史天茜，石永輝，武新穎，張益豪，秦哲，趙春霞，路達

（河北大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，河北 保定 071002）

傳統(tǒng)硝化反硝化脫氮工藝存在污泥產(chǎn)量高、有機碳需求量大、二次污染等問題。一種極具發(fā)展前景的生物脫氮技術(shù)厭氧氨氧化（Anammox）工藝因具有高效、經(jīng)濟、環(huán)保等優(yōu)點，被越來越多的污水處理廠引進使用[1-3]。由于厭氧氨氧化細菌（AnAOB）倍增時間長（11～20d）[4]、對環(huán)境因素敏感（金屬[5]、溫度[6]、底物濃度[7]），限制了其在污水處理廠的進一步應(yīng)用。

鐵是環(huán)境中常見的金屬元素之一，是大多數(shù)生物生長必不可少的營養(yǎng)元素[8]。鐵對AnAOB 的生長、繁殖尤為重要。AnAOB 中含有大量鐵結(jié)合蛋白（如血紅素c），是其進行生理代謝不可缺少的成分，能保證Anammox 過程的正常進行。此外，鐵還能影響胞外聚合物（EPS）分泌，改變AnAOB活性。可見，F(xiàn)e2+會影響Anammox反應(yīng)器的脫氮性能。Ding 等[9]比較了不同F(xiàn)e2+濃度對細菌繁殖的影響，發(fā)現(xiàn)Fe2+為0.12mmol/L 時對AnAOB 生長促進效果最好。Mak 等[10]研究了Fe2+對Anammox 的短期影響，發(fā)現(xiàn)0.08mmol/L Fe2+最有利于AnAOB 活性增強。Zhou等[11]發(fā)現(xiàn)進水基質(zhì)濃度不變時，低濃度Fe2+能夠增強Anammox反應(yīng)器穩(wěn)定性。但這些文章主要研究一定的基質(zhì)濃度下Fe2+對Anammox系統(tǒng)的影響，少有人探究Fe2+對反應(yīng)器提高氮負(fù)荷的作用以及Fe2+對AnAOB的生理影響。

文章主要研究不斷提升氮負(fù)荷時，不同濃度的Fe2+對Anammox 膨脹顆粒污泥床（EGSB）反應(yīng)器脫氮性能、細菌生理變化及表面形態(tài)的影響，尋找Fe2+最適投加量，確定Fe2+與EPS、血紅素c 的關(guān)系，深入了解細菌的生理變化，這將有助于培養(yǎng)高性能Anammox 污泥，優(yōu)化Anammox 工藝，推進實際應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 接種污泥和合成廢水

接種污泥取自實驗室已穩(wěn)定運行300d的EGSB反應(yīng)器。接種后每個反應(yīng)器中初始混合液懸浮固體(MLSS)質(zhì)量濃度為(370±16)mg/L、混合液揮發(fā)性懸浮固體（MLVSS）質(zhì)量濃度為(297±13)mg/L。

每日處理4L 合成廢水，以NH4Cl 和NaNO2充當(dāng)?shù)矗∟H+4-N∶NO-2-N=1∶1.32），添加CaCl20.150g/L、 KH2PO40.010g/L、 MgSO40.300g/L、NaHCO30.050g/L。另外，每升中分別加入1mL微量元素Ⅰ和Ⅱ。微量元素Ⅰ組成：乙二胺四乙酸二鈉（EDTA 2Na）5.00g/L。微量元素Ⅱ組成：ZnSO4·7H2O 0.430g/L， H3BO40.014g/L， CuSO4·5H2O 0.250g/L， CoCl2·6H2O 0.240g/L， MnCl2·4H2O 0.990g/L， NaMoO4·2H2O 0.220g/L， NiCl2·6H2O 0.190g/L，EDTA 2Na 19.100g/L。進水中通N2使溶解氧（DO） 濃度控制在0.100mg/L 以下，使用H2SO4或NaOH將進水pH調(diào)整為8.00±0.05。水力停留時間（HRT）為24h。

1.2 Anammox反應(yīng)器和實驗操作

采用4 個工作容積為4L 的EGSB 反應(yīng)器（R1、R2、R3、R4），結(jié)構(gòu)見圖1。反應(yīng)器由有機玻璃制成，外部用錫紙包裹避免光照，并配備恒溫水套保持溫度為(35±1)℃，使用蠕動泵將反應(yīng)器內(nèi)基質(zhì)混合均勻。

