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        馬錢子苷抑制CXCL12/CXCR4信號通路對腰椎間盤突出癥大鼠疼痛反應(yīng)的影響

        2023-10-15 17:23:06喬松胡艷平何生華
        天津醫(yī)藥 2023年10期

        喬松,胡艷平,何生華

        腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation,LDH)是腰痛和神經(jīng)放射性腿疼的常見原因,具有病程長、易復(fù)發(fā)的特點,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。LDH 主要是由于腰神經(jīng)根受到機(jī)械性壓迫或髓核局部炎癥引起,炎性介質(zhì)可引起膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎性因子、趨化因子的釋放,導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生[2]。CXC 趨化因子配體12(CXC chemokine ligand 12,CXCL12)又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cellderived factor-1,SDF-1),主要來源于活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,可與其特異性受體CXC 趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)結(jié)合并激活下游通路,參與神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)[3]。研究顯示,CXCL12/CXCR4通路參與脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛,使用CXCL12 中和抗體或CXCR4 拮抗劑AMD3100可抑制神經(jīng)性疼痛的發(fā)生,減少脊髓背角中星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物——膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物——離子鈣結(jié)合銜接分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba-1)的表達(dá)[4]。馬錢子苷(loganin)是從中藥山茱萸中提取的環(huán)烯醚萜苷類化合物,具有抗炎、抗氧化和保護(hù)神經(jīng)元的作用[5]。研究顯示,馬錢子苷可抑制氧化應(yīng)激和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)活化,改善糖尿病神經(jīng)病變介導(dǎo)的疼痛,從而改善神經(jīng)性疼痛[6]。本研究基于CXCL12/CXCR4 信號通路,探討馬錢子苷治療神經(jīng)性疼痛的分子機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料 (1)實驗動物。6~8 周齡SPF 級SD 雄性大鼠50只,體質(zhì)量210~230 g,購自河南省實驗動物中心,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(豫)2022-0001,動物飼養(yǎng)于溫度25 ℃,相對濕度55%的環(huán)境中,12 h 晝、夜循環(huán)照明,保持環(huán)境通風(fēng)整潔,大鼠正常飲食水。(2)主要試劑與儀器。馬錢子苷(純度:98%)購自Sigma公司;CXCL12及CXCR4拮抗劑AMD3100購自MedChemExpress 公司;大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;CXCL12、CXCR4、NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、胱天蛋白酶1(caspase-1)、IL-1β、Iba-1 及異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的IgG 二抗購自Abcam 公司。BME-403 Von Frey 纖維絲測痛儀、BME-410C 全自動熱痛刺激儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所);iMark680 多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad 公司);BX53 熒光顯微鏡(日本Olympus 公司);ST8R 高速離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)。

        1.2 研究方法

        1.2.1 實驗動物分組及模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將50 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法抽取10 只為假手術(shù)組(Sham組),其余40 只大鼠制備LDH 模型[7],腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉,于背部正中切開約4 cm 皮下組織,暴露雙側(cè)L4—L5椎板并切除半椎板,暴露L5神經(jīng)根,從尾椎間盤取出約10 mg 髓核置于L5 神經(jīng)根上,避免壓迫,術(shù)后每日于臀大肌注射40萬U青霉素預(yù)防感染,連續(xù)給藥3 d。Sham組大鼠切開皮膚后僅暴露L4—L5椎板。

        造模成功后,將40 大鼠隨機(jī)分為Model 組、CXCR4 拮抗劑組(AMD3100 組)、馬錢子苷組、馬錢子苷+CXCL12 組,每組10 只。AMD3100 組給予大鼠鞘內(nèi)注射20 μg 的AMD3100,馬錢子苷組給予大鼠5 mg/kg 的馬錢子苷腹腔注射,馬錢子苷+CXCL12 組同時給予大鼠腹腔注射5 mg/kg 的馬錢子苷及鞘內(nèi)注射250 ng 的CXCL12,給藥劑量參照文獻(xiàn)[5,8],Sham 組與Model 組大鼠同時腹腔注射及鞘內(nèi)注射等量的生理鹽水,每天1次,連續(xù)給藥2周。

        1.2.2 大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期檢測 分別于造模后1 d及治療后3、7、14 d,采用紅外輻射測溫法評估大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期,將大鼠置于玻璃籠中1 h以適應(yīng)環(huán)境,玻璃表面溫度保持在30 ℃,在右后爪下方放置輻射熱源,使用足底鎮(zhèn)痛儀測定30 s內(nèi)的熱撤足反應(yīng)潛伏期,測量3次,取平均值。

        1.2.3 機(jī)械性撤足閾值檢測 分別于造模后1 d 及治療后3、7、14 d,使用BME-410C 全自動熱痛刺激儀檢測機(jī)械性撤足閾值,以von Frey 纖維絲(2.5~50 g)刺激大鼠右肢足底二、三跖骨處,每次刺激測試間隔5 min,連測3次,取平均值。

