陳 旭,張星平,梁瑞寧,王凱凱,梁政亭,閆德祺,王 慧

(新疆醫(yī)科大學第四臨床醫(yī)學院,新疆 烏魯木齊 830099)

不寐屬現代醫(yī)學“失眠癥”范疇,指盡管在睡眠環(huán)境舒適、睡眠機會充足情況下,仍頻繁入睡困難或睡眠難以維持等導致患者對自身睡眠質量或時間不滿足的一種疾病[1]。相關機制研究顯示,白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平與失眠聯(lián)系密切,失眠患者IL-6、TNF-α水平較健康人明顯升高[2-3]。IL-6水平升高能縮短慢波睡眠時長,影響睡眠質量,導致失眠發(fā)生[4];TNF-α在調節(jié)睡眠-覺醒周期方面具有重要作用,隨著失眠患者睡眠質量的提升,血清TNF-α水平可逐漸恢復至正常[5]。筆者團隊在《內經》“五神臟”理論及歷代名家論著啟發(fā)下,確立不寐五臟病位的“中醫(yī)不寐五神分型診斷法”[6],且發(fā)現以夜寐早寤為主要表現特征的腎不藏志型不寐患者,其多導睡眠圖結構參數呈現出NREM期中N1、N2期較常人延長和REM期縮短的特征性變化[7]。本研究采用D-半乳糖聯(lián)合對氯苯丙氨酸(PCPA)構建腎不藏志不寐大鼠模型,探尋睡眠相關因子IL-6、TNF-α在腎不藏志型不寐大鼠腎、腦、心、肝、脾、肺、大腸、膀胱組織中的表達差異。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 16只SPF級雄性SD大鼠,8周齡,體重(200±20)g,購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心,動物合格證號:SYXK(新)2018-0003。大鼠適應性飼養(yǎng)3 d,自由進食飲水,SPF級飼養(yǎng)環(huán)境:溫度20～26 ℃,相對濕度40%～70%,空氣潔凈度7級,晝夜明暗交替12 h/12 h,最小換氣次數≥15次/h。本動物實驗經新疆醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批后進行(審批編號:IACUC20190116-01)。

1.2主要試劑及儀器 Anti-IL-6 Antibody(AA0624512,博奧森),Anti-TNF-α Antibody(BJ07106495,博奧森),中性樹膠(G8590,Solarbio),免疫組織化學染色兔二步法試劑盒(2241D0401,中杉金橋),DAB試劑盒(218191011,中杉金橋),抗原修復液(C1034,Solarbio),無水乙醇(20210901,天津致遠),二甲苯(20200920,天津致遠)。真空干燥箱(DZF-6090,上海一恒),電熱恒溫水浴鍋(DZKW-S-4,北京永光明),輪轉式石蠟切片機(RM2235,Leica),正置熒光生物顯微鏡(Eclipse Ni-U,Nikon),NIS-Elements D圖像采集軟件(V5.01,Nikon),Image J圖像分析軟件(V1.53,National Institutes of Health)。

1.3分組與造模方法 將16只大鼠隨機分為不寐組與對照組,每組8只。不寐組大鼠制備腎不藏志不寐模型:先予以D-半乳糖120 mg/(kg·d)頸背部皮下注射,1次/d,連續(xù)42 d,然后予以PCPA 300 mg/(kg·d)腹腔注射,1次/d,連續(xù)3 d,共45 d;當大鼠多導睡眠圖NREM期中N1、N2期較正常大鼠延長,REM期較正常大鼠縮短的特征時,表明腎不藏志型不寐模型制備成功。正常組大鼠同期同等飼養(yǎng)環(huán)境下給予等體積0.9%NaCl溶液行相應部位注射。

1.4各臟器組織中IL-6、TNF-α表達免疫組化檢測 使用7%水合氯醛溶液(0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,迅速取肝、心、脾、肺、腎、膀胱、大腸、腦組織,并先后行4%多聚甲醛沖洗固定、石蠟包埋及切片(厚度4 μm)。各組織石蠟切片經65 ℃、120 min烤片后依次行脫蠟、復水、抗原修復、內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育、一抗(IL-6、TNF-α)孵育過夜、酶標山羊抗兔IgG聚合物孵育、DAB顯色、蘇木素復染、鹽酸分化、氨水返藍、脫水、透明及中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察相關臟器組織切片,各個組織均隨機觀察5張切片,每張切片隨機取3個視野,陰性細胞染色為藍色,陽性細胞染色為棕褐色,應用Image J圖像分析軟件V1.53計算平均灰度值。

2 結 果

2.12組大鼠各臟器組織中IL-6表達情況比較不寐組大鼠腎、心、腦、肺、大腸組織中IL-6表達平均灰度值均明顯高于正常組(P均<0.05),2組大鼠肝、脾、膀胱組織中IL-6表達平均灰度值比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖1及表1。