圖1 EGSB反應(yīng)器結(jié)構(gòu)圖

圖4 反應(yīng)器Anammox反應(yīng)化學(xué)計量比變化

實驗過程中，通過投加FeSO4·7H2O，使R1、R2、R3、R4 反應(yīng)器內(nèi)Fe2+濃度分別為1.00mg/L、5.00mg/L、7.50mg/L、10.00mg/L。逐漸提升氮負(fù)荷，當(dāng)出水NO-2-N 濃度連續(xù)5d 大于50.00mg/L 時，認(rèn)為反應(yīng)器性能受到嚴(yán)重抑制，停止運行。

1.3 常規(guī)分析方法

每日采集水樣進行檢測，其中NH+4-N 采用納氏試劑分光光度法測定，NO-2-N 使用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，NO-3-N使用酚二磺酸分光光度法，F(xiàn)e2+檢測采用鄰菲啰啉分光光度法[12]。pH 和DO 使用哈希-HQ40d 型便攜式pH 溶氧儀測定，MLSS與MLVSS在第36d采用重量法測定。

1.4 EPS的提取與分析

運行的第36d，采集4 個EGSB 反應(yīng)器充分混合后的污泥，使用熱提取法提取EPS[13]。EPS 含量（mg/g VSS）為多糖（PS）與蛋白質(zhì)（PN）之和。其中PS 采用蒽酮比色法[14]測量，PN 采用改進的Lowry法[15]測量。

1.5 血紅素c的測定

收集EGSB 反應(yīng)器在第36d 的混合污泥樣品，采用吡啶分光光度法[16]對兩個反應(yīng)器的污泥進行血紅素c含量的檢測。具體步驟為：樣品經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗、超聲和離心后加入連二亞硫酸鈉和鐵氰化鉀，采用紫外可見分光光度計，測得550nm和535nm之間的吸光度差異，計算出血紅素c濃度（μmol/mg pro）。

1.6 掃描電子顯微鏡（SEM）

反應(yīng)器在第36d的混合污泥樣品用去離子水洗滌3次，離心后去掉上清液，然后用2.50%戊二醛溶液在4℃下固定24h，保證細胞形態(tài)不發(fā)生改變。再用無菌水洗滌3次并離心，之后用梯度乙醇水溶液 （30%、 50%、 70%、 80%、 90%、 100%、100%）對細菌進行逐級脫水處理，棄掉上清液。在室溫下自然脫水干燥后， 使用SEM（PHENOMPROX，荷蘭）觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe2+對反應(yīng)器脫氮性能的影響

此外，4 個反應(yīng)器的MLSS 變化見圖5。R0 為接種污泥的MLSS，運行36d 后R1 中MLSS 出現(xiàn)負(fù)增長，降低到284mg/L，反應(yīng)器內(nèi)污泥上浮嚴(yán)重。這說明逐漸提高進水氮負(fù)荷時，1.00mg/L 的Fe2+不利于AnAOB 生存和繁殖。而R2、R3、R4 反應(yīng)器MLSS均呈現(xiàn)增長趨勢，其增長量R3（367mg/L）＞R2（192mg/L）＞R4（175mg/L）。可見反應(yīng)器內(nèi)投加7.50mg/L 的Fe2+最有利于AnAOB 適應(yīng)基質(zhì)變化，細菌增殖最快，有助于抵抗高氮負(fù)荷沖擊。

圖5 反應(yīng)器MLSS變化

如圖6，在進水NH+4-N、NO-2-N 濃度分別為130mg/L 和172mg/L 時，對比不同F(xiàn)e2+濃度對反應(yīng)器脫氮性能的影響，檢測4 個反應(yīng)器在24h 內(nèi)NH+4-N、NO-2-N濃度變化情況。由于初期反應(yīng)器內(nèi)TN 濃度較高，細菌易獲得基質(zhì)，因此4 個反應(yīng)器前4h NH+4-N 和NO-2-N 的降解速度接近。隨著反應(yīng)器內(nèi)TN濃度逐漸降低，5h后降解速度出現(xiàn)明顯差別。R2、R3、R4 的NH+4-N 降解速度均大于R1。NO-2-N 降解速度由快到慢為R3＞R2＞R4＞R1。隨著Fe2+濃度從1.00mg/L 增加到7.50mg/L，反應(yīng)器內(nèi)基質(zhì)降解速度逐漸增加，脫氮能力提高；當(dāng)Fe2+濃度進一步提高到10.00mg/L，基質(zhì)降解速度減慢，反應(yīng)器性能降低。

