孫曉彤 韓崇旭， 王嬋 任傳利 張明明

1揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院（江蘇揚(yáng)州 225009）；2揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇省蘇北人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科（江蘇揚(yáng)州 225009）；3東南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院發(fā)育基因與人類(lèi)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南京 210096）

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是由先天和后天免疫同時(shí)介導(dǎo)，并由單核細(xì)胞浸潤(rùn)膽管細(xì)胞，破壞小葉間膽管，導(dǎo)致膽汁淤積，使膽管細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于膽汁淤積環(huán)境，從而致膽管細(xì)胞變性和壞死的疾?。?-3］。PBC 在男女之間的患病率具有差異性，患者多為中老年婦女，男女比例為10∶1［4］。PBC 目前尚無(wú)最優(yōu)的治療方法。目前治療PBC 的藥物首選是熊去氧膽酸，若熊去氧膽酸治療效果甚微，就可用二線藥物奧貝膽酸進(jìn)行治療［5-6］，但無(wú)治愈作用。若患者合并其他疾病，無(wú)法選擇肝移植手術(shù)，還可進(jìn)行人工肝支持系統(tǒng)和血漿置換治療［7］。因此研究其發(fā)病機(jī)制尋找新的治療方法具有重要的社會(huì)意義。

PBC 是起源于膽管的炎癥。由于膽汁分泌及排泄障礙可導(dǎo)致膽汁淤積，而肝臟長(zhǎng)期處于膽汁淤積狀態(tài)可導(dǎo)致肝臟的纖維化和肝硬化。膽汁酸（bile acids，BAs）是膽汁的主要成分，對(duì)膽管細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用。在膽汁淤積狀態(tài)下，膽管細(xì)胞長(zhǎng)期暴露在具有細(xì)胞毒性的膽汁酸中，血清膽汁酸水平繼而升高。疏水性膽汁酸甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDC）是膽汁淤積性肝病患者血清中主要的膽汁酸，因此大多數(shù)研究都采用GCDC 來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作為研究模型。

TMEM39A 是TMEM 家族中的一員，其蛋白序列由488 個(gè)氨基酸和8 個(gè)跨膜螺旋片段組成［8］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TMEM39A 的分子功能與自噬相關(guān)［9］，遺傳學(xué)研究［10］表明，TMEM39A 基因與原發(fā)性膽汁性膽管炎相關(guān)。又有研究進(jìn)一步對(duì)PBC 患者和其他自身免疫性疾病分析發(fā)現(xiàn)，TMEM39A 在PBC 患者的血液中高表達(dá)，并顯著高于其他自身免疫性疾?。ㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡和橋本氏病）和健康對(duì)照組體內(nèi)表達(dá)，并且TMEM39A 濃度越高，其肝功能越差，預(yù)后越差。且已有研究［11］報(bào)道稱(chēng)，在早期和晚期PBC 受損的膽管中自噬相關(guān)蛋白即微管相關(guān)蛋白3β（LC3）的表達(dá)增高。這表明TMEM39A 水平異常在PBC 發(fā)病機(jī)制中扮演著重要作用。本研究擬模擬PBC 膽管細(xì)胞模型，對(duì)TMEM39A 在PBC 中的作用機(jī)制做初步探索，旨在為PBC 的靶向治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系培養(yǎng) 人肝膽管癌細(xì)胞（RBE），由東南大學(xué)劉向東教授饋贈(zèng)，細(xì)胞用10%FBS RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，放在5%CO2、37 ℃及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自北京全式金生物，BCA 蛋白定量試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，Hoechst 染色試劑盒、結(jié)晶紫染色液購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司，兔抗人TMEM39A 多克隆抗體購(gòu)自Abnova 公司，兔抗人LC3 多克隆抗體購(gòu)自Proteintech 公司，GCDC、4%多聚甲醛購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司，RNA 轉(zhuǎn)染試劑RNA Fit 購(gòu)自漢恒生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞活力檢測(cè) 使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞活力。將RBE細(xì)胞以每孔2 × 103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中。設(shè)置control 組、GCDC（500 μmol/L 和1 000 μmol/L）組，三組處理同時(shí)培養(yǎng)24、48、72 h 和96 h。培養(yǎng)至第6 天，將新的培養(yǎng)基（不含GCDC）90 μL 和10 μL CCK-8 加入到孔中，在培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀（Biotek）在450 nm 處讀吸光值。

1.3.2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 使用結(jié)晶紫染色液染色觀察細(xì)胞克隆形成。將RBE細(xì)胞以每孔1 000個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，設(shè)置PBS 組和GCDC 組，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，每三天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 d。使用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色液染色觀察。

