李宇翔，李葛，高振芳，侯春梅，韓根成，孫慧燕，王立生

三陰性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌常見的亞型，其雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長因子受體2表達均為陰性［1-2］。TNBC侵襲性高、預后差，其對內(nèi)分泌治療無效，且目前尚無可利用的分子靶向藥物，亟待尋找新的治療方法［3］。間皮素（Mesothelin）是一種分子質(zhì)量為40 ku的細胞表面糖蛋白，在正常組織中很少表達，但在多種惡性腫瘤中高表達［4］。研究發(fā)現(xiàn)Mesothelin 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5］。在TNBC 中，67%的患者過度表達Mesothelin，且與腫瘤分化程度和腫瘤大小呈正相關(guān)，提示其可能是TNBC 新的治療靶點［6］。因此，全面深入地認識Mesothelin對乳腺癌細胞生物學特性的調(diào)控作用，對TNBC 的治療具有重要的臨床意義。目前有關(guān)Mesothelin 在TNBC中的研究多傾向于分析其表達情況與臨床病理特征的關(guān)系，而Mesothelin 對TNBC細胞特定生物學行為影響的研究較少。本研究觀察了Mesothelin 對TNBC細胞系MDA-MB-231細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力等生物學行為的影響，并闡釋其分子機制，旨在為以Mesothelin為靶點的TNBC治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞（雌激素受體及孕激素受體表達陽性）、293T 細胞及HT1080 細胞購自美國ATCC；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素和磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Gibco 公司；Trizol 購自美國Invitrogen 公司；熒光定量PCR 試劑盒購自日本同仁公司；轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白定量試劑盒、ECL 發(fā)光劑、PVDF 膜購自美國Thermo 公司；Annexin V-APC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自天津三箭生物技術(shù)公司；PCR 引物購自上海生工生物工程有限公司；大鼠抗人Mesothelin-APC流式抗體及大鼠抗人Mesothelin免疫組化抗體購自美國R&D Systems 公司；RIPA 裂解液、PMSF、Western blot 制膠液均購自北京索萊寶科技有限公司；Mesothelin 過表達慢病毒質(zhì)粒及對照質(zhì)粒［均攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因序列］購自PPL公司；Transwell小室購自美國Corning 公司；兔抗人抗B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）抗體、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax）抗體購自英國Abcam公司；小鼠抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、兔抗人N-鈣黏蛋白（Ncadherin）抗體、小鼠抗人波形蛋白（Vimentin）抗體、兔抗人Mesothelin 抗體購自美國CST 公司；小鼠抗人α-微管蛋白（α-Tubulin）抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG 抗體購自中杉金橋公司；FACS Calibur 型流式細胞儀購自美國Becton Dickinson 公司；7500 Fast Real-Time PCR 儀購自美國AB Applied Biosystems 公司；Varioskan Flash酶標儀、紫外分光光度計、細胞培養(yǎng)箱及低溫高速離心機購自美國Thermo公司；電泳儀購自美國BIO-RAD公司；熒光顯微鏡和普通光學顯微鏡購自日本Olympus公司；Mesothelin過表達慢病毒及對照病毒由軍事醫(yī)學研究院神經(jīng)免疫與抗體工程實驗室制備。乳腺癌樣本取自6例TNBC手術(shù)患者，樣本使用不對人體造成傷害，不涉及敏感個人信息或商業(yè)利益。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞、293T細胞及HT1080細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗（青-鏈霉素）的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 免疫組織化學染色檢測Mesothelin 表達 將TNBC 腫瘤組織及癌旁組織制成石蠟切片，脫蠟、水化、阻斷、抗原修復、封閉，5%BSA室溫放置30 min，滴加適量Mesothelin抗體，4 ℃孵育過夜。然后用PBS 清洗3 次，二抗室溫孵育1 h。PBS清洗后，滴加適量二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）顯色液5～10 min，滅菌水沖洗5 min。封片后顯微鏡下觀察乳腺癌組織中Mesothelin 蛋白的表達，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件計算每張照片陽性的累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA），并求出面密度，面密度=IOD/AREA。

