劉暢，范彩紅，劉佳，劉亞珊，張詩琪，劉士銘，申艷娜

心肌損傷是膿毒癥的常見并發(fā)癥，已成為膿毒癥預后不良的重要原因之一［1-2］。膿毒癥心肌損傷發(fā)病機制復雜，現(xiàn)有治療手段療效十分有限，因此深入闡明其發(fā)病機制并開發(fā)新的治療策略意義重大。近年來，細胞焦亡作為新發(fā)現(xiàn)的一種依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的炎性程序性死亡形式，已被證實在膿毒癥心肌損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用，但其機制尚未完全闡明［3］。黑色素瘤缺失因子2（absent in melanoma 2，AIM2）是干擾素誘導的HIN-200家族成員之一，其可在心肌細胞、巨噬細胞等多種細胞中表達。相關(guān)研究表明AIM2 介導的細胞焦亡與心血管疾病發(fā)展密切相關(guān)［4］。Naa20 是N 端乙?；D(zhuǎn)移酶（N-terminal acetyltransferases，NATs）復合物B（NatB）的核心蛋白，可通過調(diào)控蛋白N 端乙酰化修飾影響蛋白降解［5］、定位［6］和結(jié)合［7］。研究表明Naa20 可參與機體多項活動，并與多種疾病的發(fā)生相關(guān)［8-9］，而其在心肌損傷中的調(diào)控作用卻鮮有報道。本研究旨在探究Naa20 及AIM2 介導的細胞焦亡在膿毒癥心肌損傷中的調(diào)控作用，以期為該病防治提供作用靶點及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系與實驗動物 大鼠心肌細胞系H9c2購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心。12只SPF級6周齡雄性C57BL/6J 小鼠（體質(zhì)量18～20 g）和10 只SPF 級1 日齡SD乳鼠（體質(zhì)量7～9 g）購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010，質(zhì)量合格證號110324231101689256。C57BL/6J 小鼠實驗前適應性飼養(yǎng)1周，溫度（22±2）℃，相對濕度60%±5%，光照條件設(shè)定為明暗各12 h循環(huán)交替，自由飲水、攝食。

1.1.2 主要試劑與儀器 肌酸激酶同工酶（CK-MB）、白細胞介素（IL）-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；線粒體膜電位熒光探針（JC-1）、活性氧（ROS）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購自南京諾唯贊公司；Trizol 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；鼠源AIM2 一抗購自美國Proteintech公司；兔源消皮素D（GSDMD）、Naa20一抗購自武漢愛博泰克生物公司；兔源IL-1β 一抗購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG 二抗及山羊抗鼠IgG二抗購自美國Promega公司；Protein A/G免疫沉淀磁珠試劑盒購自蘇州海貍生物醫(yī)學工程有限公司；倒置熒光顯微鏡（型號：ECLIPSE Ti-U）購自日本Nikon公司；多功能酶標儀（型號：Synergy 2）購自美國BioTek 有限公司；化學發(fā)光儀（型號：Universal Hood Ⅱ）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組及模型的建立 適應性喂養(yǎng)1 周后將12 只雄性C57BL/6J小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組和模型組，每組6 只。參照文獻［10］，采用尾靜脈注射10 mg/kg 脂多糖（LPS）制備膿毒癥心肌損傷模型，造模后給予小鼠正常飲食。對照組采用相同方法注射等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）。

1.2.2 小鼠心臟多普勒超聲檢測 在注射LPS 或PBS 12 h后對2 組小鼠進行心功能檢查。采用3%異氟烷麻醉小鼠。麻醉后固定、備皮，采用心臟多普勒超聲檢測左心室射血分數(shù)（LVEF）、短軸縮短率（FS）。所得參數(shù)為連續(xù)6個心動周期的平均值。

