,但山羊乳相對于牛乳的致敏性水平的高低還存在爭議,尤其是山羊乳β-Lg的致敏性[9].

關于食物過敏和耐受的分子機制顯示,免疫細胞分泌的細胞因子IL-2 、IL-4、IL-6、IL-12等參與耐受和過敏的網(wǎng)絡調節(jié)[10].作為免疫系統(tǒng)中細胞與細胞間相互作用的信號分子,在免疫應答、免疫調節(jié)和炎癥反應中能夠發(fā)揮多種生物學效應.因此白介素類細胞因子能反映免疫反應性的高低.

本文采用牛、山羊乳β-Lg分別致敏Balb/c小鼠,通過比較致敏后超敏外觀評分、體外培養(yǎng)小鼠淋巴細胞增值指數(shù)及細胞因子水平來建立牛羊乳β-Lg過敏動物模型,以此來反映牛羊乳免疫反應性差異,為牛羊乳致敏性的研究與探尋羊乳是否能作為牛乳過敏人群的代替乳源,提供一定的支撐依據(jù)和理論基礎.

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

山羊乳,陜西金牛乳業(yè)有限公司;標準牛乳β-Lg,美國sigma公司;HCl,Balb/c小鼠,購于西安交通大學;弗式完全佐劑,科昊生物工程有限責任公司;弗式不完全佐劑,科昊生物工程有限責任公司;紅細胞裂解液,中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司;檸檬酸,天津市化學試劑六廠;胎牛血清(FBS),上海遠慕生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖液干粉(PBS),西安赫特生物;SDS,普洛麥格生物技術有限公司;小鼠白細胞介素(IL-2、IL-4、IL-6、IL-12)ELISA試劑盒,江蘇酶免實業(yè)有限公司;其余試劑均為分析純.

1.2 主要儀器和設備

酶聯(lián)免疫檢測儀,熱電上海儀器有限公司;HC-3018R高速冷凍離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;PHS-3C型 pH 計,上海儀電科學儀器股份有限公司;HF90二氧化碳培養(yǎng)箱,賽默飛世爾科技有限公司;流式細胞儀,賽默飛世爾上海儀器有限公司;凝膠成像儀,立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠; Q-Sepharose Fast Flow色譜柱,美國GE公司;電泳儀,北京百晶生物技術有限公司;AKTA Purifier蛋白液相純化色譜,美國GE公司;Bürker細胞計數(shù)器,美國sigma公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 羊乳清蛋白的分離

將鮮羊乳進行離心,離心溫度為4 ℃,轉速為5 000 r/min,時間為20 min,重復兩次并過濾脂肪后即為脫脂羊乳,用HCl將脫脂羊乳的pH值調至4.1,室溫下靜置1 h后進行離心,離心速度5 000 r/min,時間為30 min,離心結束后上清液為羊乳清蛋白溶液[11].

1.3.2 羊乳β-Lg兩種不同分離方法影響探究

(1)化學沉淀法分離羊乳β-Lg

羊乳清蛋白溶液用0.6mol/L的檸檬酸溶液調pH至3.1、3.3、3.5、3.7、3.9后45 ℃恒溫水浴保溫1 h,充分沉淀后將溶液離心,離心速度為10 000 r/min,時間為40 min,離心后保留上清液.加入7%、8%、9%、10%的NaCl加入上清液中,充分振蕩使NaCl溶解,放入4 ℃冰箱冷藏靜置一晚.再次將樣品離心,速度為10 000 r/min,時間為40 min,上清液為羊β-Lg,將提取的蛋白溶液倒入8 000～14 000孔徑的透析袋中充分透析,大約48 h后冷凍干燥,-20 ℃保存[12].

(2)超濾離心法分離β-Lg

選擇孔徑為50 kDa的超濾離心管,量取10 mL制備好的羊乳清蛋白溶液,離心溫度為:4 ℃,速度為5 000 r/min,分別離心10 min、20 min、30 min.離心后透過液利用SDS-PAGE分析結果[13].

1.3.3 致敏小鼠

將Balb/c小鼠隨機分成三組:羊乳β-Lg致敏組、牛乳β-Lg致敏組、PBS陰性對照組,每組六只.如圖3所示,牛、羊乳β-Lg致敏組均在第0、7和14天用100 μg弗氏佐劑(首次免疫用完全佐劑,加強免疫用不完全佐劑)混合200 ul抗原對小鼠進行腹腔注射免疫,對照組注射等量無菌PBS;在第15天、22天和29天,牛、羊乳β-Lg致敏組改用含有霍亂毒素作為粘膜佐劑的200 ul抗原口服灌胃致敏小鼠,對照組口服等量無菌PBS[14].所有組在末次免疫后分離小鼠淋巴細胞進行體外培養(yǎng).

