孔文文,巴元明

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430070;2.湖北省中醫(yī)院腎病科,湖北 武漢 430060)

慢性腎臟病已成為全球性公共健康問題,其發(fā)病率和病死率均較高,且大多難以根治,臨床治療以控制并發(fā)癥和延緩疾病進展為宗旨[1]。研究[2-3]發(fā)現(xiàn),部分慢性腎臟病患者進入透析前已出現(xiàn)不同程度的認知功能障礙。目前,慢性腎臟病發(fā)生認知功能障礙的機制尚未闡明,臨床治療藥物也處于探索階段。中醫(yī)相關(guān)研究[4]認為,慢性腎臟病病程漫長,氣血運轉(zhuǎn)異常形成痰濕、血瘀、濁毒等,從而引起腦損傷、神經(jīng)侵犯、認知功能障礙等病理產(chǎn)物。加味大黃附子湯由《金匱要略》中記載的大黃附子湯演變而來,具有健脾溫腎、通腑泄?jié)嶂?臨床用于慢性腎臟病可有效改善患者腎功能[5-6]。Gu等[7]研究顯示,慢性腎臟病-認知障礙模型中,加味大黃附子湯可改善小鼠認知功能,可能與抑制AhR/NF-κB/JNK信號通路有關(guān)。相關(guān)研究[8]表明,Wnt/β-環(huán)形蛋白(β-catenin)信號通路與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病關(guān)系密切。加味大黃附子湯改善慢性腎臟病-認知障礙的作用機制仍有待深入分析。本研究擬從Wnt/β-catenin信號通路角度,分析加味大黃附子湯對慢性腎臟病小鼠的認知功能的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

65只雄性C57BL/6小鼠,SPF級別,體質(zhì)量18～22 g,8～12周齡,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,實驗生產(chǎn)動物合格證號:SCXK(京)2020-0006。小鼠均分籠飼養(yǎng),動物房內(nèi)設(shè)置溫度23～25℃,相對適度40%～60%,自由攝食飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進入后續(xù)實驗。

1.2 藥物與主要試劑

加味大黃附子湯:附子10 g,大黃30 g,牡蠣40 g,苦參、蒲公英、山參各30 g,準(zhǔn)確稱取各味藥,水浸泡30 min,大火煮開,再小火煎煮30 min,過濾收集濾液170 mL(生藥濃度為1 g/mL),調(diào)節(jié)pH至7.0,過濾除菌后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹7]。0.2%腺嘌呤飼料及普通飼料(南通特洛菲飼料科技公司),Wnt/β-catenin信號通路抑制劑(IWR-I,美國MCE公司),蘇木精-伊紅染液(北京索萊寶科技公司),肌酐、尿素氮、乙酰膽堿酯酶(AChE)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所),Wnt3a、β-catenin、β-肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Abcam)。

1.3 動物分組及模型構(gòu)建

65只小鼠隨機選取10只作對照組(普通飼料喂養(yǎng)),剩余55只采用0.2%腺嘌呤飼料喂養(yǎng)5周建立慢性腎臟病模型,隨機取2只小鼠處死,取出腎組織,可觀察到腎臟體積縮小、色澤蒼白、表面有顆粒物,可見腎小球萎縮、間質(zhì)纖維化等典型病理學(xué)改變,即可判定建模成功,剩余建模成功小鼠隨機分為模型組、加味大黃附子湯低、中、高劑量組、加味大黃附子湯高劑量+Wnt/β-環(huán)形蛋白(β-catenin)信號通路抑制劑(IWR-I)組,每組各10只。造模36 d,所有組小鼠均給予普通飼料,加味大黃附子湯低、中、高劑量組分別灌胃8、16、24 g/kg加味大黃附子湯[7],加味大黃附子湯+IWR-I組灌胃24 g/kg加味大黃附子湯+腹腔注射5 mg/kg IWR-I,對照組和模型組予以同劑量生理鹽水。見圖1。

