喬松，胡艷平，何生華

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是腰痛和神經(jīng)放射性腿疼的常見原因，具有病程長、易復(fù)發(fā)的特點，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1］。LDH 主要是由于腰神經(jīng)根受到機(jī)械性壓迫或髓核局部炎癥引起，炎性介質(zhì)可引起膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎性因子、趨化因子的釋放，導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生［2］。CXC 趨化因子配體12（CXC chemokine ligand 12，CXCL12）又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cellderived factor-1，SDF-1），主要來源于活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可與其特異性受體CXC 趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）結(jié)合并激活下游通路，參與神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)［3］。研究顯示，CXCL12/CXCR4通路參與脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛，使用CXCL12 中和抗體或CXCR4 拮抗劑AMD3100可抑制神經(jīng)性疼痛的發(fā)生，減少脊髓背角中星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物——膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物——離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1）的表達(dá)［4］。馬錢子苷（loganin）是從中藥山茱萸中提取的環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有抗炎、抗氧化和保護(hù)神經(jīng)元的作用［5］。研究顯示，馬錢子苷可抑制氧化應(yīng)激和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活化，改善糖尿病神經(jīng)病變介導(dǎo)的疼痛，從而改善神經(jīng)性疼痛［6］。本研究基于CXCL12/CXCR4 信號通路，探討馬錢子苷治療神經(jīng)性疼痛的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。6～8 周齡SPF 級SD 雄性大鼠50只，體質(zhì)量210～230 g，購自河南省實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2022-0001，動物飼養(yǎng)于溫度25 ℃，相對濕度55%的環(huán)境中，12 h 晝、夜循環(huán)照明，保持環(huán)境通風(fēng)整潔，大鼠正常飲食水。（2）主要試劑與儀器。馬錢子苷（純度：98%）購自Sigma公司；CXCL12及CXCR4拮抗劑AMD3100購自MedChemExpress 公司；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；CXCL12、CXCR4、NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、胱天蛋白酶1（caspase-1）、IL-1β、Iba-1 及異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的IgG 二抗購自Abcam 公司。BME-403 Von Frey 纖維絲測痛儀、BME-410C 全自動熱痛刺激儀（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所）；iMark680 多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；BX53 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；ST8R 高速離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗動物分組及模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將50 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法抽取10 只為假手術(shù)組（Sham組），其余40 只大鼠制備LDH 模型［7］，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，于背部正中切開約4 cm 皮下組織，暴露雙側(cè)L4—L5椎板并切除半椎板，暴露L5神經(jīng)根，從尾椎間盤取出約10 mg 髓核置于L5 神經(jīng)根上，避免壓迫，術(shù)后每日于臀大肌注射40萬U青霉素預(yù)防感染，連續(xù)給藥3 d。Sham組大鼠切開皮膚后僅暴露L4—L5椎板。

造模成功后，將40 大鼠隨機(jī)分為Model 組、CXCR4 拮抗劑組（AMD3100 組）、馬錢子苷組、馬錢子苷+CXCL12 組，每組10 只。AMD3100 組給予大鼠鞘內(nèi)注射20 μg 的AMD3100，馬錢子苷組給予大鼠5 mg/kg 的馬錢子苷腹腔注射，馬錢子苷+CXCL12 組同時給予大鼠腹腔注射5 mg/kg 的馬錢子苷及鞘內(nèi)注射250 ng 的CXCL12，給藥劑量參照文獻(xiàn)［5，8］，Sham 組與Model 組大鼠同時腹腔注射及鞘內(nèi)注射等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥2周。

1.2.2 大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期檢測 分別于造模后1 d及治療后3、7、14 d，采用紅外輻射測溫法評估大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期，將大鼠置于玻璃籠中1 h以適應(yīng)環(huán)境，玻璃表面溫度保持在30 ℃，在右后爪下方放置輻射熱源，使用足底鎮(zhèn)痛儀測定30 s內(nèi)的熱撤足反應(yīng)潛伏期，測量3次，取平均值。

1.2.3 機(jī)械性撤足閾值檢測 分別于造模后1 d 及治療后3、7、14 d，使用BME-410C 全自動熱痛刺激儀檢測機(jī)械性撤足閾值，以von Frey 纖維絲（2.5～50 g）刺激大鼠右肢足底二、三跖骨處，每次刺激測試間隔5 min，連測3次，取平均值。

1.2.4 脊髓背角組織形態(tài)學(xué)觀察 麻醉處死大鼠，取L4—L6節(jié)段脊髓背角組織，每組隨機(jī)抽取5 只大鼠脊髓背角組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片（4 μm），HE染色，顯微鏡下觀察脊髓背角組織形態(tài)學(xué)變化。剩余大鼠脊髓背角組織置于液氮中保存。

