王成程
(來安縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,安徽來安 239000)
植物生長過程涉及3個溫度基點,即最高溫度、最適溫度和最低溫度[1-2]。溫度高于最高溫度或者低于最低溫度時都會成為影響植物生長發(fā)育的不良因素。低溫脅迫是指對植物生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響的低溫,這種不利影響造成的傷害被稱為植物寒害[3],其在影響植物發(fā)育的同時還對植物種植的地理位置分布以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效力產(chǎn)生制約。根據(jù)不同的低溫范圍,將植物寒害分為冷害和凍害[4]。冷害是指冰點以上的低溫對植物生產(chǎn)發(fā)育造成的危害[5]。它一般在小麥生長進(jìn)入孕穗階段發(fā)生,在我國頻發(fā)時段為早春和晚秋,主要會對苗期作物和籽粒作物造成影響。作物遭受冷害后,水稻、玉米常表現(xiàn)為爛籽、硬苗不發(fā),甚至死苗,小麥則莖葉無異,麥穗全部或部分受害,表現(xiàn)為延遲抽穗或抽出空白穗等。全球變暖帶來的多為暖冬,小麥拔節(jié)后進(jìn)入孕穗階段,此時小麥含水量高、組織較幼嫩,對突然的低溫更敏感,抵抗能力變?nèi)?。凍害是指冰點以下低溫使植物細(xì)胞內(nèi)或組織結(jié)冰造成的損害,分為冬季凍害和春霜凍害,前者特點為細(xì)胞失壓,葉綠素被破壞,葉片由綠色變?yōu)楹稚?,其發(fā)生概率低,程度弱,地下部分幾乎未受影響,苗死率低;后者為受寒潮溫度降低影響,損害程度因發(fā)育階段而有所不同。例如,進(jìn)入雌雄分化期的小麥,受凍后植物胞體分散,幼穗萎縮,而剛進(jìn)入小花分化期的小麥,受凍后幼穗依然為晶體透明狀,這也解釋了為什么會出現(xiàn)部分穗子受凍及早播小麥較晚播小麥?zhǔn)芎Τ潭却蟮那闆r。寒害在世界很多地方時有發(fā)生,這種非生物脅迫對很多作物都造成了不同程度的傷害,同時約束了它們的種植分布區(qū)域,大大限制了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[6]。因此,探索植物在低溫條件下的運(yùn)行機(jī)制,提高其抗寒性能,在農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)上意義重大。
為了應(yīng)對各種逆境,植物在長期進(jìn)化中形成了非常復(fù)雜的反應(yīng)機(jī)制,植物接收逆境信號[7],表現(xiàn)為一系列的蛋白、生理生化以及形態(tài)變化從而生成特定的代謝途徑。細(xì)胞中包括細(xì)胞膜、線粒體、葉綠體等細(xì)胞器,每個細(xì)胞器也都有屬于自己的生物膜,生物膜使細(xì)胞器相互獨(dú)立,穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境下它們又是一個整體,彼此之間緊密聯(lián)系。細(xì)胞膜在細(xì)胞及細(xì)胞器與環(huán)境二者之間起著橋梁紐帶的作用。當(dāng)細(xì)胞遭遇逆境時,最先感知到的是細(xì)胞膜,所以細(xì)胞膜在生物體正常發(fā)育生長過程中起著舉足輕重的作用。植物細(xì)胞受到機(jī)械損傷或者細(xì)胞失水等傷害,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞,從而導(dǎo)致植物本身損傷甚至死亡。例如,對冰凍最敏感的細(xì)胞膜受到寒害威脅時,葉綠體和膜結(jié)構(gòu)被破壞,葉綠素解離,光合磷酸化(ATP 酶)失去活性,光合作用抑制被破壞。同時有研究表明,植物遇到低溫?fù)p害時,生物膜的物理性質(zhì)即膜脂物相由液晶相變?yōu)槟z相。