1.2.3 ELISA 檢測CK-MB、IL-1β 水平 采用腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，開胸取心臟血，3 000 r/min 離心15 min，收集血清，檢測小鼠血清中CK-MB含量，每組取6個樣本進行實驗。心肌細胞處理后檢測心肌細胞上清液中IL-1β含量。

1.2.4 小鼠心臟組織的采集 獲取小鼠心臟血后，取出心臟，生理鹽水灌洗心腔以洗凈殘余血液。將心臟置于4%多聚甲醛中固定，用于后續(xù)實驗。

1.2.5 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌組織結(jié)構(gòu) 首先將切片先后放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各5 min，依次放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、去離子水各5 min。蘇木素液染色5 min后，流水沖洗1～2 min，1%鹽酸乙醇30 s，流水沖洗3～5 min。伊紅染色復染30 s 后脫水。最后用中性樹膠封片。

1.2.6 心肌細胞培養(yǎng)和分組 1日齡SD乳鼠消毒、開胸取心臟，去除血管等組織，采用1%胰蛋白酶4 ℃消化12 h，0.25%膠原酶Ⅱ37 ℃消化10 min。收集乳鼠心肌細胞并培養(yǎng)于含7%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，24 h 后培養(yǎng)基更換為含1%轉(zhuǎn)鐵蛋白的DMEM 培養(yǎng)液。大鼠H9c2 心肌細胞在含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。上述細胞均置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞隨機分為對照組和LPS處理組（培養(yǎng)基中加入終濃度為10 mg/L的LPS孵育12 h）。

1.2.7 JC-1 檢測心肌細胞線粒體膜電位 乳鼠心肌細胞接種于6孔板（2×105個/孔）中，LPS處理12 h后，加入JC-1染色工作液（1 mL/孔），37 ℃孵育20 min，吸去上清液，JC-1 染色緩沖液洗滌2次，熒光顯微鏡下進行觀察和拍攝。

1.2.8 熒光探針檢測心肌細胞ROS 水平 乳鼠心肌細胞分組處理后，加入10 mmol/L的2',7'-二氫二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）使其終濃度為10 μmol/L。37 ℃孵育30 min 后PBS洗滌2次，熒光顯微鏡下進行觀察和拍攝。

1.2.9 Western blot 檢測心肌細胞中蛋白表達水平 乳鼠心肌細胞或H9c2心肌細胞分組處理后，采用RIPA裂解液破壞細胞，4 ℃、10 000×g離心5 min，收集上清液，采用二辛可寧酸（BCA）法測定蛋白質(zhì)濃度。加入適量上樣緩沖液，沸水浴10 min后取25 μg蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，PVDF 轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入AIM2、GSDMD、活化的GSDMD（GSDMD-N）、IL-1β、活化的IL-1β（p17）、Naa20 和β-actin 一抗（稀釋倍數(shù)均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP標記的IgG二抗（稀釋倍數(shù)均為1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3 次，每次10 min，化學發(fā)光（ECL）試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶并分析灰度值。以β-actin 為內(nèi)參，計算各組目的蛋白的相對表達量。

1.2.10 qPCR檢測心肌細胞中Naa20 mRNA表達 乳鼠心肌細胞分別給予1、5、10 mg/L LPS處理，12 h后采用TRIzol試劑盒提取LPS各組及對照組細胞的總RNA，Nanodrop分光光度儀檢測RNA 純度和濃度。以RNA 為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進行擴增。反應條件為95 ℃30 s；95 ℃10 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)。Naa20 以GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算Naa20 的相對表達水平。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.11 H9c2 心肌細胞分組轉(zhuǎn)染 H9c2 心肌細胞接種于6孔板（2×105個/孔）中，采用Lipofectamine 2000 試劑分別轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒、Naa20過表達質(zhì)粒各1 μg，轉(zhuǎn)染24 h后進行相應檢測。細胞分組：（1）對照組。轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，未經(jīng)LPS 處理。（2）Naa20對照組。轉(zhuǎn)染Flag-Naa20過表達質(zhì)粒，未經(jīng)LPS處理。（3）LPS組。轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，24 h后加入終濃度為10 μg/L的LPS孵育12 h。（4）Naa20+LPS組。轉(zhuǎn)染Flag-Naa20過表達質(zhì)粒，24 h后加入LPS處理。