在蓋玻片上培養(yǎng)MDA-MB-231、MCF-7細胞，用10%中性甲醛固定10 min，滅菌水輕洗10 min，用PBS 洗5 min，3%H2O2室溫封閉10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶，用PBS 洗5 min。正常山羊血清室溫封閉10 min，每張蓋玻片滴加特異性Mesothelin抗體或IgG同型對照抗體，4 ℃孵育過夜。之后用PBS 洗5 min，滴加生物素標記山羊抗鼠、山羊抗兔二抗37 ℃孵育30 min，用PBS室溫下洗5 min，滴加鏈霉卵白素標記的辣根過氧化物酶，37 ℃孵育30 min，PBS 洗5 min，使用DAB顯色30 min，光學顯微鏡下觀察至細胞內(nèi)胞漿陽性顏色（黃棕色）與細胞外背景顏色對比度反差明顯時，提示Mesothelin在細胞內(nèi)表達，用蒸餾水終止反應并拍照。

1.2.3 慢病毒包裝、轉(zhuǎn)染 通過磷酸鹽共沉淀法分別將編碼Mesothelin 慢病毒質(zhì)粒及對照Scramble 質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒（pSPAX2）和包膜質(zhì)粒（pMD2G）一起轉(zhuǎn)染293T 細胞。在轉(zhuǎn)染后24、36、48 h收集培養(yǎng)上清液，并對上清液進行過濾和濃縮制備慢病毒。通過將慢病毒轉(zhuǎn)染HT1080細胞來測定病毒滴度。將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞以1×105個/mL的密度接種到6 孔板中，每孔2 mL。將過表達Mesothelin 慢病毒質(zhì)粒（Mesothelin 組）及對照Scramble 質(zhì)粒（Scramble 組）以5 倍感染復數(shù)（MOI）感染MDA-MB-231 細胞。未感染的MDA-MB-231細胞為Control 組。感染48 h后流式細胞儀檢測病毒的感染效率，GFP陽性細胞為成功感染病毒的細胞。

1.2.4 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測細胞Mesothelin mRNA表達 使用Trizol 法提取3 組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA 后行qPCR 檢測。β-actin 引物序列：上游5'-CATCCTCACCCTGAAGTACCC-3'，下游5'-AGCCTGGATAGCAACGTACATG-3'；Mesothelin 引物序列：上游5'-CTCAACCCAGATGCGTTCTCG-3'，下游5'-AGGTCCACATTGGCCTTCGT-3'。反應體系：2×SYBR SuperMix Plus 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，DEPC 處理水8 μL。反應條件：95 ℃1 min；95 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算Mesothelin的相對表達量。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測Mesothelin表達 收集病毒感染后的MDA-MB-231細胞，PBS輕柔清洗3次，離心棄去上清液。制成1×107個/mL 細胞懸液，然后加入5 μL 人Mesothelin-APC流式抗體，4 ℃避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，加入PBS清洗3次，離心棄上清液，沉淀加入300 μL染色緩沖液重懸后，用流式細胞儀進行檢測Mesothelin表達。

1.2.6 Western blot檢測細胞蛋白表達水平 用RIPA裂解慢病毒感染后的細胞，12 000 r/min 離心10 min 后留取上清液。使用BCA法測蛋白濃度，隨后進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h，之后分別加入Mesothelin（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Ecadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、α-Tubulin（1∶2 000）一抗，4 ℃孵育過夜。次日將PVDF 膜用TBST 洗3 次。隨后分別加入HRP 標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000）或山羊抗鼠IgG（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST 洗3 次，加入ECL 發(fā)光液顯影，并使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并計算條帶相對灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值計算蛋白相對表達水平。

1.2.7 CCK-8 檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的慢病毒感染后的MDA-MB-231細胞，以3×104/mL密度接種到96孔板中，每孔100 μL。空白對照組只加入100 μL 培養(yǎng)基。在37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下分別培養(yǎng)24、48、72和96 h，每個時間點設3 個復孔，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，繼續(xù)孵育4 h后，使用酶標儀在450 nm 波長處檢測光密度（OD）值。細胞增殖率（%）=（該組細胞某時間OD 值-空白對照組OD 值）/（該組細胞0 h OD值-空白對照組OD值）×100%。