有學(xué)者提出植物低溫寒害引起膜脂物理性質(zhì)的改變,他們認(rèn)為植物在遭受低溫傷害時,生物膜先發(fā)生膜脂的物相變化[8],這時膜脂從液晶相變?yōu)槟z相,其上的脂肪酸鏈排序發(fā)生變化,原生質(zhì)流動受影響,膜的透性增加[9],造成可溶性物質(zhì)外滲,物質(zhì)的交換與運(yùn)輸被影響;膜上的結(jié)合酶結(jié)構(gòu)變化,導(dǎo)致細(xì)胞生理生化代謝功能紊亂[10]。細(xì)胞壓驟減、細(xì)胞液泡改變等造成植物體的損傷。另外,膜分子探針技術(shù)的研究是解釋膜物相改變進(jìn)而引起植物寒害現(xiàn)象的強(qiáng)有力證據(jù)。在特定植物的細(xì)胞膜上用膜分子探針去標(biāo)記,研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的分子在外界溫度低到某個值時運(yùn)動速度驟減,這表明對于特定的植物是存在寒害臨界溫度的,當(dāng)外界溫度低于臨界溫度,膜物相改變,細(xì)胞代謝紊亂,植物遭受寒害。研究發(fā)現(xiàn),抗寒性較高的植物其膜磷脂不飽和度較高,在溫度較低時依然維持流動,致使細(xì)胞膜物相改變的溫度比抗寒性較低的植物低[11]。而膜凝脂的不飽和度與植物的生理特性密切相關(guān),當(dāng)?shù)蜏貋硪u,膜凝脂能阻止細(xì)胞物相改變,讓它維持液晶相,從而持續(xù)流動,繼續(xù)行使它的生理功能,阻止了低溫對細(xì)胞膜的傷害,保護(hù)植物免于寒害[12],但存在另外一種解釋,即膜蛋白與膜脂之間相互關(guān)系可能是膜穩(wěn)定性提高的主要因素,而不是膜脂脂肪酸的不飽和度。有研究者試驗證實質(zhì)膜穩(wěn)定性與小麥抗寒性密切相關(guān),抗逆強(qiáng)的植物在低溫下膜結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。植物在生長進(jìn)化過程中為了應(yīng)付低溫帶來的傷害進(jìn)化出不同的抗寒力。研究證實這一過程與植物抗寒性有關(guān)[13]。冷馴化的保護(hù)機(jī)制是其中最重要的,即植物經(jīng)過非凍低溫后抗寒能力增加。在自然環(huán)境中,表現(xiàn)為越冬小麥在秋季經(jīng)受低溫鍛煉后能更好地抵抗寒冷的冬季。植物低溫?zé)捗绾罂购芰μ岣?,是因為低溫鍛煉穩(wěn)定了膜的結(jié)構(gòu),提高了膜的冷穩(wěn)定性[14]。
植物擁有自我運(yùn)行的防御系統(tǒng),例如,植物體內(nèi)活性氧積累與清除的平衡系統(tǒng),這一系列系統(tǒng)維護(hù)了機(jī)體的正常功能。一般條件下,積累與清除系統(tǒng)是平衡的,但當(dāng)植物遭遇低溫、鹽等不利條件時,活性氧積累加快,產(chǎn)生大量的自由基,而相應(yīng)的活性氧清除能力減弱。其中,有些自由基,如LOO—利用細(xì)胞膜鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng),促使細(xì)胞膜的物相發(fā)生變化,細(xì)胞膜不穩(wěn)定,從而影響植物的抗寒性;另外,植物機(jī)體在遭遇逆境時有相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng),當(dāng)逆境來襲時,刺激自由基積累增加,而機(jī)體為了清除過多的自由基,避免傷害則對應(yīng)形成抗氧化系統(tǒng),增加清除自由基的能力。提高植物對逆境的耐受能力。如一些抗氧化酶:超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等[15],這幾種抗氧化酶是專門用來清除植物體內(nèi)過多的自由基O2-和H2O2的。