吳靜 聶祖瓊 尹琬凌

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院老年病科（武漢 430000）

近年來，我國人民的飲食結(jié)構(gòu)隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高而發(fā)生變化，導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生率也逐年升高，已成為中老年人生命安全的重大威脅。而缺血性心臟病在心血管疾病中是病死率較高的疾病之一［1］。心肌缺血主要是由于冠狀動(dòng)脈阻塞或狹窄引起供血不足導(dǎo)致心臟血流量減少、供氧不足，從而出現(xiàn)心肌損傷，嚴(yán)重時(shí)危及患者生命。治療缺血性心臟病的主要措施是恢復(fù)心臟的供血，臨床上主要采用藥物治療、冠狀動(dòng)脈介入治療和旁路移植等方法［2-3］。但是再灌注會(huì)導(dǎo)致一系列不良后果，這一過程稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）［4］。心肌細(xì)胞內(nèi)含大量線粒體以供其能量需求［5］。在心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）時(shí)會(huì)導(dǎo)致線粒體受損以致最終細(xì)胞死亡［6］。線粒體分裂蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）是線粒體重要的分裂蛋白，其缺失可能導(dǎo)致線粒體功能障礙，并增加MIRI 的易感性［7］。在正常生理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞內(nèi)富含miR-499，當(dāng)心肌缺血時(shí)miR-499含量顯著降低［8］。因此，本研究通過建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，使用miR-499 mimics 及Drp1 抑制劑P110 處理，探究miR-499 在MIRI 中的作用，并從線粒體自噬方面探究其可能機(jī)制，為其在治療MIRI 方面提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 H9c2（2-1）細(xì)胞來源中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM（Hyclone公司）；胎牛血清、Opti-MEM（Gibco 公司）；PBS、0.25%胰蛋白酶、CCK8、10 mmol/L dNTP Mix、RIPA（強(qiáng)）組織細(xì)胞快速裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（solarbio）；Lipofectamine?RNAiMAX（Invitrogen 公司）；P110（Selleck）；活性氧（ROS）檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（beyotime）；AnnexinV-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（BD）；總超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、ATP 含量測試盒（南京建成）；Trizol（ambion）；SYBR FAST qPCR Master Mix（KAPA Biosystems）；Oligo （dT）18 Primer、PrimeScript ⅡRTase、Recombinant Rnase Inhibitor（TAKARA）；兔抗Fis1、Mfn1、DNM1L（Drp1）、Parkin、LC3-Ⅱ、p62、GAPDH 抗體、羊抗兔IgG 抗體（bioswamp）。DMIL LED 倒置熒光顯微鏡、S6E 切片機(jī)（Leica 公司）；AMR-100 酶標(biāo)儀、Icen-24R 高速冷凍離心機(jī)、超微量分光光度計(jì)（杭州奧盛）；NovoCyte 流式細(xì)胞儀（艾森）；GE48527PCR 儀（杭州柏恒）；CFX-Connect 96熒光定量PCR儀（Bio-Rad）；Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能）；HT7700透射電鏡（日立）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將細(xì)胞分為（1）對(duì)照組（BC）：不做處理；（2）I/R 組（I/R）：放置于3.3 mmol/L H2O2培養(yǎng)10 min，然后在DMEM 培養(yǎng)基中恢復(fù)30 min；（3）I/R + miR-499 mimics 組（I/R + mi）：miR-499 mimics轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)過10 min缺氧和30 min 復(fù)氧處理；（4）I/R + miR-499 NC 組（I/R +NC）：miR-499 NC 轉(zhuǎn)染H9C2 細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)過10 min缺氧和30 min 復(fù)氧處理；（5）I/R + miR-499 mimics+ P110 組（I/R + mi + P110）：miR-499 mimics 轉(zhuǎn)染后1 μmol/L P110［9］處理H9C2 心肌細(xì)胞3 h 并進(jìn)行10 min 缺氧和30 min 復(fù)氧處理；（6）I/R + miR-499 NC + P110 組（I/R + NC + P110）：miR-499 NC 轉(zhuǎn)染后1 μmol/L P110 處理H9C2 心肌細(xì)胞3 h 并進(jìn)行10 min 缺氧和30 min 復(fù)氧處理。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h 接種于6 孔板，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度為70%。轉(zhuǎn)染步驟如下：（1）在250 μL Opti-MEM中加入100 pmol miRNA，吹吸混勻；（2）在250 μL Opti-MEM中加入5 μL Lipofectamine?RNAiMAX，吹吸混勻，室溫下靜置5 min；（3）將（1）、（2）步驟液體混合、吹吸混勻，室溫孵育20 min；（4）將（3）中液體加入換有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)板細(xì)胞中，輕輕搖晃培養(yǎng)板；（5）將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，轉(zhuǎn)染4 h 后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；（6）檢測轉(zhuǎn)入基因表達(dá)水平。