        1.2.4 脊髓背角組織形態(tài)學(xué)觀察 麻醉處死大鼠,取L4—L6節(jié)段脊髓背角組織,每組隨機(jī)抽取5 只大鼠脊髓背角組織,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋并切片(4 μm),HE染色,顯微鏡下觀察脊髓背角組織形態(tài)學(xué)變化。剩余大鼠脊髓背角組織置于液氮中保存。

        1.2.5 ELISA 法檢測脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平 取50 mg 脊髓背角組織,按照質(zhì)量體積比1∶9 的比例加入生理鹽水,勻漿后,以離心半徑10 cm,5 000 r/min 離心20 min,留取上清液于-20 ℃保存,參照試劑盒說明書檢測上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

        1.2.6 免疫熒光染色檢測脊髓背角組織小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況 取液氮中保存的脊髓背角組織,切成10 μm 的切片,室溫干燥后,使用丙酮在4 ℃條件下固定10 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,加入1.2%過氧化氫孵育30 min,再使用0.3% Triton X-100 透化30 min,加入Iba-1 抗體(1∶100 稀釋),4 ℃孵育過夜,再加入FITC標(biāo)記的IgG二抗(1∶100)室溫孵育1 h,熒光顯微鏡下觀察并拍照。

        1.2.7 Western blot 檢測脊髓背角組織蛋白表達(dá) 取凍存的脊髓背角組織,研磨后加入RIPA裂解液提取組織總蛋白,二辛可寧酸(dicinchonic acid,BCA)法檢測蛋白濃度,十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)膜;封閉后加入CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β、β-actin抗體稀釋液(1∶1 000),4 ℃孵育過夜;洗滌后,加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。采用Image-Quant 軟件分析CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 蛋白相對表達(dá)量,以βactin為內(nèi)參。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較行LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期、機(jī)械性撤足閾值比較 建模后1 d,與Sham組比較,其余組大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期、機(jī)械性撤足閾值降低(P<0.05)。在治療后3 d、7 d 及14 d,與Sham 組比較,Model 組大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期、機(jī)械性撤足閾值降低(P<0.05),與Model 組比較,AMD3100 組與馬錢子苷組大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期、機(jī)械性撤足閾值升高(P<0.05);在治療后7 d 及14 d,與馬錢子苷組比較,馬錢子苷+CXCL12 組大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期、機(jī)械性撤足閾值降低(P<0.05),見表1、2。

        Tab.1 Comparison of incubation period of hot withdrawal reaction between the five groups of rats表1 各組大鼠熱撤足反應(yīng)潛伏期比較 (n=10,s,)

        **P<0.01;a與Sham 組比較,b與Model 組比較,c與馬錢子苷組比較,P<0.05;表2—4同。

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        Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats between the five groups表2 各組大鼠機(jī)械性撤足閾值比較(n=10,g,)

        Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats between the five groups表2 各組大鼠機(jī)械性撤足閾值比較(n=10,g,)

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        2.2 各組大鼠脊髓背角組織形態(tài)學(xué)變化 Sham 組脊髓背角組織結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,核仁清晰可見,胞漿內(nèi)尼氏小體顆粒豐富;Model 組脊髓背角組織損傷嚴(yán)重,炎性細(xì)胞浸潤,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,核仁及輪廓不清,胞漿中尼氏小體排列不均勻,胞漿呈空泡樣變化;AMD3100組與馬錢子苷組脊髓背角組織損傷明顯改善,細(xì)胞形態(tài)尚規(guī)則,細(xì)胞核邊緣與核仁較為清晰,胞漿內(nèi)尼氏小體分布較為均勻,有少量細(xì)胞固縮、壞死;馬錢子苷+CXCL12 組脊髓背角組織較馬錢子苷組病理損傷加重,炎性細(xì)胞增多,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞核邊緣模糊,見圖1。

        Fig.1 Histomorphologic changes of spinal dorsal horn in five groups(HE staining,×100)圖1 各組脊髓背角組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色,×100)

        2.3 各組大鼠脊髓背角組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況比較 與Sham組比較,Model組綠色熒光增加,Iba-1陽性表達(dá)增多;與Model組比較,AMD3100組與馬錢子苷組Iba-1 陽性表達(dá)減少;與馬錢子苷組比較,馬錢子苷+CXCL12組綠色熒光增多,Iba-1陽性表達(dá)增加,見圖2。

        Fig.2 Activation of microglia in each group(immunofluorescence staining,×400)圖2 各組小膠質(zhì)細(xì)胞的活化(免疫熒光染色,×400)

        2.4 各組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 與Sham 組比較,Model 組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高(P<0.05);與Model 組比較,AMD3100 組與馬錢子苷組脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低(P<0.05);與馬錢子苷組比較,馬錢子苷+CXCL12 組脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05),見表3。

        Tab.3 Comparison of levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 in spinal dorsal horn of rats between five groups表3 各組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較(n=10,ng/L,)

        Tab.3 Comparison of levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 in spinal dorsal horn of rats between five groups表3 各組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較(n=10,ng/L,)

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        2.5 各組大鼠脊髓背角組織蛋白表達(dá) 與Sham 組比較,Model 組大鼠脊髓背角組織CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平升高(P<0.05);與Model 組比較,AMD3100 組與馬錢子苷組CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平降低(P<0.05);與馬錢子苷組比較,馬錢子苷+CXCL12 組CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β表達(dá)水平升高(P<0.05),見表4、圖3。