圖6 4個反應(yīng)器NH4+-N和NO2--N濃度隨時間變化的分布

2.2 Fe2+對EPS的影響

EPS是細菌分泌的一種黏性物質(zhì)[18]，是AnAOB的重要組成部分，在促進顆粒形成、抵抗外界環(huán)境變化、提高污泥沉降性能、維持系統(tǒng)穩(wěn)定性等方面發(fā)揮著重要作用[19]。同時，EPS 中的羥基、羧基等陰離子官能團吸附環(huán)境中的Fe2+[11]，有利于細菌利用Fe2+，加快細菌生理活動，產(chǎn)生更多含鐵蛋白質(zhì)，提升對基質(zhì)代謝和不利環(huán)境的抵抗能力。并且EPS 吸附的Fe2+還能發(fā)揮壓縮雙電層作用，從而降低細菌間的靜電斥力[8]，促進造粒。

不同F(xiàn)e2+濃度下EPS 的變化情況如圖7 所示，當(dāng)Fe2+濃度為1.00mg/L 時，系統(tǒng)內(nèi)Fe2+濃度無法滿足AnAOB 實際需求量，營養(yǎng)物質(zhì)不足使代謝作用受到影響，細菌活性較低，減少了EPS分泌，導(dǎo)致R1 的EPS 含量最低，為179mg/g VSS。此時R1 對基質(zhì)的代謝能力最差。Fe2+濃度為5.00mg/L 時，AnAOB從外部環(huán)境中獲得了較多的Fe2+參與生理活動，EPS 含量明顯增加到240mg/g VSS，細菌活性增強，相較于R1，R2 脫氮性能明顯提高。當(dāng)Fe2+含量增加到7.50mg/L，EPS 到最高值242mg/g VSS。Gao 等[20]也發(fā)現(xiàn)Fe2+能促進EPS 生成并提高脫氮性能。此外，F(xiàn)e2+屬于還原性物質(zhì)，有利于維持反應(yīng)器中厭氧環(huán)境[21]。因此，F(xiàn)e2+濃度最佳時，營造了最適宜的生存環(huán)境，促進Anammox 過程和細胞代謝，加快生物量增長，刺激EPS大量分泌，為微生物提供更多的胞外養(yǎng)分和酶[22]，增強細胞活性[20,23]，提高系統(tǒng)穩(wěn)定性，使得R3 脫氮性能高于其他反應(yīng)器。Fe2+濃度增加到10.0mg/L 時，EPS 降低到202mg/g VSS。由于Fe2+具有不可降解特性[11]，鐵的過量積累抑制了AnAOB 活性，減少了EPS 合成，降低了R4反應(yīng)器性能。

圖7 4個反應(yīng)器中EPS含量變化情況

PN/PS是反映污泥沉降性能的重要指標(biāo)，比值越高污泥沉降性能越差[24]、強度越低，污泥越容易流失，導(dǎo)致反應(yīng)器性能不穩(wěn)定。圖7 中隨著Fe2+濃度從1.00mg/L 增加到7.50mg/L，PN/PS 值呈下降趨勢，從最大值2.88降低到最小值1.10。且7.50mg/L時PS含量最高，而PS對污泥的聚集作用及沉降性能等方面的影響比PN 更大[25-26]。因此Fe2+濃度為7.50mg/L時，能夠改變EPS的組成，使得污泥沉降性能最好、強度最高，有助于保留生物量，反應(yīng)器脫氮性能得到提升。當(dāng)Fe2+濃度增加到10.00mg/L后，過量的Fe2+使PN/PS 的比值明顯上升到2.59，污泥沉降性能及聚集能力降低，影響AnAOB 對基質(zhì)的去除能力。

2.3 Fe2+對血紅素c的影響

血紅素c 能夠通過Anammox 合成，是AnAOB進行代謝作用必須的一種物質(zhì)，有助于AnAOB 維持正常形態(tài)。此外，細胞內(nèi)供能、調(diào)節(jié)、生長等活動都離不開蛋白質(zhì)，而與血紅素c相關(guān)的蛋白質(zhì)占AnAOB 總蛋白量的38%[27]，因此血紅素c 對維持AnAOB活性具有重要作用。

