張叢，馮華，黃小龍，王旋

胃癌（gastric cancer，GC）是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，也是癌癥死亡的主要原因［1］。近年來，植物提取物及其活性成分被認為是有希望治療癌癥的候選者［2］。蔓荊子黃素（Casticin，Cas）是一種從單葉蔓荊中提取的黃酮類化合物，具有抗炎、平喘、抗血管生成和抗腫瘤活性［3］。研究表明Cas 可抑制結腸癌細胞侵襲、遷移和增殖并誘導細胞凋亡，發(fā)揮抗癌活性［4］。研究顯示，Cas 可抑制GC 細胞增殖［5］。然而Cas 對GC 侵襲和遷移的影響及作用機制尚未完全明確。微小RNA（microRNA，miRNA）通過與靶基因信使RNA（mRNA）的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）結合引起靶基因mRNA 的降解或翻譯抑制，參與GC 的發(fā)生和發(fā)展［6］。此外，miRNA 也是Cas發(fā)揮抗癌活性的潛在靶點。據報道，Cas可通過上調miR-338-3p 表達促進急性髓系白血病細胞凋亡［7］；在肝癌中，Cas 可通過破壞DNA 甲基轉移酶1 和miR-148a-3p 之間的相互負調節(jié)來抑制肝癌細胞的生物活性［8］?；谝陨涎芯?，筆者推測Cas 在GC 中的抗癌活性可能與miRNA 有關。研究顯示，GC 組織中miR-378 表達下調，與GC 患者的不良預后和臨床病理特征相關；其過表達可抑制GC細胞的侵襲、遷移和上皮-間質轉化（EMT）［9］。生物信息學預測發(fā)現，配對相關同源框1（paired related homeobox 1，PRRX1）與miR-378 存在互補的結合位點，是miR-378 的潛在靶基因。PRRX1 已被報道在GC 中呈高表達，可通過調控EMT 促進GC 淋巴結轉移［10］。然而，miR-378 是否能調控PRRX1 表達介導Cas的抗GC活性還未可知。本研究通過觀察Cas在體外和體內的抗癌活性，探究Cas抑制GC細胞生長和轉移的分子機制與miR-378/PRRX1軸的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 GC 細胞系SGC-7901 購自深圳市華拓生物公司。15 只雄性BALB/c 裸鼠（SPF 級，4 周齡，體質量18～20 g）購自常州卡文斯實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK（蘇）2021-0018。在（22±1）℃、50%±5%濕度、12 h 光照/12 h 黑暗的標準條件下適應性飼養(yǎng)1 周。本研究動物實驗經醫(yī)院倫理委員會批準，批準編號：L2022-（29）號。Cas（原料藥，純度≥98.9%）購自南京春秋生物工程有限公司；miR-378 小干擾RNA（siRNA）慢病毒載體、PRRX1 過表達質粒慢病毒載體、miR-378、U6 引物序列、miR-378 模擬物（miR-378 mimics）及其陰性對照（miR-NC mimics）均由上海吉至生化科技有限公司設計合成；胎牛血清、四唑鹽（MTT）試劑盒、基質膠、RNA 提取試劑、RIPA 裂解液均購自廈門甄準生物技術有限公司；一體化miRNA 熒光定量PCR（qPCR）檢測試劑盒、兔源PRRX1、GAPDH一抗、羊抗兔二抗、雙熒光素酶檢測試劑盒均購自美國MyBioSource 公司；DMEM 培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000 試劑、化學發(fā)光試劑盒購自蘇州極創(chuàng)生物科技有限公司。酶標儀（型號Infinite F200）、顯微鏡（型號ZEISS）、流式細胞儀（型號NanoFCM）、蛋白凝膠成像系統(tǒng)（型號GelView 1500P）均購自上海然哲儀器設備有限公司；Transwell 小室（型號4590）、qPCR儀（型號Esan-Gene 696）均購自天津本生健康科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度Cas 對SGC-7901 細胞活力的影響 SGC-7901 細胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；當細胞生長至80%～90%匯合時，使用胰蛋白酶（含乙二胺四乙酸）消化后進行細胞傳代。采用不同濃度的Cas（0、5、10、20、40、80 μmol/L）［11］處理對數生長期的SGC-7901 細胞，依次將其標記為Cas 0、5、10、20、40 和80 μmol/L 組，每組重復6 次，將處理后的SGC-7901 細胞（1×105個/孔）在12 孔板中傳代培養(yǎng)48 h。然后添加10 μL MTT（5 g/L），并將細胞板在37 ℃下孵育4 h。之后，將200 μL 二甲基亞砜添加到12 孔板中。最后，通過酶標儀檢測光密度（OD）490值，計算細胞活力。細胞活力=Cas各濃度組OD490值/Cas 0 μmol/L組OD490值×100%。