1.2.5 ELISA 法檢測脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平 取50 mg 脊髓背角組織，按照質(zhì)量體積比1∶9 的比例加入生理鹽水，勻漿后，以離心半徑10 cm，5 000 r/min 離心20 min，留取上清液于-20 ℃保存，參照試劑盒說明書檢測上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.6 免疫熒光染色檢測脊髓背角組織小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況 取液氮中保存的脊髓背角組織，切成10 μm 的切片，室溫干燥后，使用丙酮在4 ℃條件下固定10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，加入1.2%過氧化氫孵育30 min，再使用0.3% Triton X-100 透化30 min，加入Iba-1 抗體（1∶100 稀釋），4 ℃孵育過夜，再加入FITC標(biāo)記的IgG二抗（1∶100）室溫孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 Western blot 檢測脊髓背角組織蛋白表達(dá) 取凍存的脊髓背角組織，研磨后加入RIPA裂解液提取組織總蛋白，二辛可寧酸（dicinchonic acid，BCA）法檢測蛋白濃度，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)膜；封閉后加入CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β、β-actin抗體稀釋液（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；洗滌后，加入二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h。采用Image-Quant 軟件分析CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 蛋白相對表達(dá)量，以βactin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期、機(jī)械性撤足閾值比較 建模后1 d，與Sham組比較，其余組大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期、機(jī)械性撤足閾值降低（P＜0.05）。在治療后3 d、7 d 及14 d，與Sham 組比較，Model 組大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期、機(jī)械性撤足閾值降低（P＜0.05），與Model 組比較，AMD3100 組與馬錢子苷組大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期、機(jī)械性撤足閾值升高（P＜0.05）；在治療后7 d 及14 d，與馬錢子苷組比較，馬錢子苷+CXCL12 組大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期、機(jī)械性撤足閾值降低（P＜0.05），見表1、2。

Tab.1 Comparison of incubation period of hot withdrawal reaction between the five groups of rats表1 各組大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期比較 （n=10，s，）

＊＊P＜0.01；a與Sham 組比較，b與Model 組比較，c與馬錢子苷組比較，P＜0.05；表2—4同。

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Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats between the five groups表2 各組大鼠機(jī)械性撤足閾值比較（n=10，g，）

Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats between the five groups表2 各組大鼠機(jī)械性撤足閾值比較（n=10，g，）

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2.2 各組大鼠脊髓背角組織形態(tài)學(xué)變化 Sham 組脊髓背角組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，核仁清晰可見，胞漿內(nèi)尼氏小體顆粒豐富；Model 組脊髓背角組織損傷嚴(yán)重，炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，核仁及輪廓不清，胞漿中尼氏小體排列不均勻，胞漿呈空泡樣變化；AMD3100組與馬錢子苷組脊髓背角組織損傷明顯改善，細(xì)胞形態(tài)尚規(guī)則，細(xì)胞核邊緣與核仁較為清晰，胞漿內(nèi)尼氏小體分布較為均勻，有少量細(xì)胞固縮、壞死；馬錢子苷+CXCL12 組脊髓背角組織較馬錢子苷組病理損傷加重，炎性細(xì)胞增多，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核邊緣模糊，見圖1。

Fig.1 Histomorphologic changes of spinal dorsal horn in five groups(HE staining,×100)圖1 各組脊髓背角組織形態(tài)學(xué)變化（HE染色，×100）

2.3 各組大鼠脊髓背角組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況比較 與Sham組比較，Model組綠色熒光增加，Iba-1陽性表達(dá)增多；與Model組比較，AMD3100組與馬錢子苷組Iba-1 陽性表達(dá)減少；與馬錢子苷組比較，馬錢子苷+CXCL12組綠色熒光增多，Iba-1陽性表達(dá)增加，見圖2。

Fig.2 Activation of microglia in each group(immunofluorescence staining,×400)圖2 各組小膠質(zhì)細(xì)胞的活化（免疫熒光染色，×400）

2.4 各組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 與Sham 組比較，Model 組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.05）；與Model 組比較，AMD3100 組與馬錢子苷組脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05）；與馬錢子苷組比較，馬錢子苷+CXCL12 組脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 in spinal dorsal horn of rats between five groups表3 各組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（n=10，ng/L，）

Tab.3 Comparison of levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 in spinal dorsal horn of rats between five groups表3 各組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（n=10，ng/L，）

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2.5 各組大鼠脊髓背角組織蛋白表達(dá) 與Sham 組比較，Model 組大鼠脊髓背角組織CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與Model 組比較，AMD3100 組與馬錢子苷組CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與馬錢子苷組比較，馬錢子苷+CXCL12 組CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β表達(dá)水平升高（P＜0.05），見表4、圖3。