1.4 Morris水迷宮試驗

給藥結(jié)束后,采用Morris水迷宮實驗系統(tǒng)(上海吉量軟件科技公司)評估小鼠認知功能,包括定位航行實驗(第1～5天)和空間探索實驗(第6天),定位航行實驗:直徑120 mm的圓柱體內(nèi)倒入22 ℃無毒白色顏料,水池順時針分為4個象限,將平臺放置于第二象限中央位置,池水沒過臺面,將小鼠面朝池壁方向任一象限放入,記錄小鼠自下水至找到平臺所需時間,即為逃避潛伏期,若60 s內(nèi)仍未找到平臺,則逃避潛伏期記錄為60 s,連續(xù)訓(xùn)練5 d。空間探索實驗:第6天撤去平臺,將小鼠面朝池壁方向任一象限放入,記錄小鼠60 d內(nèi)穿越原平臺處的次數(shù)。

1.5 血清肌酐、尿素氮、乙酰膽堿酯酶(AChE)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)水平檢測

完成Morris水迷宮試驗后,夜間禁食,次日眼眶取血,3 000 r/m離心10 min,分離血清,于-20 ℃冰箱保存待測。參照試劑盒說明書操作,檢測血清肌酐、尿素氮、AChE和ChAT水平。

1.6 HE染色

眼眶取血后以頸椎脫臼法處死小鼠,快速取出腎臟和腦組織,腎臟組織和部分腦組織浸于4%多聚甲醛溶液中固定過夜,制備厚度為4 μm石蠟組織切片,行常規(guī)HE染色,光鏡下進行病理學(xué)觀察,剩余腦組織置于液氮凍存待測。

1.7 Western blot法檢測腦組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達

取出凍存腦組織,RIPA裂解液勻漿,12 000 r/m離心10 min,提取總蛋白,測定蛋白濃度后,各組取等量(30～50 μg)蛋白進行10% SDS-PAGE凝膠電泳,再將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉2 h,分別浸于稀釋比1∶1 000的Wnt3a、β-catenin、β-actin抗體,4 ℃下孵育過夜,次日浸于稀釋比1∶8 000的蛋白二抗,室溫下孵育1 h,最后滴加ECL發(fā)光試劑,用X光膠片暗盒(北京吉田生物科技公司)曝光、顯影,應(yīng)用Image J v1.8.0軟件測定目標(biāo)條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 加味大黃附子湯對慢性腎臟病小鼠認知功能的影響

與對照組比較,模型組小鼠第2～5天逃避潛伏期升高,穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05);與模型組比較,中、高劑量組第3～5天逃避潛伏期降低,穿越平臺次數(shù)增加(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+IWR-I組第2～5天逃避潛伏期升高,穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)。見表1。

表1 加味大黃附子湯對慢性腎臟病小鼠認知功能的影響

2.2 加味大黃附子湯對慢性腎臟病小鼠血清肌酐和尿素氮水平的影響

與對照組比較,模型組小鼠血清肌酐和尿素氮水平升高(P<0.05);與模型組比較,中、高劑量組肌酐和尿素氮水平均降低(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+IWR-I組肌酐和尿素氮水平均升高(P<0.05)。見表2。

表2 加味大黃附子湯對慢性腎臟病小鼠血清肌酐和尿素氮水平的影響

2.3 加味大黃附子湯對慢性腎臟病小鼠血清AChE和ChAT水平的影響

與對照組比較,模型組小鼠血清AChE水平升高,ChAT水平降低(P<0.05);與模型組比較,中、高劑量組AChE水平均降低,ChAT水平均升高(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+IWR-I組AChE水平升高,ChAT水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 加味大黃附子湯對慢性腎臟病小鼠血清AChE和ChAT水平的影響

2.4 加味大黃附子湯對慢性腎臟病小鼠腎臟及腦組織病理學(xué)形態(tài)的影響

與對照組比較,模型組小鼠腎組織出現(xiàn)明顯的腎小球結(jié)構(gòu)紊亂,腎小管管腔增大,間質(zhì)纖維化、炎性細胞浸潤顯著,腦組織海馬CA1區(qū)細胞排列不規(guī)則且稀疏,細胞層次減少;與模型組比較,中、高劑量組上述病理損傷有所減輕;與高劑量組比較,高劑量+IWR-I組病理損傷加重。見圖1。