1.2.3 CCK8 檢測細(xì)胞增殖抑制率 將細(xì)胞于96孔中培養(yǎng)過夜，按1.2.1中分組處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)30 min 后，每孔加入10 μL CCK8 溶液培養(yǎng)4 h后在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm 處測量各孔吸光值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS、線粒體膜電位和細(xì)胞凋亡 按照ROS、線粒體膜電位和AnnexinVFITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書處理后，在流式細(xì)胞儀上檢測。ROS 和線粒體膜電位使用NovoCyte分析軟件進(jìn)行分析，細(xì)胞凋亡使用NovoExpress 分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 生化檢測 按照SOD、MDA 和ATP 測試盒說明書進(jìn)行處理后，分別于450、532和636 nm處檢測吸光度。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測基因表達(dá)水平 Trizol 法提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA。采用qRT-PCR 檢測miR-499、Fis1、Mfn1、Drp1、Parkin、LC3-Ⅱ、p62 基因表達(dá)水平，miR-499 以U6 作為內(nèi)參，其余以GAPDH 作內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.7 Western blot 法檢測蛋白表達(dá)水平 使用RIPA（強(qiáng)）組織細(xì)胞快速裂解液獲得細(xì)胞蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。經(jīng)SDSPAGE 膠的制備、上樣及電泳、轉(zhuǎn)膜、膜的封閉及抗體孵育后將膜置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測，通過TANON GIS 軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.2.8 透射電鏡觀察線粒體自噬 將樣本經(jīng)固定、浸透和包埋、超薄切片、染色后于透射電鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)中的生物學(xué)重復(fù)均為3（n= 3），數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和DUNCAN 多重比較，P＜ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-499 轉(zhuǎn)染效率 相比對(duì)照組/miR-499 mimics NC 組，miR-499 mimics 組中miR-499 的mRNA 表達(dá)水平顯著增加，見圖1。表示miR-499 mimics 細(xì)胞H/R 模型構(gòu)建成功。

圖1 miR-499 mimics 轉(zhuǎn)染效率Fig.1 Transfection efficiency of miR-499 mimics

2.2 miR-499 mimics 對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 相對(duì)I/R 和I/R + NC組，I/R + mi 和I/R + NC + P110 組的細(xì)胞增殖抑制率均顯著下降（P＜ 0.05）；相對(duì)I/R + mi 和I/R +NC + P110 組，I/R + mi + P110 組的細(xì)胞增殖抑制率顯著下降（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 miR-499 mimics 處理后的細(xì)胞增殖抑制率Fig.2 The cell inhibiting rate after miR-499 mimics treatment

2.3 miR-499 mimics 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率的影響 相比BC 組，I/R 與I/R + NC 組的細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜ 0.05）；相比I/R 與I/R + NC 組，I/R + mi 和I/R + NC + P110 組的細(xì)胞凋亡率顯著下降（P＜ 0.05）；相比I/R + mi 和I/R + NC + P110 組，I/R + mi + P110組的細(xì)胞凋亡率顯著下降（P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 miR-499 mimics 處理后的細(xì)胞凋亡率Fig.3 The apoptosis rate after miR-499 mimics treatment