1.2.8 細胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期的慢病毒感染后的MDA-MB-231 細胞，以1×105/mL 的密度接種到6 孔板中，每孔2 mL 細胞懸液，每組均設3 個平行孔。置于37 ℃、5%CO2及95%濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h和48 h后，標記Annexin V和PI，室溫避光孵育15 min后，上流式細胞儀進行檢測。細胞凋亡率（%）= Annexin-V+PI-細胞比例（早期凋亡細胞的比例）+Annexin-V+PI+細胞比例（晚期凋亡細胞的比例）。

1.2.9 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 收集各組MDA-MB-231 細胞，以1×105/mL 的密度接種到6 孔板中，每孔2 mL 細胞懸液，每組均設3 個平行孔。置于37 ℃、5%CO2及95%濕度的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，待細胞鋪至90%后，使用200 μL移液槍頭于各孔板正中由上至下垂直劃痕，PBS 沖洗細胞板3 次后，去除脫落細胞。分別在劃痕后0、12、24 h 用光學顯微鏡在同一視野拍照記錄。使用Image J 軟件分析各組MDAMB-231 細胞遷移的面積，計算劃痕愈合率（%）=（初始劃痕面積-某時間點的劃痕面積）/初始劃痕面積×100%。

1.2.10 Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力 對Transwell小室上室底膜面均勻預鋪Matrigel基質(zhì)膠。Transwell小室置于24 孔板中，無血清培養(yǎng)基重懸各組MDA-MB-231 細胞制作細胞懸液，細胞密度1×105個/mL，每組重復3孔。各組取200 μL細胞懸液接種至Transwell小室上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2及95%濕度環(huán)境中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell 小室，PBS 洗2 次，棉簽去除小室上室面未穿膜的細胞，使用4%多聚甲醛固定細胞30 min，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色10 min，于倒置顯微鏡下拍照，隨機讀取3個視野計數(shù)侵襲細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示。2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Mesothelin 在腫瘤組織及細胞系中的表達 免疫組織化學染色顯示，TNBC 腫瘤組織中Mesothelin表達高于癌旁組織（18.83±2.98vs.0.81±0.09；n=6，t=5.512，P＜0.05），見圖1。Mesothelin 在MCF-7 細胞和MDA-MB-231細胞中均有表達，見圖2。

2.2 慢病毒介導MDA-MB-231 細胞對Mesothelin表達的影響 慢病毒感染后Mesothelin 組及Scramble組細胞可見大量綠色熒光，2組慢病毒感染效率均達到90%以上，見圖3。qPCR 結(jié)果顯示，Control 組與Scramble 組細胞內(nèi)Mesothelin mRNA 水平差異無統(tǒng)計學意義；與Scramble 組相比，Mesothelin組細胞內(nèi)Mesothelin mRNA表達水平升高（P＜0.05），見表1。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，Control 組與Scramble 組Mesothelin 陽性細胞比例差異無統(tǒng)計學意義；與Scramble 組相比，Mesothelin 組表達Mesothelin 陽性細胞比例增加（P＜0.05），見圖4A、表1。Western blot 結(jié)果顯示，Control 組與Scramble 組細胞內(nèi)Mesothelin 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；與Scramble 組相比，Mesothelin 組細胞內(nèi)Mesothelin蛋白水平升高（P＜0.05），見圖4B、表1。

Tab.1 Comparison of the proportion of mesothelin positive cells,relative mRNA and protein expression of mesothelin between three groups of MDA-MB-231 cells表1 各組細胞中Mesothelin陽性細胞比例、Mesothelin mRNA和蛋白表達水平比較 （n=3，）

Tab.1 Comparison of the proportion of mesothelin positive cells,relative mRNA and protein expression of mesothelin between three groups of MDA-MB-231 cells表1 各組細胞中Mesothelin陽性細胞比例、Mesothelin mRNA和蛋白表達水平比較 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a 與Control 組相比，b 與Scramble 組相比，P＜0.05；表2—4同。