1.2.2 細胞分組及干預 將對數生長期的SGC-7901細胞分成：對照組、Cas 低濃度組、Cas 中濃度組、Cas 高濃度組、Cas高濃度+miR-378 siRNA 組、Cas 高濃度+PRRX1 組、Cas 高濃度+miR-378 siRNA+PRRX1 組。對照組SGC-7901 細胞在DMEM 培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)不進行干預；Cas 低、中、高濃度組分別采用10、20、40 μmol/L 的Cas 處理SGC-7901 細胞；Cas高濃度+miR-378 siRNA 組：采用40 μmol/L 的Cas 處理SGC-7901細胞，并同時轉染miR-378 siRNA慢病毒載體；Cas高濃度+PRRX1組：采用40 μmol/L 的Cas處理SGC-7901細胞，并同時轉染PRRX1 過表達質粒慢病毒載體；Cas 高濃度+miR-378 siRNA+PRRX1 組采用40 μmol/L 的Cas 處理SGC-7901細胞，并同時轉染miR-378 siRNA慢病毒載體和PRRX1過表達質粒慢病毒載體。每組重復6次。

1.2.3 MTT法測定細胞活力 各組細胞培養(yǎng)48 h后，MTT法檢測SGC-7901細胞活力。細胞活力=各處理組OD490/對照組OD490×100%。

1.2.4 集落形成實驗 各組細胞（1×103個/孔）在6孔板中培養(yǎng)2 周，使用4%多聚甲醛固定后用瑞氏-吉姆薩溶液染色。在顯微鏡下計數由至少50個細胞組成的集落。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞經胰蛋白酶消化，重懸于100 μL緩沖液中，加入5 μL Annexin V-FITC，4 ℃孵育15 min，再加入5 μL PI，4 ℃孵育5 min，洗滌后移入流式管，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 Transwell 小室測定細胞侵襲能力 將具有8 μm 聚碳酸酯過濾膜的Transwell 小室上室中預涂30 μg 基質膠，將200 μL 處理后的SGC-7901 細胞（1×105個/mL）添加到上室中，下室中添加500 μL 含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。孵育48 h 后，用棉簽刮去Transwell 小室上表面沉降的細胞，并將沉降在下表面的細胞固定，使用結晶紫染色后在顯微鏡下對下室中侵襲細胞進行拍照并計數。

1.2.7 劃痕實驗測定細胞遷移能力 處理后的SGC-7901細胞接種到24孔板中，當細胞匯合度達80%以上時，使用無菌1 mL移液器尖端輕輕刮擦單層細胞以形成劃痕，然后將細胞用培養(yǎng)基洗滌2 次以去除脫落的細胞，培養(yǎng)48 h。使用顯微鏡拍攝0 h 和48 h 后的劃痕照片，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.8 qPCR 檢測細胞miR-378 表達水平 處理并培養(yǎng)48 h后的SGC-7901 細胞，使用RNA 提取試劑分離總RNA，然后進行逆轉錄反應為cDNA，使用一體化miRNA qRCR 檢測試劑盒和實時PCR檢測系統(tǒng)進行qPCR。獲取循環(huán)閾值（Ct）后通過2-ΔΔCt方法來量化miR-378 表達水平。引物序列：miR-378 上游 5'-CTGCACTGGACTTGGAGTC-3' ，下游5'-GCAGGGTCCGAGGTATTA-3'；內參U6 上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.9 蛋白印跡實驗檢測SGC-7901 細胞PRRX1 蛋白表達水平 SGC-7901 細胞培養(yǎng)48 h 后，采用RIPA 裂解液提取SGC-7901 細胞中的總蛋白質，對蛋白進行定量（90 μg），電泳分離蛋白并轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，將膜與兔源PRRX1（1∶1 090）、GAPDH（1∶1 120）一抗孵育24 h，然后與相應的羊抗兔二抗（1∶1 970）孵育1.5 h。最后使用化學發(fā)光試劑盒使靶向蛋白質可視化，并通過Image J 將蛋白質標準化為內參蛋白的水平。