表1 正常組和不寐組大鼠各臟器組織中IL-6表達平均灰度值比較

圖1 正常組和不寐組大鼠各臟器組織中IL-6表達情況(免疫組化染色,×400)

2.22組大鼠各臟器組織中TNF-α表達情況比較 不寐組大鼠腎、腦、肺、大腸組織中TNF-α表達平均灰度值均明顯高于正常組(P均<0.05),2組大鼠肝、心、脾、膀胱組織中TNF-α表達平均灰度值比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖2及表2。

表2 正常組和不寐組大鼠各臟器組織中TNF-α表達平均灰度值比較

圖2 正常組和不寐組大鼠各臟器組織中TNF-α表達情況(免疫組化染色,×400)

3 討 論

不寐是一種睡眠難以啟動或難以維持并伴有日間功能障礙的疾病,中國人群患病率約為15%,中老年患者占比約為35.9%[8-9]。長期不寐會增加罹患精神心理疾病概率,且嚴重影響患者認知力,是輕度認知功能障礙及癡呆發(fā)生的獨立危險因素[10-11]。課題組前期提出的“中醫(yī)不寐五神分型診斷法”[6]將不寐病分為5種,包括以夢繞紛紜為主訴的肝不藏魂型、以入寐維艱為主訴的心不藏神型、以睡前思慮紛紜為主訴的脾不藏意型、以睡眠輕淺易寤或頻寤為主訴的肺不藏魄型、以夜寐早寤為主訴的腎不藏志型。以上5種類型的不寐患者其睡眠多導圖結構參數間存在差異,且中醫(yī)不寐五神分型與四診辨證分型在五臟定位上具有一致性[12],表明中醫(yī)不寐五神分型診斷法具有科學性及客觀性。課題組研究認為腎不藏志型不寐的臨床單一主癥是夜寐早寤,其核心病機為腎志不入于舍,常見病因為腎臟虛損[13]?！峨y經》曰:“老人血氣衰……故晝日不能精,夜不得寐,故知老人不得寐也?！瘪T兆張于《馮氏錦囊秘錄》又言:“壯年腎陰強盛,則睡沉熟而長;老年陰氣衰弱,則睡輕而短?！币陨暇砻骼先耸咭阅I虛志不入舍多見,這與不寐患者以中老年多見的流行病學特征[10]相吻合。

失眠的發(fā)生與IL-6、TNF-α等多種睡眠相關因子密切相關,TNF-α對睡眠有雙向調節(jié)作用,低水平TNF-α可促進睡眠,若表達過高則導致失眠[5]。蘇浩[14]研究發(fā)現,脂多糖能誘導失眠大鼠TLR4下游MyD88、NF-κB表達,啟動腸道局部炎癥反應,增加IL-6與TNF-α表達。Su等[15]研究報道,睡眠剝奪模型大鼠腦組織中IL-6、TNF-α水平較正常大鼠顯著增高。本研究中發(fā)現腎不藏志型不寐大鼠大腸及腦組織中IL-6、TNF-α水平均較正常組升高,這與前人結論相一致。HPA軸是調控機體應激反應的重要神經內分泌系統(tǒng),HPA軸功能亢進是引起失眠的重要因素[16],對大鼠進行睡眠剝奪后,其體內IL-6、TNF-α水平升高并激活HPA軸,給予相應藥物干預后,IL-6、TNF-α水平降低,睡眠狀況得以改善[17],這表明通過調控IL-6、TNF-α水平能抑制亢進的HPA軸功能,從而調節(jié)睡眠-覺醒周期,亦說明IL-6、TNF-α與失眠關系密切。長期慢性失眠是心血管事件發(fā)生的獨立危險因素,也是亞臨床心臟疾病的標志,失眠可導致機體神經內分泌功能紊亂、交感神經興奮,刺激炎癥基因表達,誘導IL-6的合成與釋放,炎癥反應可損傷血管內皮細胞,促進心血管疾病發(fā)生發(fā)展[18]。本研究中,腎不藏志型不寐大鼠心臟組織中IL-6表達水平較正常大鼠明顯升高,這亦驗證了前述研究。本實驗研究還發(fā)現,腎不藏志型不寐大鼠肺、腎組織中IL-6、TNF-α表達水平均較正常大鼠升高,而肝、脾、膀胱組織中IL-6、TNF-α表達水平與正常大鼠比較未見明顯差異,其具體機制有待于后續(xù)深入研究。

綜上所述,腎不藏志型不寐大鼠腎、腦、肺、大腸組織中IL-6、TNF-α表達水平和心組織中IL-6表達水平均較正常大鼠升高,IL-6、TNF-α的特征性變化可能是腎不藏志型不寐的特征性變化之一。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。