逆境條件下,植物體啟動自身防御系統(tǒng),對不利環(huán)境做出應(yīng)答反應(yīng),超氧化物歧化酶作為第一道防守線首先清除O2-,所以無論是人為添加SOD還是提高植物體自身的SOD含量,都可以提高植物的抗寒性。有研究者在馬鈴薯抗寒性研究中證實了這一理論:過氧化物酶是調(diào)節(jié)植物體內(nèi)H2O2含量的重要酶之一,將植物體內(nèi)自身過多產(chǎn)生的H2O2或者SOD 清除O2-自由基時產(chǎn)生的過多H2O2清除,保護(hù)機(jī)體免受傷害。
當(dāng)植物遭遇逆境時,對水分的吸收大大受到影響,易造成細(xì)胞缺水。因為低溫時,植物細(xì)胞的透過性差,容易造成胞內(nèi)水分子流失,細(xì)胞的胞液濃度增加,為了避免這種傷害,機(jī)體會積極地去積累一些可溶性物質(zhì),增加細(xì)胞吸水的能力,維持正常的代謝功能。
有3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是植物抗逆研究的重要內(nèi)容[16]。首先是可溶性糖,其為植物光合作用的主產(chǎn)物,是機(jī)體能量儲存的方式,同時為機(jī)體生命活動提供支持。可溶性糖在植物抗逆方面的作用主要體現(xiàn)在低溫條件下,可溶性糖快速積累,細(xì)胞的持水能力增加[17],細(xì)胞液濃度升高,細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)體流動性增大,冰點下降,防止細(xì)胞因低溫失水造成膜相變化,保護(hù)植物。這一理論在樹種、苜蓿根、葡萄、小麥等研究中都已經(jīng)過證實。在樹種研究中,隨著溫度降低,可溶性糖含量增加,同時發(fā)現(xiàn)抗寒性高的樹種較抗寒性低的樹種有較高的可溶性糖[18];在苜蓿研究中,隨著溫度的降低,苜蓿根中可溶性糖含量一直增加且增加的趨勢逐漸平緩[19];在葡萄的研究中,環(huán)境溫度降低,不同抗寒性葡萄品種的可溶性糖含量都逐漸增加,其中在低溫條件下抗寒性強(qiáng)的品種和抗寒性弱的品種可溶性糖的含量都有不同程度增加,但是抗寒性強(qiáng)的品種增加幅度大[20];在小麥研究中,分別測量小麥葉片、分蘗節(jié)的可溶性糖含量,發(fā)現(xiàn)抗寒品種中其比值明顯高于不抗寒品種。其次是可溶性蛋白,大量植物研究表明其與抗寒性之間關(guān)系密切[21]。低溫時,可溶性蛋白量增加,可能是低溫刺激機(jī)體保護(hù)機(jī)制,合成了大量的保護(hù)性蛋白,以維持細(xì)胞正常運(yùn)行。這種可溶性蛋白能提高細(xì)胞吸水以及抗脫水的能力,不會讓細(xì)胞因缺水結(jié)構(gòu)變形,影響正常功能。用同位素標(biāo)記的方法來驗證發(fā)現(xiàn)低溫處理后,植物中用于蛋白質(zhì)合成的35S 和14C-亮氨酸的量明顯增加,且在抗寒性高植物中更顯著,可溶性蛋白與抗寒性成正比[22]。最后是脯氨酸,水溶性,一般以游離狀態(tài)存在,是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)之一,它的親水端結(jié)合水,疏水端與蛋白質(zhì)結(jié)合,將水分結(jié)合到蛋白質(zhì)上。低溫條件下脯氨酸含量增加,更多的水分聚合到蛋白質(zhì)上,阻止了蛋白質(zhì)因低溫失水而變形,從而保護(hù)植物。有研究者研究小麥葉片低溫下脯氨酸的含量變化,得出不同品種小麥葉片脯氨酸都有所增加,且增加量彼此之間差異極大。同時又有研究者研究水稻低溫下脯氨酸的含量變化,得出不同品種水稻脯氨酸含量無明顯變化,所以針對脯氨酸對植物抗寒性的影響還存在異議[23]。