1.2.10 雙螢光素酶報告基因測定 構建含有miR-378互補結合位點的3'-UTR PRRX1 野生型（WT）和突變型（MUT）的pmirGLO 雙螢光素酶載體，分別命名為PRRX1-WT 和PRRX1-MUT。通過Lipofectamine 2000 試劑將PRRX1-WT或PRRX1-MUT與miR-378 mimics或miR-NC mimics轉染至SGC-7901細胞，然后進行雙螢光素酶報告基因分析。

1.2.11 裸鼠異種移植瘤模型實驗 將BALB/c 裸鼠分為模型組、Cas 組、Cas+miR-378 siRNA 組，每組5 只。模型組、Cas 組裸鼠接種100 μL 未經轉染處理的SGC-7901 細胞（1×106個/只），Cas+miR-378 siRNA 組裸鼠接種100 μL 轉染miR-378 siRNA 的SGC-7901 細胞（1×106個/只）。在腫瘤體積達到100 mm3時，Cas 組、Cas+miR-378 siRNA 組裸鼠腹腔注射10 mg/kg 的Cas（注射體積100 μL）［12］；模型組裸鼠腹腔注射100 μL 生理鹽水；每日注射1 次，連續(xù)14 d。藥物治療結束后，處死所有裸鼠，取出腫瘤組織，計算腫瘤體積并稱質量。腫瘤體積=長×寬2/2。將腫瘤組織勻漿，使用1.2.8中的qPCR 檢測腫瘤組織中miR-378表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 25.0 軟件進行數據分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（）表示，2 組間比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度Cas 對SGC-7901 細胞活力的影響 與Cas 0 μmol/L 組（100.00%±0.00%）相比，Cas 5 μmol/L 組SGC-7901 細胞活力（95.07%±4.29%）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而Cas 10、20、40、80 μmol/L組SGC-7901細胞活力呈濃度依賴性降低（分別為81.12%±7.62%、68.24%±6.53%、52.03%±5.07%、42.13%±4.85%，F=115.368，P＜0.05，n=6），為保證SGC-7901 細胞具有一定的存活數量以進行后續(xù)實驗，故將10、20、40 μmol/L 的Cas 作為后續(xù)研究濃度。

2.2 各組細胞活力、集落形成數量、細胞凋亡率比較 與對照組相比，Cas 低、中、高濃度組SGC-7901細胞活力、集落形成數量依次降低，細胞凋亡率依次升高（P＜0.05）；與Cas 高濃度組相比，Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組和Cas 高濃度+PRRX1 組SGC-7901 細胞活力、集落形成數量升高，細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組相比，Cas高濃度+PRRX1組SGC-7901細胞活力、集落形成數量、細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組和Cas 高濃度+PRRX1 組相比，Cas 高濃度+miR-378 siRNA+PRRX1組SGC-7901細胞活力、集落形成數量升高，細胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖1、2，表1。

Tab.1 Comparison of SGC-7901 cell viability,colony formation number and cell apoptosis rate between the seven groups表1 各組SGC-7901細胞活力、集落形成數量、細胞凋亡率比較（n=6，）

Tab.1 Comparison of SGC-7901 cell viability,colony formation number and cell apoptosis rate between the seven groups表1 各組SGC-7901細胞活力、集落形成數量、細胞凋亡率比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與Cas低濃度組比較，c與Cas中濃度組比較，d與Cas 高濃度組比較，e與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組比較，f與Cas高濃度+PRRX1組比較，P＜0.05。

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Fig.1 Colony formation of SGC-7901 cells in each group(Reich-Giemsa staining,×100)圖1 各組SGC-7901細胞集落形成情況（瑞氏-吉姆薩染色，×100）

Fig.2 Flow chart of SGC-7901 cell apoptosis in each group圖2 各組SGC-7901細胞凋亡流式圖

2.3 各組細胞侵襲和遷移能力比較 與對照組相比，Cas低、中、高濃度組的侵襲細胞數量及劃痕愈合率依次降低（P＜0.05）；與Cas 高濃度組相比，Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組和Cas 高濃度+PRRX1 組侵襲細胞數量、劃痕愈合率升高（P＜0.05）；與Cas高濃度+miR-378 siRNA 組相比，Cas 高濃度+PRRX1 組侵襲細胞數量、劃痕愈合率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組和Cas 高濃度+PRRX1 組相比，Cas 高濃度+miR-378 siRNA+PRRX1 組侵襲細胞數量、劃痕愈合率升高（P＜0.05）。見表2，圖3、4。