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Fig.3 Detection of transfection efficiency of lentivirus圖3 慢病毒轉(zhuǎn)染效率的檢測

Fig.4 Lentivirus mediated overexpression of Mesothelin in MDA-MB-231 cells圖4 慢病毒感染MDA-MB-231細胞檢測Mesothelin的表達

2.3 過表達Mesothelin 對MDA-MB-231 細胞的增殖、凋亡的影響 CCK-8 結(jié)果顯示，Control 組與Scramble 組各時間點細胞增殖率差異無統(tǒng)計學意義；與Scramble組比較，Mesothelin組細胞72 h和96 h細胞增殖率升高（P＜0.05），見表2。AnnexinV/PI 染色結(jié)果顯示，Control 組與Scramble 組各時間點細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義；與Scramble 組比較，Mesothelin 組MDA-MB-231細胞24 h和48 h凋亡率降低（P＜0.05），見表3、圖5。Western blot 結(jié)果顯示，Control組與Scramble組細胞Bax及Bcl-2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；與Scramble 組比較，Mesothelin 組Bax 蛋白表達減少，Bcl-2 蛋白表達增加（P＜0.05），見圖6、表4。

Tab.2 Comparison of proliferation in different time points between three groups of cells表2 各組細胞不同時間點增殖率比較（n=3，%，）

Tab.2 Comparison of proliferation in different time points between three groups of cells表2 各組細胞不同時間點增殖率比較（n=3，%，）

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Tab.3 Comparison of apoptosis rate,migration and invasion between three groups of cells表3 各組細胞凋亡、遷移和侵襲情況比較（n=3，）

Tab.3 Comparison of apoptosis rate,migration and invasion between three groups of cells表3 各組細胞凋亡、遷移和侵襲情況比較（n=3，）

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Tab.4 Comparison of relative expression levels of Mesothelin,Bax,Bcl-2,E-cadherin,N-cadherin and Vimentin between three groups of cells表4 各組細胞中Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達水平比較（n=3，）

Tab.4 Comparison of relative expression levels of Mesothelin,Bax,Bcl-2,E-cadherin,N-cadherin and Vimentin between three groups of cells表4 各組細胞中Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達水平比較（n=3，）

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Fig.5 Effect of mesothelin overexpression on the apoptosis of MDA-MB-231 cells圖5 過表達Mesothelin對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

Fig.6 Effect of Mesothelin overexpression on the expression of apoptosis-related protein in MDA-MB-231 cells圖6 過表達Mesothelin對MDA-MB-231細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

2.4 過表達Mesothelin 對MDA-MB-231 細胞遷移、侵襲和EMT 進程的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，Control組與Scramble組12 h及24 h劃痕愈合率差異無統(tǒng)計學意義；與Scramble組比較，Mesothelin組12 h和24 h 劃痕傷口愈合率增加（P＜0.05），見圖7、表3。Transwell實驗結(jié)果顯示，Control組與Scramble組24 h 侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義；與Scramble 組相比，Mesothelin組24 h侵襲細胞數(shù)增加（P＜0.05），見圖8、表3。Western blot 結(jié)果顯示，Control 組與Scramble 組E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 表達差異無統(tǒng)計學意義；與Scramble 組相比，Mesothelin組E-cadherin的表達下調(diào)，而N-cadherin和Vimentin的表達上調(diào)（P＜0.05），見圖9、表4。

Fig.7 Effect of Mesothelin overexpression on the migration of MDA-MB-231 cells(×50)圖7 過表達Mesothelin對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響（×50）

Fig.8 Effect of Mesothelin overexpression on the invasion of MDA-MB-231 cells(Crystal violet staining,×200)圖8 過表達Mesothelin對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

Fig.9 Effect of Mesothelin overexpression on the expression of EMT-related proteins in MDA-MB-231 cells圖9 過表達Mesothelin對MDA-MB-231細胞EMT相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重危害女性身體健康［7］。雖然隨著乳腺癌治療手段的進展，大多數(shù)乳腺癌患者的預后較好，然而仍有部分乳腺癌患者的治療效果很差。特別是TNBC因缺乏受體無法進行內(nèi)分泌治療和分子靶向治療，更容易發(fā)生復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移［8］。因此，探究新的診斷標志物和治療靶點對TNBC患者的治療具有重要意義。