各反應(yīng)器中血紅素c 濃度變化情況如圖8 所示。在1.00～7.50mg/L 范圍內(nèi)隨著Fe2+濃度增加血紅素c 含量逐漸提高，從1.18μmol/mg pro 達到3.76μmol/mg pro。AnAOB 的代謝依賴于聯(lián)氨合成酶（HZS）、聯(lián)氨脫氫酶（HDH）等酶，這些酶的形成與血紅素c 密切相關(guān)，而血紅素c 的合成需要嵌入Fe2+，從而形成活性區(qū)[28]，提高AnAOB 活性。此外，血紅素c通過與蛋白質(zhì)主鏈共價結(jié)合，在電子轉(zhuǎn)移和催化中發(fā)揮著非常重要的作用[29]，能促進Anammox反應(yīng)進行?？梢?，適宜的Fe2+（7.50mg/L）能促進血紅素c形成，增強細胞活性，提升AnAOB對環(huán)境中Fe2+的利用效率[30]，加快Anammox 過程，增強基質(zhì)代謝能力。但Fe2+濃度增加到10.00mg/L后，過量的Fe2+在反應(yīng)器中積累，產(chǎn)生毒性作用減弱了AnAOB進行代謝等生理活動，減少了細菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，使AnAOB對抑制因子（如NO-2-N）更加敏感[21]，降低對高氮負(fù)荷的抵抗能力。因此，血紅素c含量下降到1.42μmol/mg pro，反應(yīng)器性能隨之降低。Zhang 等[31]和Ma 等[29]的研究也證明了血紅素c 與反應(yīng)器脫氮性能有關(guān)，血紅素c 含量越高脫氮性能越強。

圖8 4個反應(yīng)器中血紅素c濃度變化

2.4 Fe2+對AnAOB形態(tài)的影響

為了探究不同F(xiàn)e2+濃度對污泥表面形態(tài)的影響，各反應(yīng)器的SEM圖見圖9。SEM圖像能明顯觀察到顆粒表面的狀態(tài)，4個反應(yīng)器中顆粒表面都存在絲狀細菌與球菌。絲狀細菌具有支撐顆粒骨架的作用，可為微生物聚集構(gòu)建框架[32]。如圖9(a)和圖9(d)微生物表面空洞較多，部分細胞間有較大間隙，顆粒松散，不利于細菌沉降和聚集，阻礙Anammox 過程[28]，圖9(a)中此現(xiàn)象更為明顯。這一現(xiàn)象與Fe2+濃度為1.00mg/L和10.00mg/L時PN/PS值較高一致，說明了Fe2+濃度過低或過高都會對污泥結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，不利于反應(yīng)器在高氮負(fù)荷下運行。Fe2+濃度為5.00mg/L 和7.50mg/L 時，PN/PS 值降低，有利于污泥沉降和聚集。圖9(b)和圖9(c)證實了這一點，圖中顆粒表面存在緊實和致密的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，顆粒緊湊，這有利于擴大與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積，使更多的物質(zhì)被細菌吸收，加快基質(zhì)的去除速度。結(jié)合4個反應(yīng)器的脫氮性能，可見菌體表面結(jié)構(gòu)越致密，顆粒穩(wěn)定性越強，有助于污泥團聚和沉降，增強對基質(zhì)的去除能力。

圖9 污泥SEM圖

3 結(jié)論

（1）Fe2+濃度為7.50mg/L 時，EGSB 反應(yīng)器脫氮性能最強；進水TN 為302mg/L 時，TN 去除率達到84.2%。

（2）AnAOB的EPS組成和血紅素c變化趨勢與反應(yīng)器脫氮性能一致。Fe2+濃度在7.50mg/L 時，EPS 與血紅素c 達到最大值242mg/g VSS 和3.76μmol/mg pro，PN/PS 達到最小值1.10，且顆粒表面更加密實，結(jié)構(gòu)更加牢固，同時MLSS也達到最大值（737mg/L）。因此7.50mg/L 的Fe2+能增強細菌活性，促進基質(zhì)代謝，有助于抵抗高氮沖擊，反應(yīng)器性能達到最高。

（3）適宜的Fe2+進入Anammox體與細胞內(nèi)特定結(jié)構(gòu)結(jié)合，促進形成血紅素c并參與細菌代謝，保證生理活動正常進行，提高細菌活性，分泌大量EPS，吸收更多胞外養(yǎng)分，使顆粒變得更加致密，結(jié)構(gòu)更加牢固。有助于污泥團聚和沉降，保留生物量，應(yīng)對高氮負(fù)荷沖擊，最終增強反應(yīng)器脫氮能力。然而，由于Fe2+對微生物具有雙面作用，其促進/抑制Anammox 過程更加深入的作用機理仍有待研究和完善。