Tab.2 Comparison of the number of invasive cells and scratch healing rate of SGC-7901 cells between the seven groups表2 各組SGC-7901細胞侵襲細胞數量和劃痕愈合率比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of the number of invasive cells and scratch healing rate of SGC-7901 cells between the seven groups表2 各組SGC-7901細胞侵襲細胞數量和劃痕愈合率比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與Cas低濃度組比較，c與Cas中濃度組比較，d與Cas 高濃度組比較，e與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組比較，f與Cas高濃度+PRRX1組比較，P＜0.05。

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Fig.3 Invasion map of SGC-7901 cells in the lower compartment of Transwell cell in each group(crystal violet staining,×200)圖3 各組Transwell小室下室中SGC-7901細胞侵襲圖（結晶紫染色，×200）

Fig.4 SGC-7901 cell migration diagram of each group(×100)圖4 各組SGC-7901細胞遷移圖（×100）

2.4 各組細胞miR-378 和PRRX1 蛋白表達水平比較 與對照組相比，Cas 低、中、高濃度組SGC-7901細胞miR-378 表達水平依次升高，PRRX1 蛋白表達水平依次降低（P＜0.05）；與Cas 高濃度組相比，Cas高濃度+miR-378 siRNA 組miR-378表達水平降低，PRRX1 蛋白表達水平升高（P＜0.05），Cas 高濃度+PRRX1 組miR-378 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），PRRX1蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組相比，Cas 高濃度+PRRX1組miR-378表達水平升高（P＜0.05），PRRX1蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Cas 高濃度+miR-378 siRNA+PRRX1組miR-378表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），PRRX1蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與Cas 高濃度+PRRX1 組相比，Cas高濃度+miR-378 siRNA+PRRX1 組SGC-7901 細胞miR-378 表達水平降低，PRRX1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見圖5、表3。

Tab.3 Comparison of miR-378 and PRRX1 protein expression levels between the seven groups of SGC-7901 cells表3 各組SGC-7901細胞miR-378和PRRX1蛋白表達水平比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of miR-378 and PRRX1 protein expression levels between the seven groups of SGC-7901 cells表3 各組SGC-7901細胞miR-378和PRRX1蛋白表達水平比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與Cas低濃度組比較，c與Cas中濃度組比較，d與Cas 高濃度組比較，e與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組比較，f與Cas高濃度+PRRX1組比較，P＜0.05。

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Fig.5 PRRX1 protein blotting of SGC-7901 cells in each group圖5 各組SGC-7901細胞PRRX1蛋白印跡圖

2.5 miR-378 靶向調控PRRX1 表達 Starbase 和miRwalk 網站預測到PRRX1 的3'-UTR 區(qū)域含有miR-378特異性結合的序列，見圖6。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，與miR-NC mimics和PRRX1-WT 共轉染相比，miR-378 mimics 和PRRX1-WT 共轉染熒光素酶相對活性降低（P＜0.05）；miR-NC mimics 和PRRX1-MUT 共轉染與miR-378 mimics 和PRRX1-MUT 共轉染熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

Tab.4 Comparison of relative activity of luciferase between the two groups of SGC-7901 cells表4 各組SGC-7901細胞熒光素酶相對活性比較（n=6，）

Tab.4 Comparison of relative activity of luciferase between the two groups of SGC-7901 cells表4 各組SGC-7901細胞熒光素酶相對活性比較（n=6，）

＊＊P＜0.01。

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Fig.6 Nucleotide sequence of complementary binding of PRRX1 3'-UTR and miR-378 predicted by Starbase圖6 Starbase預測的PRRX1 3'-UTR與miR-378互補結合的核苷酸序列

2.6 Cas在體內發(fā)揮抗腫瘤活性并促進miR-378表達 與模型組相比，Cas組裸鼠腫瘤體積、質量降低，腫瘤組織miR-378 表達水平升高（P＜0.05）；與Cas組相比，Cas+miR-378 siRNA 組腫瘤體積、質量升高，腫瘤組織miR-378表達水平降低（P＜0.05）。見圖7、表5。

Fig.7 Representative pictures of tumor tissue formed in xenotransplantation nude mouse models in each group圖7 各組異種移植裸鼠模型中形成的腫瘤組織代表性圖片