1.3.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 提前在6 孔板背面劃線，將RBE 細(xì)胞以每孔2 × 106個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，設(shè)置PBS 組和GCDC 組，培養(yǎng)24 h 后，加入含有PBS 和不同濃度的GCDC 的培養(yǎng)基，用細(xì)胞微孔成像系統(tǒng)（Biotek）拍照，計(jì)為0 h，24 h 后再拍照，計(jì)為24 h。比較0、24 h 劃痕愈合程度。

1.3.4 Hoechst 染色實(shí)驗(yàn) 使用Hoechst 染色觀察RBE 細(xì)胞凋亡。RBE 細(xì)胞以1 × 105個(gè)細(xì)胞/孔接種于12 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，加入含有PBS 和不同濃度的GCDC 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，使用Hoechst 染色，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡。

1.3.5 構(gòu)建TMEM39A 過(guò)表達(dá)載體 通過(guò)設(shè)計(jì)合成的TMEM39A 引物，上游引物（TCAGATCTCGAGCTCAAGCTTATGCCCGGTGGAAGGAGG），下游引物（TTATCTAGATCCGGTGGATCCGTTTGCCTTGAGTTCATAACTGTTG）擴(kuò)增TMEM39A 基因。將質(zhì)粒pEGFP-C1 和TMEM39A 經(jīng)過(guò)雙酶切、同源重組、轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌，在含有Kan 抗性的LB 固體平板上挑取單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)12 ～ 16 h，提取重組pEGFPC1-TMEM39A 質(zhì)粒，并經(jīng)雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒。

1.3.6 合成siRNA 及陰性對(duì)照 將TMEM39A 基因（Gene ID： 55254）提交至漢恒生物公司，由其設(shè)計(jì)和合成3 對(duì)siRNA，同時(shí)合成了一對(duì)通用陰性對(duì)照（Negative Control siRNA，si-NC），將siRNA 轉(zhuǎn)染到RBE 細(xì)胞48 h。

1.3.7 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 重組pEGFP-C1-TMEM-39A質(zhì)粒和si-TMEM39A及si-NC轉(zhuǎn)染進(jìn)原發(fā)性膽汁性膽管炎的模型（用1 000 μmol/L GCDC 處理24 h的RBE 細(xì)胞）中48 h 后，用1 × PBS 洗滌1 ～ 2 次，每孔加入50 μL 的細(xì)胞裂解液，置于冰上20 min，每隔5 min渦旋10 s，低溫離心機(jī)離心12 000 r/min，15 min，吸取上清，利用BCA 蛋白定量試劑盒定量，加入適量的5 × SDS loading 蛋白上樣緩沖液。用12%的SDS-PAGE 的分離膠進(jìn)行電泳（條件：80 V，30 min；120 V，60 min），電泳結(jié)束后，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上（條件：260 mA，60 min），用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，再用1% BSA 將TMEM39A 抗體和LC3 抗體分別稀釋500 和2 000 倍后于室溫下孵育2 h，TBST 清洗PVDF 膜4 次，每次5 min，再以抗兔IgG 二抗（1∶10 000）于室溫下孵育1 h，用TBST清洗PVDF 膜6 次，每次5 min，使用適量的高敏型ECL 發(fā)光液，使用生物分子成像儀曝光，利用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用Trizol 試劑提取RBE 細(xì)胞中的總RNA，通過(guò)HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Actin 作為內(nèi)參，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔，引物由南京金斯瑞和生工生物工程（上海）股份有限公司合成，數(shù)據(jù)處理根據(jù)2-ΔΔCt為目標(biāo)基因在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異倍數(shù)。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次以上，使用GraphPad Prism7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組組間數(shù)據(jù)比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜ 0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMEM39A 在原發(fā)性膽汁性膽管炎中的發(fā)現(xiàn)及其表達(dá) 本課題組前期協(xié)助完成對(duì)2 069 例漢族PBC 樣品和6 163 例對(duì)照樣品的GWAS 掃描和驗(yàn)證試驗(yàn)，證實(shí)TMEM39A（rs3732421）位點(diǎn)達(dá)到了GWAS顯著性，見(jiàn)圖1A。（rs3732421數(shù)據(jù)庫(kù)原定位于CD80，現(xiàn)已更正為T(mén)MEM39A，見(jiàn)https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/search/all/？term=rs3732421）。通過(guò)本課題組前期研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)PBC 患者和健康對(duì)照組的血液標(biāo)本中的TMEM39A 外周血濃度。發(fā)現(xiàn)PBC 組中的TMEM39A 的濃度要高于對(duì)照組，見(jiàn)圖1B，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖1 在原發(fā)性膽汁性膽管炎中發(fā)現(xiàn)了TMEM39AFig.1 The TMEM39A gene has been identified in primary biliary cholangitis.