Mesothelin是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤標志物，其通過糖基磷脂酰肌醇錨定于細胞表面，正常表達在體腔表面的間皮細胞，在惡性間皮瘤、胰腺癌和卵巢癌等腫瘤組織中高表達［9-10］，但其在乳腺癌腫瘤細胞生物學特性調(diào)控中的作用還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，Mesothelin 在TNBC 組織表達水平顯著高于癌旁組織。同樣在雌激素受體陽性乳腺癌細胞系MCF-7 細胞和TNBC 細胞系MDA-MB-231 細胞中也檢測到Mesothelin 的表達，提示Mesothelin 可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。為確定Mesothelin 在TNBC 細胞生物學特性中的調(diào)控作用，筆者以MDA-MB-231細胞為模型，利用Mesothelin 慢病毒過表達載體轉(zhuǎn)染MDA-MB-231 細胞，通過qPCR 及Western blot 證實MDA-MB-231 細胞中成功過表達Mesothelin。誘導腫瘤細胞凋亡以及抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移是腫瘤治療的重要途徑［11-12］。精準尋找與腫瘤細胞增殖與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子，并對其進行靶向抑制，對腫瘤的治療策略具有重要的指導意義。本研究證實，過表達Mesothelin 能夠促進MDA-MB-231 細胞的增殖，抑制其凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)細胞高表達間皮素后可促進細胞非錨定生長，抵抗失巢凋亡，并在MDA-MB-231細胞中證實這種抗凋亡機制與凋亡前體蛋白的抑制相關(guān)［13］。Bcl-2 和Bax 是細胞凋亡途徑的關(guān)鍵因子，Bcl-2 具有抑制細胞凋亡的作用，而Bax 通過形成同源二聚體進而誘導凋亡的發(fā)生，Bcl-2/Bax的比值被認為是控制細胞凋亡的開關(guān)，其變化是決定細胞凋亡作用強弱程度的關(guān)鍵因素［14］。本研究發(fā)現(xiàn)Mesothelin能夠抑制Bax的表達，增加Bcl-2表達，發(fā)揮抑制乳腺癌細胞凋亡的作用，這與本研究中細胞增殖實驗、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡實驗的結(jié)果一致，表明Mesothelin可通過抑制乳腺癌細胞凋亡從而促進腫瘤生長。

有研究發(fā)現(xiàn)Mesothelin 與糖類抗原125 結(jié)合介導細胞黏附、促進腫瘤細胞擴散，Mesothelin 在腫瘤細胞表達與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［15］。TNBC 具有易復發(fā)、易轉(zhuǎn)移特點，基于此筆者猜測Mesothelin可能與TNBC的浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究通過劃痕愈合、Transwell侵襲實驗證實Mesothelin能夠明顯增強MDA-MB-231 細胞的遷移和侵襲能力。EMT 途徑是多種腫瘤如乳腺癌、胃癌、肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟［16-18］。本研究發(fā)現(xiàn)過表達Mesothelin 后MDAMB-231 細胞中EMT 途徑的關(guān)鍵分子E-cadherin 蛋白表達水平降低，而N-cadherin 和Vimentin 蛋白表達水平則升高。E-cadherin 是上皮細胞的表面標志物，在細胞-細胞間黏附中發(fā)揮重要作用，參與組織結(jié)構(gòu)的維持［19］。N-cadherin是間質(zhì)細胞的表面標志物，能夠促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［20］。Vimentin 是上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的表面標志物［21］。本研究證實了Mesothelin能在體外促進乳腺癌細胞發(fā)生EMT。

綜上所述，Mesothelin 能夠促進TNBC 細胞增殖，抑制其凋亡，增強細胞的遷移及侵襲能力，可能與其調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白及EMT 過程的關(guān)鍵分子表達有關(guān)。本研究多角度闡釋了Mesothelin 在調(diào)控乳腺癌細胞生物學特性中的作用，為TNBC 的診斷與治療提供了新的思路。