2.5 加味大黃附子湯對慢性腎臟病小鼠Wnt/β-catenin信號通路表達的影響

與對照組比較,模型組小鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平降低(P<0.05);與模型組比較,中、高劑量組Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平升高(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+IWR-I組Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖2及表4。

表4 加味大黃附子湯對慢性腎臟病小鼠Wnt/β-catenin信號通路表達的影響

3 討論

近年來,中醫(yī)藥防治慢性腎臟病及認知功能障礙方面的研究已成為熱點。中醫(yī)并沒有認知功能障礙這一病名,可歸為“呆病”“腦病”“髓消”等范疇,其發(fā)病與腎精不足、濁瘀阻竅有關(guān);而慢性腎臟病在中醫(yī)中屬于“虛勞”“水腫”等病,病機為脾腎虛虧、濕停瘀阻;可見慢性腎臟病與認知功能障礙的病機均與腎精關(guān)系密切[9-10]。加味大黃附子湯方中附子可回陽救逆、補火助陽,大黃性寒,具有清熱瀉火、鞏逐積滯、祛瘀活血之效,牡蠣可凈化瘀血、收斂解毒,苦參、蒲公英具有清熱解毒、燥濕利尿的功效,山參大補元氣、生津安神,諸藥合用攻補兼施,切中病機[11-12]。

目前,慢性腎臟病動物模型的制備方法較多,均存在一定的局限性,其中手術(shù)操作稍復(fù)雜,容易出現(xiàn)術(shù)后感染、死亡;尾靜脈注射阿霉素,破壞腎小球結(jié)構(gòu),引起腎功能進行惡化,但與中醫(yī)病因病機學(xué)說不符[13-14]。本研究采用0.2%腺嘌呤飼料誘導(dǎo)慢性腎臟病動物模型,腺嘌呤進入動物體內(nèi)后,其代謝產(chǎn)物達到腎臟造成腎損傷,造成腎功能減退,更符合人類慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展過程。結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠腎組織腎小球結(jié)構(gòu)紊亂,腎功能指標(biāo)升高,同時伴有認知功能減弱,腦組織海馬CA1區(qū)細胞排列不規(guī)則且稀疏,細胞層次減少,膽堿能神經(jīng)功能減弱。加味大黃附子湯在改善模型小鼠腎功能和認知功能方面發(fā)揮了良好效果,與既往研究[7]結(jié)果相符。

Wnt信號廣泛存在于各生物體,與多種疾病發(fā)病相關(guān),其中Wnt/β-catenin信號通路是Wnt信號中的經(jīng)典通路,通路激活時,Wnt蛋白被分泌至細胞外,與細胞膜上的跨膜受體結(jié)合引起Wnt/β-catenin通路的活化,β-catenin進入細胞核影響下游基因表達[15-16]。大量研究[17-18]表明,Wnt/β-catenin信號通路在認知功能障礙中發(fā)揮至關(guān)重要的作用:Mohamed等[17]報道,調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路活性,可改善慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的認知缺陷。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn),激活Wnt/β-catenin信號通路可緩解淀粉樣蛋白β引起的血腦屏障功能障礙,可能是治療阿爾茨海默癥的潛在靶向通路。本研究顯示,慢性腎臟病小鼠腦組織Wnt/β-catenin信號通路處于“沉默”狀態(tài),加味大黃附子湯可激活Wnt/β-catenin信號通路,改善中樞膽堿能系統(tǒng)反應(yīng),提升小鼠認知水平,而且添加Wnt/β-catenin信號通路抑制劑IWR-I后可逆轉(zhuǎn)加味大黃附子湯效果,反向驗證Wnt/β-catenin信號通路是加味大黃附子湯改善慢性腎臟病小鼠認知功能的作用機制。

綜上,加味大黃附子湯可改善慢性腎臟病小鼠認知功能,其作用可能與激活Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。本研究的濃度范圍內(nèi),16、24 g/kg加味大黃附子湯指標(biāo)改善效果更佳,后期研究將從拆方及組分方面深入分析加味大黃附子湯與慢性腎臟病認知功能障礙的關(guān)系。