在植物抗逆信號傳遞機(jī)理方面,Ca2+和脫落酸系統(tǒng)的研究最多。Ca2+在各膜系統(tǒng)中是分布穩(wěn)定的。Ca2+梯度會產(chǎn)生鈣信號,是植物信號傳導(dǎo)過程的重要信使[24]。當(dāng)細(xì)胞遭遇逆境時,Ca2+梯度的這種穩(wěn)定狀態(tài)會改變,針對不同的逆境刺激,其濃度變化會產(chǎn)生特定的生理變化。
植物生長發(fā)育分化過程受到激素調(diào)控。脫落酸(ABA)是加速脫落、作用胚發(fā)育的植物內(nèi)激素,同時也是會對植物逆境過程產(chǎn)生反應(yīng)的逆境激素。在受到低溫、高溫等逆境時,ABA大量積累或是已存在的ABA 被重新分布,某些部位的ABA 濃度急劇升高。濃度增加的ABA 會刺激一些冷脅迫基因的表達(dá)。冷脅迫基因在沒有ABA 時可能不表達(dá)或表達(dá)量很少。同時,外源的ABA也能誘發(fā)這些冷脅迫基因的表達(dá),起到內(nèi)部ABA相同的作用。用ABA和其他非生物脅迫處理擬南芥之后,擬南芥中1/2基因的表達(dá)都發(fā)生了改變。
小麥的抗寒力是由多種基因共同作用的綜合性狀,是潛在遺傳的,只有經(jīng)過一段時間的冷馴化(2~6 ℃)[8],冷脅迫基因和冷蛋白才能被誘導(dǎo)表達(dá),進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為應(yīng)對低溫的抵抗能力,所以在小麥抗寒過程中這些編碼和調(diào)控信號蛋白的基因作用顯著。
CBF是AP2/ERF家族的一員。AP2/ERF家族在各種植物中分布廣泛,對抵抗各種逆境如高溫、干旱等都有重要作用。植物遭遇低溫時,細(xì)胞膜接收到低溫信號后進(jìn)行信號傳導(dǎo),細(xì)胞會發(fā)生一系列理化反應(yīng)和代謝調(diào)控[25]。CBF調(diào)控就是眾多調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一員。從擬南芥中克隆出的4 個CBF 因子,最初被證明與植物抗寒力有關(guān)。后來經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),CBF基因的超表達(dá)能提高植物對寒害的承受力,轉(zhuǎn)CBF的植株抗寒力比正常植株強(qiáng)。
植物在遭遇低溫時,會通過體內(nèi)各種調(diào)控模式來避免傷害。轉(zhuǎn)錄因子能特定結(jié)合到DNA 序列上從而抑制或者刺激RNA轉(zhuǎn)錄。COR是冷脅迫蛋白,在植物遇到低溫、干旱等逆境時會被誘導(dǎo)[26]。ICECBF-COR 是目前研究較多的抗寒調(diào)控途徑。低溫時,ICE 結(jié)合到CBF 的啟動子區(qū)域,激活CBF 的表達(dá),CBF 結(jié)合到COR 基因上游啟動子的DRE 序列上,激活COR基因的表達(dá)。有研究者克隆出COR25基因,導(dǎo)入擬南芥后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥在低溫下的表現(xiàn)力較對照組樣品有較好的耐受性。另有研究者利用轉(zhuǎn)ICE1基因擬南芥,發(fā)現(xiàn)ICE1對CBF3起正向調(diào)節(jié)作用的同時,轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性大大提升。
WRKY 含有一段保守的氨基酸序列,最先是從白薯中克隆得到的,后面又陸續(xù)從別的植物中獲得。WRKY 的保守區(qū)域與所調(diào)控的基因的W-box 結(jié)合,同時也可以與自身的W-box結(jié)合,對本身進(jìn)行調(diào)控。在小麥、番茄等材料中,采用生物、分子等手段深入研究WRKY的功能機(jī)理,發(fā)現(xiàn)WRKY基因在抗寒方面有重要貢獻(xiàn),不良環(huán)境誘導(dǎo)WRKY 的表達(dá),同時WRKY 是一個基因家族,其有很多轉(zhuǎn)錄因子,例如WRKY33 和WRKY5 等,每個WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在相同的環(huán)境下所起的作用不同,同一個轉(zhuǎn)錄因子在不同的環(huán)境下表達(dá)作用也是不同的,有的起主要作用,有的不起作用。