1.2.12 MTT 法檢測H9c2 心肌細胞活力 將處理后的各組H9c2心肌細胞接種于96孔板（3 000個/孔）中，第2天每孔加入10 mL MTT溶液（5 g/L），37 ℃孵育4 h。隨后吸取上清液，加入100 μL 的二甲基亞砜，震蕩10 min 后，使用酶標儀在490 nm波長下檢測每孔的光密度（OD）值，并計算細胞活力。細胞活力（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。每組細胞設(shè)置3個重復孔。

1.2.13 檢測H9c2 細胞LDH 釋放 收集各組H9c2 心肌細胞，加入提取試劑（500 萬細胞加1 mL 提取試劑），超聲波破碎細胞，8 000×g、4 ℃離心10 min，收集細胞上清液。按照試劑盒說明書加入相應試劑，充分混勻后室溫靜置3 min，于450 nm波長處讀取各組樣品OD 值。根據(jù)標準品OD 值和相應濃度擬合標準曲線，計算各組樣品濃度（樣品濃度=0.359×OD值+0.091 9）和樣品相應的LDH值（樣品LDH=0.133×樣品濃度）。每組細胞設(shè)置3個重復孔。

1.2.14 免疫共沉淀檢測H9c2 中Naa20 與AIM2 的結(jié)合情況 收集RIPA 裂解后的細胞上清液，各組留取45 μL 上清液，記作全細胞裂解液（WCL），檢測細胞中相應蛋白表達。另取20 μL Protein A/G免疫沉淀磁珠分別與5 μL Naa20抗體或IgG 室溫結(jié)合2 h，加入上清液4 ℃孵育過夜。次日，棄去上清液，加入適量上樣緩沖液，沸水浴10 min后取25 μg蛋白上樣，Western blot 實驗檢測相關(guān)蛋白表達。H9c2 心肌細胞隨機分為3 組。對照組：細胞未處理并加入Naa20 抗體包被的磁珠；LPS處理組：細胞經(jīng)LPS處理12 h并加入Naa20抗體包被的磁珠；LPS對照組：細胞經(jīng)LPS處理12 h并加入IgG抗體包被的磁珠。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Graphpad Prism 8.0 軟件繪圖。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗；2組間均數(shù)比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS 膿毒癥小鼠出現(xiàn)心肌損傷 與對照組相比，模型組小鼠LVEF、FS 降低，血清CK-MB 含量升高（P＜0.01），見表2。HE 染色結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠心肌組織可見明顯的纖維斷裂和炎性細胞浸潤等病理改變，見圖1。

Fig.1 Heart histopathological changes in two groups of mice(HE staining,×100)圖1 2組小鼠心臟組織病理學變化（HE染色，×100）

Tab.2 Comparison of left ventricular ejection fraction,fraction shortening and CK-MB betweentwo groups of mice表2 2組小鼠LVEF、FS、CK-MB水平比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of left ventricular ejection fraction,fraction shortening and CK-MB betweentwo groups of mice表2 2組小鼠LVEF、FS、CK-MB水平比較（n=6，）

＊＊P＜0.01。

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2.2 LPS 刺激對心肌細胞線粒體功能及炎癥的影響 與對照組相比，LPS 處理組乳鼠心肌細胞中的線粒體膜電位下降，ROS 釋放增多，見圖2、3。與對照組相比，LPS 處理組乳鼠心肌細胞中的AIM2、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β 和p17 蛋白水平升高，且心肌細胞上清液中的IL-1β 含量增加（P＜0.01），見圖4、表3。

Fig.2 The mitochondrial membrane potential of neonatal rat cardiomyocytes in two groups(JC-1 staining,×100)圖2 2組乳鼠心肌細胞線粒體膜電位（JC-1染色，×100）