圖3 致敏小鼠示意圖

1.3.4 小鼠超敏現(xiàn)象外觀評分

通過對超敏反應現(xiàn)象的觀察,使用改良的報道系統(tǒng),進行數(shù)字量化評分[15]:“1”表示小鼠具有光滑的皮毛,眼睛明亮且具有警覺,沒有癥狀;“2”表示小鼠生理活躍,眼睛明亮,身體略微彎曲偶爾跳躍,在鼻子和頭部周圍劃傷和摩擦;“3”表示小鼠沒有警覺或活躍,坐著時駝背,閉著眼睛或瞇著眼睛,皮毛微微褶皺;“4”表示小鼠駝背,仍然對環(huán)境沒什么興趣,毛皮明顯皺起;“5”表示小鼠不反應刺激,皮毛瓶刷外觀.

1.3.5 淋巴細胞分離體外培養(yǎng)

收集細胞,在10 ℃和413×g離心10 min并懸浮在1 mL不完全培養(yǎng)基中.將淋巴細胞以1×106個細胞/100 μL的濃度接種于96孔微量培養(yǎng)板中的完全培養(yǎng)基(CM:RPMI-1640,補充有10%胎牛血清(FBS),1 mM非必需氨基酸,1 mM HEPES,1 mM丙酮酸鈉,10單位/mL青霉素-鏈霉素溶液).在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)12 h后,用相應抗原以200 μg/mL的濃度刺激細胞.未刺激的細胞用作陰性對照.120 h后,收集細胞,在10 ℃和413×g離心10 min,收集上清液并儲存在-80 ℃直至分析.

1.3.6 B淋巴細胞增殖分析

參照于思文等[16]的方法,借助流式細胞儀使用熒光標記快速鑒定分類淋巴細胞,通過使用細胞計數(shù)和比色方法測定淋巴細胞指數(shù)(PI).在37 ℃和5%CO2溫育120 h后,洗滌淋巴細胞并用大鼠抗小鼠CD4抗原和碘化丙啶染色.

根據(jù)實驗組與對照組結果,利用公式(1)計算細胞增殖抑制率(Cell proliferation inhibition rate,CPIR):

(1)

式(1)中:A1表示對照組吸光值;A0表示空白實驗組吸光;A2表示實驗組吸光值.

1.3.7 細胞因子譜

使用酶標儀與相應試劑盒配合測定分析抗原刺激后小鼠淋巴細胞分泌到培養(yǎng)基中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-12等的水平[17],設置空白孔、待測樣品孔(牛乳β-Lg致敏組、羊乳β-Lg致敏組)各組,每組四孔.加樣:先加40 μL樣品稀釋液,再加待測樣品10 μL待測樣品,空白組加入等體積PBS;加酶:每孔加入酶標試劑100 Ml,空白孔除外;溫育:封板膜封住37 ℃溫育60 min;洗滌:揭掉封板膜棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去重復5次,拍干;顯色:每孔加入50 μL顯色劑A后,再加入50 μL顯色劑B,輕輕震蕩混勻,37 ℃避光顯色15 min;終止:每孔加入終止液50 μL,終止反應;測定:以空白孔調零,450 nm波長依序測量各孔OD值.重復三次實驗取平均值及分析誤差[18].

2 結果與討論

2.1 羊乳β-Lg兩種不同分離方法比較

2.1.1 化學沉淀法分離羊乳β-Lg的影響

羊乳清蛋白中的β-Lg含量高達50%,在NaCl溶液中的溶解度較大,因此選取鹽沉淀法進行分離,用檸檬酸溶液調節(jié)乳清pH分別至3.1～3.9,加入NaCl進行鹽析后離心分離β-Lg.

如圖4 所示,1為羊乳清;2～5分別為NaCl濃度7%、8%、9%、10%,樣液分別在pH 3.1、3.3、3.5、3.7、3.9時,乳清蛋白中殘留的酪蛋白大量去除.由圖4(d)、(e)可看出,pH 3.7、3.9條件下,隨NaCl濃度的提高,雜蛋白去除率不高,各泳道蛋白質并未發(fā)生明顯變化,此條件下不能將β-Lg與其他蛋白質分開;由圖4(c)可知,當pH達到3.5時,NaCl濃度為9%時,從泳道4可以明顯看出少量其他乳清蛋白和酪蛋白;由圖4(b)可看出,pH為3.3,NaCl濃度為10%時,從泳道5可知雜蛋白的去除率較高,但從電泳圖中可以看出β-Lg并未得到有效分離;當pH為 3.1時,由圖4(a)可知,隨著NaCl濃度的提高,雜蛋白的去除率明顯增加,NaCl濃度達到10%時,能夠得到較純的β-Lg,分離的純度和得率如圖5所示.當pH值為3.1,NaCl濃度為10%時,分離出的β-Lg純度最高,經(jīng)Image J灰度值分析,其純度達到96.70%,得率為87.31%.實驗室購買的β-Lg標準品純度≥95%,故用此方法分離的β-Lg可以進行后續(xù)的研究.