DHN 即脫水蛋白,結(jié)構(gòu)上含較多的甘氨酸,親水,保守區(qū)有3 個片段,保守性強(qiáng),其中K 片段能為DHN的一個重要的親脂結(jié)構(gòu)提供幫助,同時也因其可以與一些變性蛋白質(zhì)結(jié)合作用從而阻止變性的繼續(xù)發(fā)生;合成的DHN 屬于植物蛋白,一般在植物遭遇逆境、人工ABA 處理時合成,也是一類誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白。研究證實DHN 在細(xì)胞脫水時含量大量增加,同時發(fā)現(xiàn)提取DHN 時,其經(jīng)常是一種與糖物質(zhì)共存的復(fù)合物,而且這種蛋白與糖的結(jié)合防止細(xì)胞脫水的能力更強(qiáng),可能DHN的調(diào)控途徑就是通過結(jié)合糖或者其他物質(zhì),而不是單獨(dú)起作用。
植物抗寒性是一個綜合狀態(tài),是內(nèi)因外因等共同因素的影響結(jié)果。因此,鑒定植物抗寒性需要一個合理準(zhǔn)確的方法,近年來不少專家和學(xué)者從不同時期、不同方面進(jìn)行了越來越深入研究,提出在田間或?qū)嶒炇夷M把小麥生理、生化、形態(tài)等方面作為鑒定小麥抗寒性的指標(biāo),提出了一些鑒定的方法。
田間小麥抗寒性鑒定主要是記錄在田間自然條件下植物不同生長發(fā)育期的抗寒能力。一般認(rèn)為此方法可信度高[27]。本文研究的是小麥越冬期的抗寒性情況,返青率為記錄指標(biāo)。在小麥越冬期,白天平均氣溫在0 ℃左右,此時小麥葉片生長停滯,在這時期,一般會查苗、間苗,移密補(bǔ)稀,此時移栽成活率高;根據(jù)情況施肥料,以保證越冬期后小麥的正常生長。具體的生長情況與苗情、氣候關(guān)系密切。越冬期的小麥由于經(jīng)歷了溫度逐漸降低的過程,體內(nèi)積累了大量的糖、蛋白,細(xì)胞冰點降低,植物抗寒性相對升高。小麥不同時期對寒害的表現(xiàn)力不同,抗寒力不同。小麥在越冬期對寒害的表現(xiàn)特征顯著,一般為葉片受凍失水、黃褐色。根據(jù)小麥越冬期葉片受凍情況劃分為5 個等級:1 級無凍害;2 級葉尖受凍;3 級葉片一半以上受凍;4 級葉片全部受凍;5 級植株死亡。
(1)生態(tài)指標(biāo):溫度是影響抗寒性的首要因素。有研究者用半致死溫度(冰凍返青、人工氣候模擬)來表示小麥對寒害的承受能力。另有研究者提出把電解質(zhì)滲出一半的溫度作為鑒定標(biāo)準(zhǔn),鑒定低溫下各品種小麥的抗寒力。
(2)形態(tài)指標(biāo):寒害來襲時,小麥組織、發(fā)育情況、生長等級等形態(tài)特征都明顯不同,把這一特征作為鑒定指標(biāo)是科學(xué)合理的。植物組織器官受凍褐變,程度因凍害等級而異,有研究者指出低溫時小麥幼苗分藥減少、葉心卷曲、枯萎;植物生長過程中,其生命力特征因植物休眠與否而表現(xiàn)不同,有的能看出生長變化,有的則不能,有研究者指出隨著低溫的持續(xù)影響,種子萌發(fā)趨勢不明顯,幼苗期干物質(zhì)的積累程度差異顯著。
(3)生理生化指標(biāo):小麥對低溫的反應(yīng)還表現(xiàn)為理化特性的不同。有研究者根據(jù)植物細(xì)胞應(yīng)對低溫的一系列反應(yīng),把細(xì)胞抽提物pH、電導(dǎo)率、脯氨酸含量、葉綠素含量等作為鑒定的參數(shù)。