3 討論

3.1 Cas 可抑制SGC-7901 細胞的生物學活性 GC的標準治療包括手術、放療和化療。癌細胞的轉移是導致治療失敗的主要原因之一［1］。鑒于轉移性GC患者的臨床效果較差，故而抑制轉移對于提高生存率至關重要［13］。黃酮類化合物是一種多酚類物質，廣泛存在于食用植物中，具有抗炎、抗病毒、抗血栓、抗菌、抗腫瘤和抗突變等作用。木犀草素是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的天然黃酮類化合物，可通過調節(jié)miRNA在GC中發(fā)揮抗腫瘤活性［14］。槲皮素可調節(jié)多種腫瘤相關的miRNAs，包括miR-16、miR-216等，阻斷腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［15-16］。Cas已被證實在多種癌癥中具有抗腫瘤活性，如口腔癌［17］、食管癌［12］和胃癌［5］等。在本研究中，Cas處理以濃度依賴性方式抑制SGC-7901 細胞增殖。在集落形成和凋亡實驗中，Cas 降低了SGC-7901 細胞的集落形成能力，提高了細胞凋亡率；這進一步證實了Cas在體外可抑制SGC-7901 細胞的生長。此外，Cas 在裸鼠體內可抑制移植瘤的生長。癌細胞遷移和侵襲是腫瘤轉移的關鍵［18］。在本研究中，Cas 降低了SGC-7901細胞侵襲和遷移能力，提示Cas在GC中具有潛在的抗癌作用。

Tab.5 Comparison of tumor volume,tumor weight and miR-378 expression level in tumor tissue ofxenotransplantation nude mice between the three groups表5 各組異種移植裸鼠模型中腫瘤體積、腫瘤質量及腫瘤組織中miR-378表達水平比較（n=5，）

Tab.5 Comparison of tumor volume,tumor weight and miR-378 expression level in tumor tissue ofxenotransplantation nude mice between the three groups表5 各組異種移植裸鼠模型中腫瘤體積、腫瘤質量及腫瘤組織中miR-378表達水平比較（n=5，）

＊＊P＜0.01；a與模型組比較，b與Cas組比較，P＜0.05。

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3.2 Cas 通過調節(jié)miR-378/PRRX1 軸在SGC-7901細胞中發(fā)揮抗癌作用 miR-378 是一種多功能miRNA，參與腫瘤細胞的惡性生物學行為。雖然對miR-378 的研究較多，但其作用仍存在爭議。Jin等［19］研究顯示，miR-378 在食管鱗狀細胞癌中表達降低，低表達的miR-378患者預后更差，且miR-378低表達可促進癌細胞增殖、遷移和侵襲，在食管鱗狀細胞癌的發(fā)生和發(fā)展過程中充當腫瘤抑制因子。Wang等［20］研究表明，miR-378在卵巢癌中充當促癌因子，敲低miR-378可通過直接調控其下游靶基因，減少增殖和遷移相關蛋白來抑制血管生成和卵巢癌細胞的惡性生物學行為。而在GC 中，已被證實miR-378 充當腫瘤抑制因子，上調其表達可通過調控其靶基因抑制GC 細胞侵襲、遷移和EMT 過程［9］。miR-378在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用的原因推測可能與腫瘤類型和其下游靶基因有關。PRRX1 是配對同源框家族的成員之一，其可通過調控多種信號通路（如轉化生長因子-β 通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白通路和Notch 通路）影響腫瘤EMT 的發(fā)生［21］。另外，PRRX1 已被證實為GC 中一種新的EMT 誘導劑，并且PRRX1 可能通過調節(jié)EMT 促進GC 轉移，進而影響患者預后，可作為預測或預防GC轉移的新生物指標［10］。在本研究中，Cas 可上調SGC-7901 細胞中miR-378 表達，抑制PRRX1 表達，并且生物信息學分析和雙螢光素酶報告基因實驗證實PRRX1 是miR-378 的靶基因。為了進一步驗證兩者在Cas 抗腫瘤作用中的功能，本研究在Cas處理的基礎上，用miR-378 siRNA 或PRRX1 過表達質粒轉染SGC-7901 細胞，結果顯示，下調miR-378 表達或上調PRRX1 表達可部分逆轉Cas 對SGC-7901 細胞惡性生物學行為的影響；且下調miR-378 表達聯合PRRX1 過表達可顯著拮抗Cas 對SGC-7901 細胞惡性生物學行為的抑制作用。提示Cas可能通過調節(jié)miR-378/PRRX1 軸抑制SGC-7901 細胞的增殖和轉移。

綜上所述，本研究在體內和體外證明了Cas 對SGC-7901 細胞的抗腫瘤活性，且證實了miR-378/PRRX1 軸可能涉及此過程，從而初步揭示了Cas 抗GC 的分子機制。這對于將Cas 開發(fā)為抗癌藥物奠定了理論基礎。然而，Cas 在其他GC 細胞系中是否具有相同的抗癌活性仍需進一步探討。