2.2 GCDC 對(duì)RBE 細(xì)胞活力的影響 為了研究GCDC 對(duì)RBE 細(xì)胞活力的影響，利用不同濃度的GCDC（500、1 000 μmol/L）處理RBE 細(xì)胞，處理時(shí)間為24、48、72、96 h。結(jié)果表明，隨著GCDC 處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸降低，且GCDC 濃度升高，細(xì)胞活力降低，見(jiàn)圖2。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖2 GCDC 對(duì)RBE 細(xì)胞細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of GCDC on cell viability of RBE cells

2.3 GCDC對(duì)RBE細(xì)胞增殖的影響 利用細(xì)胞克隆和細(xì)胞劃痕檢測(cè)GCDC 對(duì)RBE 細(xì)胞增殖的影響，分別用PBS 和GCDC（500、1 000 μmol/L）處理RBE細(xì)胞。結(jié)果顯示，GCDC濃度越高，GCDC 對(duì)RBE 細(xì)胞的抑制作用越明顯，細(xì)胞克隆數(shù)越少，見(jiàn)圖3A。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，GCDC 濃度越高，細(xì)胞愈合率下降，1 000 μmol/L 的GCDC 處理的RBE 細(xì)胞愈合率降低最顯著，見(jiàn)圖3B。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖3 不同濃度的GCDC 對(duì)RBE 細(xì)胞細(xì)胞克隆形成和愈合的影響Fig.3 Effects of different concentrations of GCDC on cell clonal formation and healing in RBE cells

2.4 GCDC 對(duì)RBE 細(xì)胞凋亡的影響 Hoechst 染色觀察細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，在GCDC 濃度為1 000μmol/L 時(shí)，細(xì)胞凋亡指數(shù)最高，見(jiàn)圖4。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖4 不同濃度的GCDC 誘導(dǎo)RBE 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡Fig.4 Different concentrations of GCDC induced apoptosis in RBE cells

2.5 成功構(gòu)建TMEM39A 過(guò)表達(dá)載體 為研究TMEM39A 在原發(fā)性膽汁性膽管炎中如何調(diào)節(jié)自噬，通過(guò)PCR成功擴(kuò)增出TMEM39A全基因組序列，并與pEGFP-C1 質(zhì)粒構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pEGFPC1-TMEM39A，并將重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化和提取，通過(guò)雙酶切驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證重組成功，見(jiàn)圖5A，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 確定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)間為48 h，見(jiàn)圖5B。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖5 基因TMEM39A 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.5 Construction of overexpression vector of gene TMEM39A

2.6 干擾片段的篩選 由公司合成的3對(duì)TMEM39 A 干擾片段和1 對(duì)陰性對(duì)照，將siRNA 轉(zhuǎn)染至RBE細(xì)胞中，通過(guò)Western blot 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，篩選到1 對(duì)siRNA 的敲降趨勢(shì)更明顯，見(jiàn)圖6。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖6 轉(zhuǎn)染干擾片段后TMEM39A 的表達(dá)量Fig.6 The expression of TMEM39A after transfection of interference fragment

2.7 TMEM39A 對(duì)原發(fā)性膽汁性膽管炎中自噬蛋白表達(dá)的影響 在體外根據(jù)前文所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1 000 μmol/L GCDC 濃度處理RBE 細(xì)胞，其凋亡指數(shù)更高；同時(shí)使用1 000 μmol/L GCDC 濃度作用細(xì)胞后，觀察細(xì)胞增殖率最佳時(shí)間為24 h。所以在體外利用1 000 μmol/L 的GCDC 濃度來(lái)處理細(xì)胞24 h，構(gòu)建原發(fā)性膽汁性膽管炎模型，轉(zhuǎn)染TMEM39A 過(guò)表達(dá)載體和TMEM39A 干擾片段，檢測(cè)自噬蛋白LC3 的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)TMEM39A 會(huì)促進(jìn)自噬蛋白LC3 的蛋白表達(dá)量，敲降TMEM39A 會(huì)降低自噬蛋白LC3的蛋白表達(dá)量，見(jiàn)圖7，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖7 TMEM39A 對(duì)原發(fā)性膽汁性膽管炎中自噬蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of TMEM39A on autophagy protein expression in primary biliary cholangitis