2.4 miR-499 mimics 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 相比BC 組，I/R 與I/R + NC 組細(xì)胞中的ROS 和MDA 含量顯著上升（P＜ 0.05），SOD 含量顯著下降（P＜ 0.05）；相比I/R 與I/R + NC 組，I/R +mi和I/R + NC + P110組細(xì)胞中的ROS和MDA含量顯著下降（P＜ 0.05），SOD含量顯著上升（P＜ 0.05）；相比I/R + mi和I/R + NC + P110組，I/R + mi + P110組ROS 和MDA 含量顯著下降（P＜ 0.05），SOD 含量顯著上升（P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 miR-499 mimics 處理后細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)因子指標(biāo)的變化情況Fig.4 Changes in cell oxidative stress-related factors after miR-499 mimics treatment

2.5 miR-499 mimics 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響 相比BC 組，I/R 與I/R + NC 組細(xì)胞的線粒體膜電位顯著上升（P＜ 0.05）；相比I/R與I/R + NC組，I/R + mi和I/R + NC + P110組細(xì)胞的線粒體膜電位顯著下降（P＜ 0.05）；相比I/R + mi和I/R + NC + P110 組，I/R + mi + P110 組細(xì)胞的線粒體膜電位顯著下降（P＜ 0.05）。見圖5。

圖5 miR-499 mimics 處理后細(xì)胞的線粒體膜電位Fig.5 Mitochondrial membrane potential in cells treated with miR-499 mimics

2.6 miR-499 mimics 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體自噬的影響 相比BC 組，I/R 與I/R + NC 組細(xì)胞的線粒體自噬增加；相比I/R與I/R + NC組，I/R + mi和I/R + NC + P110組細(xì)胞的線粒體自噬減少；相比I/R + mi和I/R + NC + P110組，I/R + mi + P110 組細(xì)胞的線粒體自噬減少。見圖6。

圖6 miR-499 mimics 處理后細(xì)胞的線粒體自噬Fig.6 Mitochondrial autophagy in cells treated with miR-499 mimics

2.7 miR-499 mimics 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中ATP 含量的影響 相比BC 組，I/R 與I/R + NC組細(xì)胞中線粒體含量顯著下降（P＜ 0.05）；相比I/R 與I/R + NC組，I/R + mi和I/R + NC + P110組細(xì)胞中線粒體含量顯著上升（P＜ 0.05）；相比I/R + mi和I/R +NC + P110 組，I/R + mi + P110 組細(xì)胞中線粒體含量顯著上升（P＜ 0.05）。見圖7。

圖7 miR-499 mimics 處理后細(xì)胞中ATP 含量變化Fig.7 Changes in ATP content in cells treated with miR-499 mimics

2.8 miR-499 mimics 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中線粒體分裂、融合、自噬相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平的影響 相比BC 組，I/R 與I/R + NC 組細(xì)胞中Fis、Parkin、LC3-Ⅱ和Drp1 的基因和蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05），Mfn1 和p63 的基因和蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）；相比I/R 與I/R + NC 組，I/R + mi 和I/R + NC + P110 組細(xì)胞中Fis、Parkin、LC3-Ⅱ和Drp1 的基因和蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜ 0.05），Mfn1 和p63 的基因和蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜ 0.05）；相比I/R + mi 和I/R + NC + P110組，細(xì)胞中Fis、Parkin、LC3-Ⅱ和Drp1 的基因和蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜ 0.05），Mfn1 和p63 的基因和蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜ 0.05）。見圖8。

圖8 miR-499 mimics 處理后細(xì)胞中線粒體分裂、融合、自噬相關(guān)基因mRNA 和蛋白表達(dá)水平Fig 8 The mRNA and protein expression levels of mitochondrial division，fusion，and autophagy-related genes in cells treated with miR-499 mimics

3 討論

miRNA 是一類小分子RNA，廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，在心臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［10］。研究發(fā)現(xiàn)［8］，miR-499 在心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)，與心肌細(xì)胞的分化密切相關(guān)，且可以抑制心肌細(xì)胞的凋亡［11］。本研究中miR-499 mimics 和（或）Drp1 抑制劑P110 處理I/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率都顯著下降，表示miR-499 對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