Fig.3 ROS levels of neonatal rat cardiomyocytes in two groups(DCFH-DA staining,×100)圖3 2組乳鼠心肌細胞ROS水平（DCFH-DA染色，×100）

Tab.3 Comparison of AIM2,GSDMD,IL-1β,p17 protein expression levels and IL-1β content in supernatant between two groups表3 2組乳鼠心肌細胞AIM2、GSDMD、IL-1β、p17蛋白表達和上清液中IL-1β水平比較 （n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

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2.3 LPS 刺激誘導Naa20 表達增多 與對照組相比，LPS各組乳鼠心肌細胞中Naa20 mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.05），見表4、圖5。

Fig.5 The expression levels of Naa20 protein in neonatal rat cardiomyocytes in four groups圖5 各組乳鼠心肌細胞中Naa20的蛋白表達水平

Tab.4 Comparison of Naa20 levels between fourgroups of neonatal rat cardiomyocytes表4 各組乳鼠心肌細胞中Naa20水平比較（n=3，）

Tab.4 Comparison of Naa20 levels between fourgroups of neonatal rat cardiomyocytes表4 各組乳鼠心肌細胞中Naa20水平比較（n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，P＜0.05。

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2.4 過表達Naa20抑制心肌細胞死亡 與對照組相比，LPS 組H9c2 心肌細胞活力降低，LDH 釋放量升高（P＜0.05）。與LPS組相比，Naa20+LPS組H9c2心肌細胞活力增強，而LDH 釋放降低（P＜0.05），見表5。

Tab.5 Comparison of H9c2 cell viability and LDH levels between four groups表5 各組H9c2細胞活力和LDH比較 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與LPS組比較，P＜0.05；表6同。

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2.5 Naa20 靶向抑制AIM2 表達 通過比對分析人源及鼠源（小鼠和大鼠）AIM2 的N 端前10 個氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)AIM2前兩個氨基酸分別為甲硫氨酸（M）和谷氨酸（E），提示AIM2可能與Naa20結(jié)合，見圖6。免疫共沉淀實驗證實，在LPS處理的H9c2心肌細胞中，Naa20 與AIM2 結(jié)合，見圖7。與LPS 組相比，Naa20+LPS組H9c2心肌細胞中AIM2乙?；ˋc）水平增加，AIM2、GSDMD、GSDMD-N 的蛋白水平下降，且細胞上清液中IL-1β 含量降低（P＜0.05），見圖8、表6。

Fig.8 The expression levels of ace-AIM2 and AIM2,GSDMD protein in four groups of H9c2 cells圖8 各組H9c2心肌細胞中AIM2乙酰化及AIM2、GSDMD、GSDMD-N的蛋白表達水平

Tab.6 Comparison of ace-AIM2 and AIM2,GSDMD,GSDMD-N protein,and IL-1β content in supernatant between four groups of H9c2 cells表6 各組H9c2心肌細胞中AIM2乙?；珹IM2、GSDMD、GSDMD-N蛋白及上清液IL-1β表達水平比較 （n=3，）

Tab.6 Comparison of ace-AIM2 and AIM2,GSDMD,GSDMD-N protein,and IL-1β content in supernatant between four groups of H9c2 cells表6 各組H9c2心肌細胞中AIM2乙?；珹IM2、GSDMD、GSDMD-N蛋白及上清液IL-1β表達水平比較 （n=3，）