3 討論

PBC 是由免疫介導(dǎo)的膽汁淤積性疾病，會(huì)進(jìn)行性破壞膽管上皮細(xì)胞，最終導(dǎo)致肝硬化和肝衰竭，其臨床癥狀多為乏力、瘙癢等，隱匿性強(qiáng)［12］。遺傳易感性被認(rèn)為是PBC發(fā)展的主要因素之一［13］。原發(fā)性膽汁性膽管炎是膽管細(xì)胞浸潤(rùn)在膽汁酸中，膽汁酸對(duì)膽管細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用。膽汁酸的合成是由膽固醇通過(guò)經(jīng)典和替代途徑進(jìn)行的，并且由肝細(xì)胞分泌膽汁酸合成所需要的所有酶［14］，而人體主要的膽汁酸包括膽酸和鵝去氧膽酸，初級(jí)鵝去氧膽酸和膽酸是在肝臟中通過(guò)多級(jí)酶的作用完成的［15-16］。而現(xiàn)在大多數(shù)PBC 的研究是基于膽管細(xì)胞浸潤(rùn)在膽汁酸中，其中經(jīng)常使用的膽汁酸，即是甘氨鵝脫氧膽酸鈉（GCDC），它是膽汁中的主要膽鹽成分。在本研究中，即是選用GCDC 來(lái)處理膽管細(xì)胞，用于模擬原發(fā)性膽汁性膽管炎中的膽管上皮細(xì)胞在膽汁淤積的情況。通過(guò)不同的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)檢測(cè)不同GCDC 濃度和處理人膽管細(xì)胞的最佳時(shí)間。最后選擇了GCDC 濃度為1 000 μmol/L 和處理時(shí)間為24 h 來(lái)作為后續(xù)處理細(xì)胞的條件。已有研究［17］發(fā)現(xiàn)，血清中的膽汁酸濃度在體內(nèi)一般不會(huì)直接引起細(xì)胞毒性作用。相比之下，1 000 μmol/L 的GCDC 濃度存在廣泛的細(xì)胞毒性作用，代表了體內(nèi)的膽道水平。膽汁酸的積累會(huì)使肝損傷，從而引發(fā)一系列的其他的全身癥狀，膽汁酸流量減少會(huì)引起膽汁淤積患者的自噬［18］。

自噬是可以降解潛在毒性的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保守的分解代謝過(guò)程［19］，自噬的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的人體病理［18］。現(xiàn)在越來(lái)越多的證明表明，自噬的失調(diào)參與了PBC 的發(fā)病機(jī)制。參與慢性非化膿性破壞性膽管炎（CNSDC）的受損膽管細(xì)胞顯示自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 和p62/SQSTM1 的積累。LC3 在PBC 受損的膽管細(xì)胞中具有特征性表達(dá)［20］，并且自噬體的增加是由于自噬受損所致。有研究表明，GCDC 會(huì)導(dǎo)致膽管細(xì)胞發(fā)生自噬引起自噬失調(diào)，而發(fā)生自噬的原因尚不明確，但自噬在生理上可控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動(dòng)力學(xué)，從而可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并且在研究中表明在PBC 的膽管細(xì)胞中可見(jiàn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物PDI 和GRP78 的廣泛性表達(dá)［21］。

TMEM39A 是跨膜蛋白家族的蛋白，它的編碼序列具有保守型，它的單核苷酸多態(tài)性與主要人類(lèi)疾病相關(guān)［22］。有全基因組關(guān)聯(lián)研究確定了TMEM39A中的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)［10］。TMEM39A定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，且它的的分子功能與自噬相關(guān)［9］。在本次研究中，構(gòu)建了TMEM39A 過(guò)表達(dá)載體和TMEM39A干擾片段，利用RBE細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)染TMEM39A 過(guò)表達(dá)載體和干擾片段，觀察到在RBE 細(xì)胞中，TMEM39A 過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)自噬蛋白LC3 的表達(dá)。隨后，又用GCDC 處理RBE 細(xì)胞，模擬膽汁淤積，再轉(zhuǎn)染TMEM39A 過(guò)表達(dá)載體和干擾片段，發(fā)現(xiàn)在膽汁淤積的環(huán)境下，TMEM39A仍會(huì)促進(jìn)自噬蛋白LC3 的表達(dá)。但是，本研究仍存在很多局限性，因?qū)嶒?yàn)條件的限制，未能在在原代膽管上皮細(xì)胞中，進(jìn)行以上一系列實(shí)驗(yàn)的研究。

綜上所述，疏水性膽汁酸GCDC 會(huì)誘導(dǎo)人膽管細(xì)胞凋亡，模擬膽汁淤積。TMEM39A 的表達(dá)增高引起膽管細(xì)胞自噬增強(qiáng)使膽管受損，可能是引起PBC 的機(jī)制之一。

【Author contributions】SUN Xiaotong performed the experiments and wrote the article.WANG Chan，ZHANG Mingming and SUN Xiaotong designed the study.HAN Chongxu and REN Chuanli reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.