機(jī)體內(nèi)許多生理過程都參與MIRI，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、細(xì)胞凋亡、自噬、ATP 能量代謝障礙、鈣超載、氧自由基爆發(fā)等［12］。其中，自噬發(fā)揮著重要作用，其依賴溶酶體將細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器降解以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［13］。在I/R發(fā)生時(shí)，突發(fā)的供血供氧會(huì)導(dǎo)致線粒體中發(fā)生大量活性氧的生成、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等，導(dǎo)致線粒體的受損，從而引起心肌細(xì)胞能量供應(yīng)障礙、促凋亡因子的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［6］。因此，及時(shí)清除受損線粒體，維持細(xì)胞的正常功能，對(duì)治療MIRI 十分重要。線粒體自噬是一種特殊的自噬，能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)損傷的線粒體降解清除，對(duì)維持心肌細(xì)胞穩(wěn)定具有重要意義［14］。當(dāng)心肌缺血時(shí)，線粒體自噬被激活，清除細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體，減少氧化應(yīng)激的發(fā)生以保護(hù)心肌細(xì)胞；當(dāng)再灌注時(shí)，線粒體自噬被過度激活，正常的線粒體被清除，導(dǎo)致心肌功能損傷加重［15］。因此，在MIRI 中調(diào)控線粒體自噬成為了治療缺血性心臟病中的重要策略之一。在線粒體動(dòng)力學(xué)中，由一組GTP 酶來調(diào)節(jié)線粒體的融合和分裂，線粒體融合蛋白Mfn1 在線粒體外膜的融合過程中發(fā)揮重要作用［16］。線粒體的分裂是將膜電位受損的子線粒體從健康的線粒體中分裂出來。正常膜電位的子線粒體可以與其他線粒體融合，膜電位降低的子線粒體不能與其他線粒體融合，而是被溶酶體吞噬降解［17］，從而形成線粒體自噬。Drp1是GTP 酶超家族蛋白成員之一，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。Drp1 從細(xì)胞質(zhì)向線粒體募集的過程是線粒體分裂的重要步驟［18］，這個(gè)過程由幾個(gè)線粒體膜蛋白介導(dǎo)，其中包括Fis1［19］。線粒體自噬可依賴泛素途徑與LC3 結(jié)合介導(dǎo)，由假定激酶PINK1 和Parkin 調(diào)控［20］。p62 是LC3 的適配器蛋白［21］。本研究中，miR-499 mimics 和（或）P110 處理I/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞后，細(xì)胞中ATP 含量上升，線粒體膜電位下降，自噬發(fā)生減少，且Fis1、Parkin、LC3-Ⅱ、Drp1 基因的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均下降，而Mfn1 和p62 基因的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均上升，表明miR-499 可以使細(xì)胞中線粒體膜電位去極化，線粒體融合上升，線粒體自噬下降，且與Drp1有密切關(guān)系。

細(xì)胞自噬與氧化應(yīng)激存在相互作用［22］。MIRI時(shí)心肌細(xì)胞中的線粒體發(fā)生功能障礙，產(chǎn)生過量自由基，激活氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量MDA、ROS。機(jī)體存在許多防御過程對(duì)抗氧化應(yīng)激，包括GSHPx、CAT 及SOD 等［23］。本研究中，miR-499 mimics和（或）P110 處理I/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞后，細(xì)胞中ROS、MDA 含量下降，SOD 含量上升，表明miR-499可以降低I/R 誘導(dǎo)導(dǎo)致的心肌細(xì)胞中氧化應(yīng)激的升高。

綜上所述，miR-499 可使I/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖抑制率降低、凋亡率降低，且通過Drp1 介導(dǎo)降低細(xì)胞線粒體自噬、減少氧化應(yīng)激從而保護(hù)細(xì)胞。本研究完善了miR-499 減輕MIRI 的機(jī)制研究，為靶向治療MIRI 提供了新思路。

【Author contributions】WU Jing designed the study，performed the experiments and wrote the article.NIE Zuqiong performed the experiments YIN Wanling revised the article and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.