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3 討論

3.1 膿毒癥心肌損傷與細胞焦亡 膿毒癥心肌損傷是膿毒癥患者出現(xiàn)的一種非缺血性心功能障礙，主要表現(xiàn)為左心室擴張伴充盈壓力正常或降低、心室收縮力降低和左右心室（收縮或舒張）功能障礙伴容積輸注反應降低［11］。據(jù)統(tǒng)計，膿毒癥不合并心肌損傷的患者病死率僅為20%，而合并心肌損傷的患者病死率可達70%～90%［12］。膿毒癥患者的心肌損傷程度已成為其不良預后的主要預測指標之一。目前研究認為心肌損傷與炎性因子的大量釋放［13］、線粒體損傷［14］和細胞死亡［15］等密切相關(guān)，其中心肌細胞死亡是造成膿毒癥心肌損傷的關(guān)鍵因素。研究顯示，在膿毒癥小鼠中，抑制NLRP3 介導的心肌細胞焦亡可有效提高小鼠的生存率，減輕心肌損傷［16］。本研究采用尾靜脈注射LPS 法構(gòu)建膿毒癥小鼠模型，也證實心肌細胞發(fā)生焦亡。因此，深入探明細胞焦亡在膿毒癥心肌損傷中的調(diào)控機制對防控該病有重要意義。

3.2 AIM2 介導的細胞焦亡與心血管疾病相關(guān) 研究表明AIM2 介導的細胞焦亡與心血管疾病密切相關(guān)［17］。Wang 等［18］研究表明，在糖尿病心肌病小鼠中，線粒體損傷釋放的ROS 可以增加AIM2 表達，進而誘發(fā)細胞焦亡，促進糖尿病心肌病的發(fā)生。在心肌缺血再灌注小鼠心臟組織中AIM2 表達顯著升高［19］，并且其下游的細胞焦亡相關(guān)炎性因子IL-18升高［20］，提示AIM2介導的細胞焦亡可能促進該疾病進展。本研究顯示，與對照組相比，LPS處理組心肌細胞線粒體膜電位顯著下降且ROS釋放增多，AIM2及焦亡相關(guān)蛋白GSDMD、GSDMD-N、IL-1β 和p17表達均升高，細胞上清液中IL-1β 含量增加，提示LPS可促進心肌細胞發(fā)生AIM2介導的細胞焦亡，這可能是導致心肌損傷的重要原因。

3.3 Naa20 通過抑制AIM2 介導的細胞焦亡減輕膿毒癥心肌損傷 Naa20 與多種疾病進展有關(guān)。Jung等［8］發(fā)現(xiàn)，Naa20通過其N端乙?；富钚哉{(diào)控肝激酶B1（LKB1）-腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路，從而參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。Morrison 等［21］發(fā)現(xiàn)，突變的Naa20 可損害NatB 的酶活性，患者出現(xiàn)發(fā)育遲緩、智力低下等表現(xiàn)。然而，Naa20在膿毒癥心肌損傷中的調(diào)控作用還鮮見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS處理組乳鼠心肌細胞中的Naa20表達水平升高，并且在H9c2心肌細胞中過表達Naa20可提高心肌細胞活力并減少LDH 釋放，表明Naa20 可以有效減輕膿毒癥心肌損傷。Naa20的反應底物需滿足其N端前兩個氨基酸為M和E（ME）或谷氨酰胺（MQ）或天冬氨酸（MD、MN）［22］，通過比對不同種屬的AIM2氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其前兩個氨基酸均為ME，推測Naa20 可能調(diào)控AIM2。本研究利用免疫共沉淀實驗證實Naa20 與AIM2 結(jié)合；與LPS 組相比，Naa20+LPS 組中AIM2 的乙?；揎椩黾樱珹IM2 及焦亡相關(guān)蛋白GSDMD、GSDMD-N、IL-1β 和p17 的蛋白表達下降，且細胞上清液中IL-1β含量降低，表明Naa20可以抑制AIM2介導的細胞焦亡。

綜上所述，Naa20 可通過結(jié)合AIM2，增加AIM2乙?；揎棧种艫IM2 介導的細胞焦亡，從而減輕LPS膿毒癥心肌損傷。本研究豐富了膿毒癥心肌損傷的發(fā)病機制，且探討了Naa20的調(diào)控作用及機制，有望為該病的臨床治療提供新思路和新靶點。