圖4 不同pH與NaCl濃度處理后羊乳蛋白電泳結果圖

2.1.2 超濾離心法分離羊乳β-Lg的影響

超濾離心管可以用于分子量大小為1 000～3*105的蛋白質,截留分子量廣泛,通常包含有3 K、5 K、10 k、30 K、50 K、100 K、300 K、1 000 K、0.2 μL的聚醚砜膜,膠體等大分子有機物,也能分離[19].選擇截留分子量為50 kDa的超濾離心管,超濾時間對于分離的結果也有一定影響,將乳清加入超濾管中,分別離心10 min、20 min、30 min,收集透過液進行SDS-PAGE分析[20],結果如圖6(b)所示,超濾時間與羊乳β-Lg呈正相關關系,超濾離心10 min時,透過液中含有少量β-Lg,經(jīng)Image J灰度分析,結果如圖6(a)所示,超濾20 min和30 min時,溶液中出現(xiàn)了大量的β-Lg,此時得到的是含有β-Lg的混合物,純度別為25.29%和26.06%.

圖6 超濾時間對羊乳β-Lg分離影響

2.2 小鼠超敏現(xiàn)象評分表征

牛、羊乳β-Lg口服灌胃和腹腔超敏觀察及評分如圖7和表1所示,羊乳β-Lg口服灌胃和腹腔超敏評分均在“3～4”之間;牛乳β-Lg口服灌胃和腹腔注射超敏評分均在“4～5”之間;陰性對照組超敏評分均在“1～2”之間.羊乳β-Lg致敏小鼠超敏現(xiàn)象明顯低于牛乳β-Lg致敏組,以上表明羊乳β-Lg在兩種致敏方式中超敏外觀評分低于牛乳β-Lg.

表1 超敏現(xiàn)象外觀評分

圖7 不同組小鼠超敏現(xiàn)象觀察

2.3 淋巴細胞增殖表征

MTT測定法檢測小鼠淋巴細胞體外培養(yǎng)液中不同蛋白致敏對淋巴細胞增殖的影響.如圖8 所示,羊乳β-Lg致敏組OD均值為0.609,對照組OD均值為0.525;牛乳β-Lg致敏組OD均值為0.579,對照組OD均值為0.443.羊乳β-Lg致敏組抑制率為13.8%;牛乳β-Lg致敏組抑制率23.5%.羊乳β-Lg抑制率明顯低于牛乳β-Lg.結果表明了羊乳β-Lg對淋巴細胞的增殖影響比牛乳β-Lg更小.

圖8 不同致敏組吸光度

2.4 細胞因子水平

白介素細胞因子是免疫過程中具有典型意義的指標,由速發(fā)型超敏反應過程中T細胞所分泌,如圖9所示,羊乳β-Lg致敏組IL-2、IL-4、IL-6、IL-12水平均低于牛乳β-Lg致敏組,且IL-2 、IL-4的水平顯著上升;IL-6、IL-12水平顯著上升,但上升幅度較小,且全部細胞因子水平都顯著高于只添加PBS的對照組(P<0.05).

圖9 不同致敏組細胞因子水平

結合圖10可知,IL-2、IL- 6均具有免疫上調功能,同時IL-2還會促進T細胞生長分泌IL-4,盡管IL-4具有免疫下調功能,但高水平的IL-2會促進較多的IL-4分泌,因此在過敏反應中IL-2 、IL- 4、IL-6水平均呈上升趨勢,但細胞中IL-6初始水平較低,故上升幅度較小;IL-12主要作用于T細胞和NK細胞,可刺激活化型T細胞增殖,在過敏反應中參與密切,但其初始水平較低,故在過敏反應中雖呈上升趨勢,但波動不明顯.由此推測羊乳β-Lg相較于牛乳β-Lg對細胞的損傷程度更小,與MTT法所測結果統(tǒng)一,則羊乳β-Lg的免疫反應性低于牛乳β-Lg.

圖10 白介素對免疫細胞的調節(jié)作用

3 結論

本研究結果表明,羊乳β-Lg灌胃和腹腔注射兩種致敏方式下致敏小鼠后的超敏現(xiàn)象外觀評分均低于牛乳β-Lg致敏水平,且牛、羊灌胃致敏水平均低于腹腔注射致敏水平,與文獻[21]結論中胃液消化后山羊乳β-Lg肽段的減少,可能使致敏性下降的結果吻合,此外,文獻[22]結論中牛乳蛋白致敏破壞了大鼠腸道組織的完整性,增加了對過敏原肽段的吸收的結果也佐證牛乳β-Lg灌胃致敏水平高于羊乳β-Lg灌胃致敏水平; MTT測定小鼠淋巴細胞體外培養(yǎng)液發(fā)現(xiàn),羊乳致敏組小鼠淋巴細胞增殖抑制率為13.8%,牛乳致敏組小鼠淋巴細胞增值抑制率23.5%,羊乳β-Lg對淋巴細胞的抑制率明顯小于牛乳β-Lg,進一步確定了羊乳β-Lg對淋巴細胞的低致敏性.直接ELISA法測得羊乳β-Lg致敏小鼠淋巴細胞后各細胞因子水平均顯著低于牛乳β-Lg致敏水平,其中IL-2、IL-4水平顯著上升,IL-6、 IL-12水平雖顯著上升,但變化較小.本結果將為羊乳成為牛乳替代低致敏乳源提供一定的支撐依據(jù),同時為羊乳致敏性研究打下基礎.