        Fig.3 Expression levels of CXCL12,CXCR4,NLRP3,caspase-1 and IL-1b in spinal dorsal horn of rats in each group圖3 各組大鼠脊髓背角組織CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)

        Tab.4 Comparison of protein expressions of CXCL12,CXCR4,NLRP3,caspase-1 and IL-1β in spinal dorsal horn of rats between five groups表4 各組大鼠脊髓背角組織CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)比較(n=5,)

        Tab.4 Comparison of protein expressions of CXCL12,CXCR4,NLRP3,caspase-1 and IL-1β in spinal dorsal horn of rats between five groups表4 各組大鼠脊髓背角組織CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)比較(n=5,)

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        3 討論

        LDH 多發(fā)于中年男性,主要表現(xiàn)為反復(fù)腰痛和坐骨神經(jīng)痛;髓核對神經(jīng)根的機(jī)械壓迫是產(chǎn)生疼痛的主要原因,神經(jīng)根在炎癥狀態(tài)下,可激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)并激活小膠質(zhì)細(xì)胞,促進(jìn)炎性因子釋放,引發(fā)疼痛[9]。本研究顯示,馬錢子苷可改善LDH 大鼠疼痛反應(yīng),減輕大鼠脊髓背角組織病理損傷,降低炎性因子水平,提示馬錢子苷可抑制炎癥反應(yīng)改善LDH大鼠疼痛反應(yīng)。

        小膠質(zhì)細(xì)胞參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng),活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可通過分泌TNF-α、IL-1β 等促炎因子,促進(jìn)神經(jīng)炎癥反應(yīng),引起痛覺過敏[10]。IL-6、IL-1β 等炎性因子水平變化與疼痛程度密切相關(guān),臨床上,LDH 患者經(jīng)過治療后血清中TNF-α、IL-1β等因子水平下降,神經(jīng)痛緩解[11]。在LDH動物模型中,抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥反應(yīng)可治療大鼠神經(jīng)性疼痛[12]。馬錢子苷在心血管系統(tǒng)、炎癥性疾病與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有廣泛的應(yīng)用[13]。據(jù)報道,馬錢子苷可通過抑制NF-κB 激活,抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的釋放,改善慢性壓迫性損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和疼痛行為[14];馬錢子苷還可抑制Aβ1~42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活,抑制炎癥反應(yīng)[15]。本研究結(jié)果亦證實,使用馬錢子苷干預(yù)后,大鼠脊髓背角組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化減少,同時脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低,提示馬錢子苷可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化,抑制脊髓炎癥反應(yīng),進(jìn)而改善LDH大鼠疼痛反應(yīng)。

        CXCL12屬于趨化因子家族,除了具有趨化淋巴細(xì)胞的作用外,還可調(diào)節(jié)神經(jīng)信號傳遞,CXCL12 與其受體CXCR4在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá),CXCL12/CXCR4 通路可激活外周傷害性感覺神經(jīng)元,引發(fā)痛覺敏化,在骨癌疼痛、糖尿病引起的疼痛、部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)疼痛中發(fā)揮重要作用[16-17]。研究顯示,在脊髓損傷小鼠模型中,抑制CXCL12/CXCR4 通路可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng),減輕神經(jīng)性疼痛[18]。Cheng等[8]研究顯示,馬錢子苷可通過抑制CXCL12/CXCR4 通路介導(dǎo)的NLRP3 炎性小體的激活來減輕坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛。在本研究中,Model 組大鼠脊髓背角組織中CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平較Sham組均升高,表明CXCL12/CXCR4信號通路被激活;給予馬錢子苷治療后,大鼠脊髓背角組織中CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平均降低,提示馬錢子苷對LDH 大鼠疼痛反應(yīng)的改善作用可能與抑制CXCL12/CXCR4 信號通路激活有關(guān)。此外,CXCR4 拮抗劑AMD3100 可改善LDH 大鼠脊髓背角組織病理損傷,馬錢子苷與AMD3100的作用結(jié)果一致;而在馬錢子苷干預(yù)的基礎(chǔ)上給予模型大鼠鞘內(nèi)注射CXCL12 后,馬錢子苷對模型大鼠疼痛反應(yīng)的改善作用被明顯減弱,提示馬錢子苷可能通過抑制CXCL12/CXCR4 信號通路的激活,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化與炎癥反應(yīng),改善LDH大鼠疼痛反應(yīng)。

        綜上所述,馬錢子苷可改善LDH 大鼠疼痛反應(yīng),可能與抑制CXCL12/CXCR4信號通路活性有關(guān)。本研究從體內(nèi)水平初步探究了馬錢子苷治療神經(jīng)性疼痛的分子機(jī)制,除CXCL12/CXCR4信號通路外,馬錢子苷能否通過其他因子或通路發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步探究,在未來的研究中將結(jié)合體外細(xì)胞實驗深入驗證馬錢子苷的作用機(jī)制。

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