Fig.3 Expression levels of CXCL12,CXCR4,NLRP3,caspase-1 and IL-1b in spinal dorsal horn of rats in each group圖3 各組大鼠脊髓背角組織CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)

Tab.4 Comparison of protein expressions of CXCL12,CXCR4,NLRP3,caspase-1 and IL-1β in spinal dorsal horn of rats between five groups表4 各組大鼠脊髓背角組織CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)比較（n=5，）

Tab.4 Comparison of protein expressions of CXCL12,CXCR4,NLRP3,caspase-1 and IL-1β in spinal dorsal horn of rats between five groups表4 各組大鼠脊髓背角組織CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)比較（n=5，）

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3 討論

LDH 多發(fā)于中年男性，主要表現(xiàn)為反復(fù)腰痛和坐骨神經(jīng)痛；髓核對神經(jīng)根的機(jī)械壓迫是產(chǎn)生疼痛的主要原因，神經(jīng)根在炎癥狀態(tài)下，可激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)并激活小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)炎性因子釋放，引發(fā)疼痛［9］。本研究顯示，馬錢子苷可改善LDH 大鼠疼痛反應(yīng)，減輕大鼠脊髓背角組織病理損傷，降低炎性因子水平，提示馬錢子苷可抑制炎癥反應(yīng)改善LDH大鼠疼痛反應(yīng)。

小膠質(zhì)細(xì)胞參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可通過分泌TNF-α、IL-1β 等促炎因子，促進(jìn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，引起痛覺過敏［10］。IL-6、IL-1β 等炎性因子水平變化與疼痛程度密切相關(guān)，臨床上，LDH 患者經(jīng)過治療后血清中TNF-α、IL-1β等因子水平下降，神經(jīng)痛緩解［11］。在LDH動物模型中，抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥反應(yīng)可治療大鼠神經(jīng)性疼痛［12］。馬錢子苷在心血管系統(tǒng)、炎癥性疾病與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有廣泛的應(yīng)用［13］。據(jù)報道，馬錢子苷可通過抑制NF-κB 激活，抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的釋放，改善慢性壓迫性損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和疼痛行為［14］；馬錢子苷還可抑制Aβ1～42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，抑制炎癥反應(yīng)［15］。本研究結(jié)果亦證實，使用馬錢子苷干預(yù)后，大鼠脊髓背角組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化減少，同時脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低，提示馬錢子苷可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，抑制脊髓炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善LDH大鼠疼痛反應(yīng)。

CXCL12屬于趨化因子家族，除了具有趨化淋巴細(xì)胞的作用外，還可調(diào)節(jié)神經(jīng)信號傳遞，CXCL12 與其受體CXCR4在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，CXCL12/CXCR4 通路可激活外周傷害性感覺神經(jīng)元，引發(fā)痛覺敏化，在骨癌疼痛、糖尿病引起的疼痛、部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)疼痛中發(fā)揮重要作用［16-17］。研究顯示，在脊髓損傷小鼠模型中，抑制CXCL12/CXCR4 通路可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)性疼痛［18］。Cheng等［8］研究顯示，馬錢子苷可通過抑制CXCL12/CXCR4 通路介導(dǎo)的NLRP3 炎性小體的激活來減輕坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛。在本研究中，Model 組大鼠脊髓背角組織中CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平較Sham組均升高，表明CXCL12/CXCR4信號通路被激活；給予馬錢子苷治療后，大鼠脊髓背角組織中CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平均降低，提示馬錢子苷對LDH 大鼠疼痛反應(yīng)的改善作用可能與抑制CXCL12/CXCR4 信號通路激活有關(guān)。此外，CXCR4 拮抗劑AMD3100 可改善LDH 大鼠脊髓背角組織病理損傷，馬錢子苷與AMD3100的作用結(jié)果一致；而在馬錢子苷干預(yù)的基礎(chǔ)上給予模型大鼠鞘內(nèi)注射CXCL12 后，馬錢子苷對模型大鼠疼痛反應(yīng)的改善作用被明顯減弱，提示馬錢子苷可能通過抑制CXCL12/CXCR4 信號通路的激活，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化與炎癥反應(yīng)，改善LDH大鼠疼痛反應(yīng)。

綜上所述，馬錢子苷可改善LDH 大鼠疼痛反應(yīng)，可能與抑制CXCL12/CXCR4信號通路活性有關(guān)。本研究從體內(nèi)水平初步探究了馬錢子苷治療神經(jīng)性疼痛的分子機(jī)制，除CXCL12/CXCR4信號通路外，馬錢子苷能否通過其他因子或通路發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步探究，在未來的研究中將結(jié)合體外細(xì)胞實驗深入驗證馬錢子苷的作用機(jī)制。